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Biochemistry

Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

Ici, nous partageons des méthodes pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale, un concept définissant d’Energétique nutritionnelle et fuite de protons, la principale cause d’inefficacité dans la production mitochondriale de l’ATP. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des nutriments pour aider à évaluer la fonction mitochondriale.

Abstract

La consommation d’oxygène, motif de proton force (CMR) et fuite de protons sont les mensurations de la respiration mitochondriale, ou comment bien les mitochondries sont en mesure de convertir NADH et FADH en ATP. Étant donné que les mitochondries sont également le principal site pour l’utilisation de l’oxygène et de nutriments oxydation de dioxyde de carbone et l’eau, l’efficacité avec laquelle ils utilisent de l’oxygène et produisent de l’ATP directement a trait à l’efficacité du métabolisme des nutriments, les besoins nutritionnels de l’animal, et santé de l’animal. Le but de cette méthode consiste à examiner la respiration mitochondriale, qui peut être utilisée pour examiner les effets des différents médicaments, régimes alimentaires et effets sur le métabolisme mitochondrial. Les résultats comprennent la consommation d’oxygène mesurée en respiration dépendante de proton (État 3) et la respiration de dépendant de fuite de proton (État 4). Le ratio de la respiration État 4 3 / Etat est défini comme rapport de contrôle respiratoire (RCR) et peut représenter efficacité énergétique mitochondriale. Fuite de protons mitochondriale est un procédé qui permet la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial (MMP) par découplage de la phosphorylation oxydative d’ADP, diminution de l’efficacité de la synthèse d’ATP. Oxygène et TRMP + électrodes sensibles avec mitochondriales substrats et inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons sont utilisés pour mesurer l’État 3 et 4 de l’état respiratoire, membrane mitochondriale PMF (ou susceptibles de produire de l’ATP) et fuite de protons. Limitations de cette méthode sont que le tissu hépatique doit être aussi fraîche que possible et toutes les biopsies et les essais doivent être effectuées en moins de 10 h. Cela limite le nombre d’échantillons qui peuvent être collectées et traitées par une seule personne par jour à environ 5. Cependant, seulement 1 g de tissu hépatique est nécessaire, donc dans les grands animaux, tels que les vaches laitières, la quantité d’échantillon nécessaire est faible par rapport à la taille du foie et il y a peu temps de récupération nécessaire.

Introduction

Les mitochondries sont très sensibles au stress et leur environnement cellulaire peut contribuer à une grande variété de maladies métaboliques. Consommation d’oxygène et la fuite de protons dans les mitochondries sont des indicateurs de santé de mitochondries. Les méthodes décrites dans ce document estimation mitochondrial l’efficacité énergétique à l’aide de RCR basent sur la consommation d’oxygène avec et sans fuite de protons. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des éléments nutritifs1. Changements dans la fuite de proton et de la consommation d’oxygène peuvent identifier un dysfonctionnement mitochondrial qui contribue aux maladies métaboliques et se traduit par une diminution de l’efficacité énergétique. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier l’effet des différents traitements sur la respiration mitochondriale. L’objectif général de mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale et la cinétique de fuite de proton est d’évaluer la fonction mitochondriale et efficacité énergétique.

Dysfonctionnement mitochondrial hépatique a été associé à plusieurs maladies chez les vaches laitières. La capacité du métabolisme cellulaire pour basculer entre les carburants glucidiques et lipidiques, face à un déficit énergétique en début de lactation est influencée par le nombre et la fonction des mitochondries dans la cellule2. Défauts de la capacité des mitochondries pour s’adapter à une demande accrue d’énergie et de la β-oxydation accrue peuvent entraîner une accumulation de lipides intracellulaires associés à l’insulino-résistance et peuvent conduire à la formation de foie gras chez les vaches laitières de lactation précoce. Mitochondries, comme le site de production de corps cétoniques et utilisation, peuvent jouer un rôle clé dans le ketosis chez les vaches laitières3. Absence de mitochondries ou dysfonctionnement mitochondrial aura une incidence combustibles disponibles vers la périphérie et se reflétée des changements dans la consommation d’oxygène ou RCR.

Changements de consommation d’oxygène mitochondriale en réponse à l’inflammation. Poulets de chair âgés de sept jours ont été assignés au hasard à un groupe infecté par Eimeria maxima et un groupe de contrôle4. Poulets de chair qui ne subissent pas de défi de coccidiose avaient faible consommation d’oxygène due à la fuite de protons et RCR supérieur indiquant que les mitochondries du foie répondent à une stimulation immunitaire par fuite de protons croissante. Tout en fuite de protons et réactive production d’espèces oxygénées était autrefois considéré comme un signe de dysfonctionnement de la membrane mitochondriale et préjudiciable à l’efficacité énergétique, maintenant on sait qu’il est important pour l’importation de protéines et de calcium dans les mitochondries5 et pour la génération de chaleur1.

Fuite d’électrons de la chaine respiratoire rend les mitochondries sensibles à la production d’espèces réactives de l’oxygène et les dommages oxydatifs aux protéines de la membrane mitochondriale, lipides et l’ADN mitochondrial. Comme l’âge des mitochondries, des dommages peuvent s’accumuler en particulier d’ADNmt occasionne un autre dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial6 et une plus grande susceptibilité de la vache à la maladie. Dans la pratique, de nombreux animaux d’élevage est nourris des niveaux élevés de suppléments tels que Cu, Zn et Mn pour stimuler la fonction antioxydante. Toutefois, nourrir des niveaux élevés de Cu, Zn et Mn diminue la production de lait et a augmenté la consommation d’oxygène due à proton fuite (respiration État 4)7.

Des recherches antérieures sur le rôle de la fonction mitochondriale dans l’efficacité énergétique chez les bovins a mis l’accent sur les changements dans la consommation d’oxygène mitochondriale et fuite de protons. Très peu d’études ont été publiées chez les vaches laitières et la plupart des papiers comparer l’efficacité de production sous la forme d’ingestion d’aliments résiduelle (DDR) à la fonction mitochondriale chez les bovins de boucherie. Variabilité de la respiration mitochondriale, les taux ont été examinés en mesurant l’État 3, 4 et RCR dans le foie des vaches Holstein en lactation et lactation boeuf vaches (Brangus, Angus et Hereford)8. Les chercheurs n’a pas trouvé aucune corrélation dans la respiration mitochondriale avec croissance ou traite des traits pour les bovins, mais n’a signalé une corrélation entre la respiration mitochondriale et traite des traits pour Holsteins. Dans deux études, RFI a été comparée en bovins de boucherie au taux de respiration mitochondriale (État 3, État 4 et RCR) dans le muscle mitochondries9,10. Les taux de la respiration mitochondriale ont changé en réaction à la DMI et faibles taux étaient associés à bouvillons de boeuf moins efficaces. Dans une autre étude, RFI de boeufs de hautes ou basses bulls RFI ont été comparés avec des taux de la respiration mitochondriale et la cinétique de fuite de protons entre les deux groupes de descendants11. Différences étaient attribuables à gain en confirmant la conclusion que le gain n'est pas impact la respiration mitochondriale en bovins de boucherie.

Dans cet article, une expérience examinant foie RCR en réponse à l’alimentation des bovins laitiers en lactation 3 minéraux antioxydants illustre l’utilisation de méthodes de mesure de consommation d’oxygène pendant 4 d’État et état 3 la respiration et au CMR.

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Protocol

Toutes les méthodes, protocole et études décrites ici ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Californie à Davis.

1. obtenir une biopsie du foie d’une vache laitière Holstein

Remarque : Une biopsie hépatique doit être effectuée par un vétérinaire agréé. Biopsies du foie peuvent être effectuées sur le site laitier où se trouvent les vaches. Vaches laitières en lactation peuvent continuer à être traite normalement et le lait ne doit pas être retiré de l’alimentation avant ou après la procédure. Il est recommandé qu’au moins 4 personnes sont nécessaires pour effectuer la biopsie du foie sur une vache laitière : un vétérinaire pour effectuer la biopsie, un dresseur pour s’établir à la hanche de la vache pour protéger la zone de biopsie et le vétérinaire, un technicien de laboratoire à l’extérieur de la plume de transf euh outils, de matériaux et de biopsie vers et depuis le vétérinaire de l’échantillon et maintiennent la zone propre, qui peut être à l’arrière d’un véhicule (Figure 1) et un technicien pour récupérer l’échantillon du foie et commencer l’isolation mitochondriale.

  1. Un mois avant les biopsies du foie, donner des vaches une vaccination clostridia. Créer des packs chirurgicaux par serviettes chirurgicales autoclavage, instrument de biopsie, détenteurs de bistouri et matériel chirurgical.
  2. Un jour avant la biopsie hépatique, injecter la vache avec le Ceftiofur chlorhydrate 0,044 mL/kg de poids corporel par voie sous-cutanée dans le cou. Surveiller la température de vache, l’ingestion et fécales partitions à utiliser comme point de référence pour la fonction normale.
  3. Créer des mitochondries isolement multimédia (MIM) containining 220 mM de mannitol, saccharose de 70 mM, 20 mM HEPES, EDTA 1 mM et 0,1 % (p/v) d’acide gras libre BSA, pH 7,4 à 4 ° C. Il faudra environ 30 mL par exemple.
  4. Restreindre physiquement utilisant une prise de tête avec un licol selon les besoins de la vache (Figure 2). À l’aide de la corde, attacher sa tête sur le côté gauche de la colonnette. Si nécessaire, une contention chimique (Xylazine chlorhydrate 100 mg/mL IV à 0,010-0,015 mg/kg de poids corporel) peut être utilisé.
  5. La zone de la biopsie se trouve à la droite 10 - 11ème espace intercostal (Figure 3). Dessiner une ligne droite de la droite tuber coxae et aboutissant à la pointe de l’épaule droite. Le site de la biopsie est l’intersection de cette ligne avec l’espace intercostal 10-11. Stériliser le domaine de la vache pour être biopsiées en se rasant une zone carrée de 10 cm (Figure 4). Laver la zone avec 10 % providone scrub (Figure 5) en utilisant un mouvement circulaire. Zone de pulvérisation avec une solution d’éthanol à 70 % (Figure 6). Répétition des lavages providone et éthanol.
    Remarque : Le foie est dans une position légèrement différente chez les vaches laitières de Holstein par rapport aux bovins de boucherie.
  6. Injecter localement lidocaïne 2 % HCl (10 à 15 mL) à la zone d’anesthésie de la peau et sous-jacent de muscles et du tissu conjonctif (Figure 7). Répétez les providone et les lavages de l’éthanol 70 %.
    NOTE : Les terminaisons nerveuses sont dans la peau et le muscle, mais pas viscères, ainsi qu’un local anesthestic est nécessaire. Tout au plus, la vache doit seulement se sentir peu de pression et pas de douleur au cours de la procédure de biopsie.
  7. Faire une coup de poignard-incision de 1 à 2 cm à travers la peau de l’espace intercostal 10-11 (Figure 8). Passer un instrument de biopsie hépatique bovine Schackelford-Courtney à travers la peau et directe de l’instrument de biopsie dans un sens crânien léger tout en continuant à travers le diaphragme et le foie (Figure 9, Figure 10). Obtenir un échantillon de 1 g du foie et retirer l’instrument (Figure 11). Fermer la peau avec le placement de suture (Figure 12).
  8. Mettre l’échantillon du foie dans un tube à fond conique avec assez MIM pour couvrir l’échantillon, sur la glace pour l’isolement immédiat de mitochondries
  9. Cocher en cas de toute rougeur, gonflement, chaleur, ou la douleur dans les 24 heures de la biopsie et injecter la vache avec le Ceftiofur chlorhydrate 0,044 mL/kg de poids corporel par voie sous-cutanée dans le cou une fois par jour pour les 3 prochains jours (Figure 13). Surveiller la température de la vache, l’ingestion et scores fécales par jour pendant 1 semaine après une biopsie du foie. Si une fièvre apparaît, continuer les antibiotiques à la discrétion du vétérinaire.
    Remarque : Si une vache est présentant des signes de douleur, tels que les coups de pied dans le site d’incision, recumbancy, rougeur, chaleur ou réaction à toucher moins de 1 h après la biopsie du foie, une injection de IV 1 mg/kg de poids corporel de flunixine méglumine peut servir à soulager la douleur et l’inflammation. Une deuxième injection peut être administrée si nécessaire.
  10. Enlever les sutures 7 jours après la biopsie.

2. isoler les mitochondries du foie de la vache laitière

  1. Dès que possible après que l’échantillon du foie est prélevé à la vache, laver l’échantillon du foie en MIM (étape 1.3) pour enlever les globules rouges et émincer finement l’échantillon avec des ciseaux. Le foie doit être haché dans un bêcher réfrigéré contenant assez milieux d’isolement pour garder le tissu humide.
  2. Placez le foie haché dans un flacon en verre 30 mL avec un pilon de téflon de 0,16 mm dégagement incubés dans la glace et contenant du MIM (1:4 p/v).
  3. Homogénéiser l’échantillon du foie au pilon de téflon à 500 tr/min pour un min avec 4 coups/min.
    Remarque : L’homogénat de foie est conservée dans un bécher sous glace en MIM durant tout le processus et toutes les étapes de centrifugation suivantes soient terminées à 4 ° C
  4. Centrifuger l’homogénat à 500 x g pendant 10 min, jeter pellet, transférer le surnageant dans un tube à centrifuger réfrigérés et puis centrifuger le surnageant obtenu à 10 000 g pendant 10 min obtenir le culot mitochondrial.
  5. Resuspendre et laver le culot dans 10 mL de MIM avec les acides gras libres BSA et centrifuger à 8100 x g pendant 10 min. jetez surnageant.
  6. Resuspendre et laver le culot dans 10 mL de MIM sans acide gras libre BSA et centrifuger à 8100 x g pendant 10 min. jetez surnageant.
  7. Suspendre le culot dans 200 µL de milieux d’isolement et le placer sur la glace jusqu'à ce qu’utilisé pour la consommation d’oxygène et analyses cinétiques de fuite proton.
  8. Déterminer la concentration de la protéine de la suspension de pellet (dilution 1/100) utilise Bicinchoninic acide (BCA) ensemble selon le protocole du fabricant avec BSA comme la norme. Toutes les protéines est considérée comme une protéine mitochondriale.

3. mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale (État 4 3 et de l’État)

  1. Créer un support de consommation d’oxygène (OCM) de 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes et 1 mM EGTA, pH 7,4 à 30 ° C avec 0,3 % dégraissés BSA. Il faudra environ 3 mL par exemple. Aussi préparer une solution de 8 μg/mL oligomycine dans l’éthanol.
  2. Incuber les OCM à 30 ° C. Mis en place une électrode chambre, pompe et l’oxygène de la respiration selon les instructions du fabricant (système oxygraph). Le logiciel d’oxygraph devrait déjà être installé sur l’ordinateur.
  3. Placer 1 mL de l’OCM dans la chambre de respiration et remuez vigoureusement. Cela aidera à assurer que la solution devient saturée avec de l’air.
  4. Ajouter 0,35 mg de protéine des protéines mitochondriales à la chambre de respiration et de maintenir la température à 30 ° C.
  5. Enregistrer la consommation d’oxygène pendant environ 5 min. La concentration en oxygène oxygraph système dossiers alors que la respiration augmente, la concentration en oxygène diminue. Lorsque la consommation d’oxygène devient constante (une ligne droite décroissante), consommation d’oxygène record (pente de la droite = concentration d’oxygène/heure). Il s’agit de la consommation d’oxygène de base.
  6. Ajouter 1,25 µL de solution de roténone 4 mM pour inhiber complexe je puis ajouter 5 µL de solution de succinate de 1 M pour atteindre une concentration finale dans la chambre respiratoire du succinate de 5 mM. Il s’agit de la respiration État 4.
  7. Ajouter 1 µL de solution ADP 100 mM pour atteindre une concentration finale dans la chambre de respiration de 100 μM. Concentration d’oxygène va diminuer (une augmentation de la respiration), puis après environ 5 min devient une ligne droite. Enregistrer la consommation d’oxygène (pente de la droite = concentration d’oxygène/heure). Il s’agit d’État 3 la respiration.
  8. En option : À la fin de l’exécution, ajoutez FCCP (volume total de 0,2 μM) pour induire la respiration maximale. Enregistrer la respiration pendant environ 5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne. Il s’agit de la consommation maximale d’oxygène.
  9. Calculer le Ratio de contrôle respiratoire (RCR) à l’aide de l’équation de consommation d’oxygène État 3 / 4 la consommation d’oxygène d’État.
  10. Aspirer toutes les solutions de la chambre de respiration. Rincer la chambre plusieurs fois avec de l’eau désionisée double.

4. mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial (MMP) et Force motrice de Proton (PMF)

  1. Préparer la solution de 80 nigéricine ng/mL dans de l’éthanol.
    Remarque : Ces substances chimiques sont dissous dans l’éthanol, et tout doit être fait pour limiter la quantité d’éthanol qui est ajouté au moins 1 μL, étant donné que l’éthanol peut dételer le système de transport d’électrons et risquez d’être mitchondrial.
  2. Après rincer abondamment la chambre avec de l’eau désionisée double, placer 1 mL de l’OCM dans la chambre de respiration et remuer vigoureusement avec une barre magnétique remuer. Cela aidera à assurer que la solution devient saturée avec de l’air. Ajouter méthyl-triphényl-phosphonium (PGEF +) sensible électrode pour le programme d’installation de la chambre. PGEF + électrode doit être raccordé à un pH-mètre et valeurs sont lues à partir du pH-mètre.
  3. Ajouter 0,35 mg de protéines mitochondriales à la chambre de respiration.
  4. Ajouter 1,25 ml de solution de roténone 4 mM pour inhiber la respiration complexe I. dossier pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.
  5. Ajouter 0.56 μL de 8 μg/mL de solution de l’oligomycine pour une concentration finale de 2,8 µg oligomycine 0,35 mg de protéine mitochondriale pour inhiber l’utilisation de l’ADP. Enregistrer la respiration pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.
  6. Ajouter 0,112 μL 80 ng/mL de solution de nigéricine pour abolir le gradient de pH à travers la membrane mitochondriale interne. Enregistrer la respiration pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.
    Remarque : La roténone et l’oligomycine servent à bloquer le transport des électrons chain au complexe I et l ' ATP synthase, respectivement. Nigéricine est ajouté pour convertir un gradient de K + qui peut être mesuré avec une électrode de gradient transmembranaire de H +.
  7. Préparer une courbe d’étalonnage pour PGEF + en ajoutant 5 µL de solution PGEF + 10 mM à l’incubation mitochondriale. Répétez cette opération quatre fois plus, jusqu'à ce qu’une concentration totale de 2,5 μM PGEF + a été ajoutée.
  8. Initier la respiration en ajoutant 5 μL de succinate de 1M à la chambre.
  9. Enregistrer la respiration jusqu'à ce que vous avez réalisé une trace stable, et puis titrer le système en ajoutant le malonate. Ajouts de malonate devraient être 0,5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3,0 µL, µL 6.0, 9.0 µL, puis 12,5 µL de 0,1 mM Malonate solution pour réaliser des ajouts successifs des concentrations de malonate dans la chambre d’incubation de 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1,2, 1,8 et 2,5 mM.
  10. Collecter les données des deux électrodes (oxygène et PGEF+). Logiciel d’acquisition de données provenant du système d’oxygraph permet de collecter des mesures simultanées de la consommation d’oxygène mitochondriale et le potentiel de membrane mitochondrial et observer les changements dans la consommation d’oxygène en temps réel. La figure 14 montre comment le système d’oxygraph enregistre la consommation d’oxygène en cours de l’expérience.
  11. Calculer les MMP dans mV basé sur l’équation de Nernst :
    MMP = 61,5 log ([PGEF +] ajouté – externe [PGEF +]) correction de liaison x TPMP+ / (x 0,001 mg de protéine/mL x [PGEF +])
    Une correction de liaison PGEF + 0,4 µL/mg de protéine mitochondriale-1 est utilisée.
    Exemple de calcul basé sur les concentrations dans le protocole :
    MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg protéine mitochondriale/mL x 2 µM)
    MMP = 198,9 mV
  12. Estimation PMF en traçant un graphique des MMP contre la consommation d’oxygène (Figure 15). CMR est signalée comme la consommation d’oxygène à un potentiel de membrane de 165 mV.
    NOTE : Titrage de la chaîne de transport d’électrons avec le malonate (0,1 à 2,5 mM) montre la réaction cinétique de fuite de protons de MMP. Alors, complot MMP contre la consommation d’oxygène détermine cinétique de fuite de protons. CMR est déterminée en calculant la consommation d’oxygène à un potentiel de membrane commune (165 mV).
  13. À la fin de la dernière exécution de l’exemple, ajouter FCCP (volume total de 0,2 μM) pour induire la respiration maximale et libérer PGEF + pour la correction de la ligne de base.
  14. Aspirer toutes les solutions de la chambre de respiration. Rincer la chambre plusieurs fois avec de l’eau désionisée double. À la fin de la journée, la chambre devrait également être rincée plusieurs fois avec de l’éthanol.

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Representative Results

Résultats positifs cinétique de fuite RCR et proton sont indiquées dans le tableau 1 et Figure 15, respectivement. Dans cette fuite de protéines, RCR et7étude cinétique ont été mesurés chez les vaches laitières Holstein à 70 jours dans le lait après les vaches avaient été nourries avec 1 de 5 différents niveaux de Cu, Zn et Mn pendant 28 jours. État 4, respiration de proton maximale de fuite-dépendante, avait tendance à être touchés par l’apport minéral de Cu, Mn et Zn (p < 0,1). État 3 la respiration (ATP maximale stimulée par la respiration) et RCR = État 3 / 4 de l’État (ratio de contrôle respiratoire) n’est pas affectée par l’apport minéral. La respiration État 4 était plus élevée dans le LowMn et le plus bas dans le contrôle, ce qui indique que Mn joue un rôle important en réduisant au minimum la respiration dépendante de proton fuite. Manganèse, par l’intermédiaire de l’enzyme superoxyde Dismutase de Mn est connue pour réduire les espèces réactives de l’oxygène dans la matrice mitochondriale et proton fuite12. La respiration 4 État plus élevée était associée à lait inférieur et la production de protéines de lait. Fuite de protons étant une composante importante de l’efficacité énergétique, réduire l’État 4 respirer à travers la supplémentation Mn pourrait améliorer l’efficacité.

Soins1
Haute Med Faible LowMn Contrôle SEM
Lait, kg 47,4ab 50,9un 46,0ab 43.6b 49,7un 2.9
Protéines de lait, kg 1.38ab 1.44un 1.40ab 1.23b 1.43une 0,09
État 3 75,8 64,4 78.2 73 64.1 13
État 4 26.2ab 22,6ab 25,9ab 27.1a 22,0b 3
RCR 2.89 2,76 2,98 2.65 2,83 0,27
a et b Moyen d’une ligne non suivie par la même lettre exposant est significativement différentes (P < 0,1).
1 traitement haute contient des niveaux plus élevés de Cu, Zn et Mn tous bien au-dessus des exigences13, contient des niveaux intermédiaires de Cu, Zn et Mn au-dessus des exigences de traitement Med, faible traitement contient des niveaux inférieurs de Cu, Zn et Mn mais toujours au-dessus exigences, traitement faible Mn contient les niveaux les plus bas du Mn (et des niveaux inférieurs de Cu et de Zn), mais toujours au-dessus de prescriptions et de contrôle contient les niveaux les plus bas du cuivre et du zinc, qui sont proches des exigences de traitement.

Tableau 1: effet de Cu, Mn et Zn supplémentation sur la production d’oxygène mitochondriale du foie consommation et le lait de vaches laitières à 70 jours dans le lait. Ce tableau a été adapté de Acetoze et coll. 20177.

Fuite de protons mitochondriale est un processus qui se dissipe MMP à travers le mouvement des protons à travers la membrane mitochondriale interne sans production d’ATP14. Cinétique de fuite de protons sont évalués par le calcul du taux de consommation d’oxygène à un potentiel de membrane commune de 165 mV. Un potentiel de membrane plus faible signifie que les protons sont « fuite » à travers la membrane mitochondriale, aboutissant à la synthèse d’ATP inférieure (Figure 15). Dans l’étude de la vache Holstein, respiration dépendante de fuite proton hépatique est plus importante en LowMn et plus bas dans le contrôle, ce qui concorde avec les résultats dans le tableau 1, que la respiration 4 État était plus LowMn et plus bas dans le contrôle.

Figure 15
Figure 15. Cinétique de fuite du proton en vaches Holstein nourries des quantités différentes de Cu, Mn et Zn. Ce graphique repose sur les données de Acetoze al 20177. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Des résultats négatifs sont illustrées dans le tableau 2 et la Figure 16. Indice de consommation (RFI) était plus élevée chez les boeufs Angus nés de faibles bulls RFI que les taureaux RFI élevée, mais cela n’est pas reflété dans les mitochondries RCR (tableau 2) ou cinétique de fuite de protons (Figure 16). Il n’y a aucune différence dans la respiration mitochondriale et la cinétique de fuite de protons entre groupes de boeufs, mais il y avait une différence de RFI. Il n’y a également aucune différence (p = 0,88) en proton mitochondriale hépatique fuite dans la haute et basse bouvillons RFI (Figure 16). Il y avait de grandes erreurs-types associées à des mesures de la respiration mitochondriale et courbes cinétique de fuite proton ont stagné. Des échantillons de foie de cette étude ont été obtenus après les boeufs ont été abattus, un processus qui a retardé le prélèvement du foie et la transformation d’une heure. Variation des mesures de la respiration mitochondriale peut refléter la dégradation de la respiration mitochondriale en raison de la mort des tissus. Cinétiques lignes de fuite proton sont demeurés parce que la mesure de la consommation d’oxygène ne commence pas avant 8 min lorsque le plateau était déjà intervenu en raison d’une défectuosité de l’équipement.

Faible RFI Haute RFI SEM Valeur P
(n = 7) (n = 8)
RFI -0,58 -0,01 0,1 0.05
État 3 31.3 30,8 9.42 0,9
État 4 9,76 10.4 3.23 0,8
RCR 3.05 3.03 0,24 0,93

Tableau 2: Performance et la respiration mitochondriale de haute et basse résiduelle se nourrissent d’admission (RFI) Angus Bull. progéniture. Ce tableau a été adapté de Acetoze et coll. 201511.

Figure 16
Figure 16. Cinétique de fuite proton pour la descendance des taureaux Angus RFI haute et basse. Ce graphique a été adapté de Acetoze et coll. 201511. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 1
Figure 1: nettoyer la zone pour chirurgie et biopsie matériaux situés à l’arrière d’un véhicule en dehors de la plume de vache. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: retenue de la vache à l’aide d’un licol attaché à un poteau de croix de la serrure principale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: la zone de la vache de nettoyage pour la biopsie et l’emplacement de la biopsie à l’espace intercostal de droit 10 - 11, trouvé en traçant une ligne droite de la droite tuber coxae et aboutissant à la pointe de l’épaule droite. Le site de la biopsie est l’intersection de cette ligne avec l’espace intercostal 10-11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: raser une zone de 10 cm de la vache à se préparer à stériliser pour la biopsie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Lavez la région de biopsie de la vache avec gommage providone de 10 % en utilisant un mouvement circulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
La figure 6. Vaporiser une région biopsie avec la solution d’éthanol à 70 %. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: injecter localement de lidocaïne 2 % HCl (10 à 15 mL) à la zone d’anesthésie de la peau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: une stab-incision de 1 à 2 cm à travers la peau de l’espace intercostal 10-11ème à insérer l’outil de la biopsie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9: Insertion de l’instrument de biopsie hépatique bovine à travers la peau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10: l’instrument de biopsie doit être adressée dans un sens crânien léger tout en continuant à travers le diaphragme et le foie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11: un échantillon de 1 g du foie déplacé d’instrument de biopsie au tube de Falconer pour le transport jusqu'à la station d’isolement mitochondriale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12: suture de la peau pour refermer l’incision de la biopsie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 13
Figure 13: Injection de la vache avec le Ceftiofur chlorhydrate 0,044 mL/kg de poids corporel par voie sous-cutanée dans le cou. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 14
Figure 14: Oxygraph logiciel résultats oxygène réponses de consommation à l’addition de chaque substance pour mesurer le potentiel de membrane mitochondrial (MMP) et le proton mobile force (PMF). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le point le plus critique dans le protocole est obtenir un échantillon représentatif de tissu hépatique et commence l’isolation des mitochondries dès que possible après la biopsie. Variations dans les mesures de la respiration sont faible (tableau 1) en raison d’un temps de transport court de vache au laboratoire. Afin de réduire les temps de transport, un petit laboratoire a été mis en place dans le Bureau de la laiterie, et échantillons de foie ont été chassés au laboratoire du bureau comme chacun ont été recueillie afin que les mitochondries ont été isolées dans les 10 min de la biopsie. Le programme d’installation et les essais de la chambre de la respiration et les électrodes (oxygène, PGEF +) avec le pH-mètre utilisé pour enregistrer des différences dans les gradients de proton la veille de la collecte et le traitement des échantillons peuvent éviter des dysfonctionnements tels que manque des mesures précoces en fuite de protons cinétique (Figure 16).

En raison de la nécessité pour les échantillons de foie frais et isolation rapide des mitochondries, le nombre d’échantillons qui peuvent être collectées et traitées par jour est limité. Chaque échantillon prend environ 5-6 h pour terminer ; par conséquent, seulement environ 5 échantillons par jour soient collectées et analysées par la chambre de respiration. Ce n’est pas une méthode de haut débit ; la taille de l’échantillon pour les traitements est limitée et les petites erreurs peuvent augmenter la variabilité associée à des résultats et la capacité à détecter la signification.

La technique d’isolation peut exclure certaines mitochondries qui sont associées à certains composants de la cellule et qui restent incorporés dans le culot ou mitochondries plus petites peuvent être perdues dans les lavages de granulés durant les étapes de centrifugation. Cela peut conduire à des résultats qui ne reflètent pas la population complète des mitochondries. Mitochondries peuvent changer de taille et de densité selon les États physiologiques comme la faim et exercer (formation)15. Estimation du nombre de mitochondries avec l’activité enzymatique à l’aide de citrate synthase16 ou succinate déshydrogénase17 pour corroborer les conclusions peut-être être nécessaires.

Sans modifications ont été apportées aux techniques originales établies chez les rongeurs pour isolement mitochondrial18,19 de la respiration et proton fuite cinétique20. Modifications à cette technique peuvent être effectuées selon la source de tissu des mitochondries et des traitements expérimentaux. BSA (dégraissé) est utilisé pour lier des acides gras libres dans les tissus. Si le tissu a beaucoup d’acides gras (plus de 10 %) qui lui sont associés, plus dégraissé BSA peut être ajouté car les acides gras libres interférerait avec les mesures mitochondriales.

Mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale et la cinétique de fuite de proton à l’aide de cette technique est la procédure standard. Foie a été le tissu de choix, principalement parce qu’il a un grand nombre de mitochondries, elles sont assez faciles à extraire et le foie est le principal site de transformation des éléments nutritifs. Modifications de cette technique ont été utilisées pour mesurer la consommation d’oxygène dans d’autres tissus comme les muscles et glandes mammaires. Cependant, techniques d’isolation mitochondriale doivent être modifiés pour s’adapter à du tissu. Par exemple, dans le muscle, les mitochondries sont incorporés dans les fibres musculaires et donc la technique d’isolation doit inclure une digestion des protéines et la digestion doivent être contrôlées afin de s’assurer que la fonction mitochondriale n’est pas perturbée.

Il existe d’autres méthodes pour mesurer la respiration mitochondriale qui nécessitent un analyseur spécifiquement conçu pour mesurer la respiration. Les cellules doivent être récoltées à partir des tissus et fixés aux plaques d’incubation. Le taux de consommation de l’oxygène d’analyseur mesures à germes entiers (OCR ; basale), ATP lié OCR (associés aux mitochondries) et nonmitochondrial OCR OCR maximale. Toutefois, étant donné que les mitochondries sont inhibées pendant une partie de l’incubation, les mitochondries isolées des mesures ne sont pas possibles. Cette méthode a servi à analyser les changements d’OCR avec maladie et médicaments interventions21 chez l’homme.

Applications actuelles et futures

La contribution de la fuite de protons aux besoins en énergie de l’animal peut être grand et révélateur de l’état physiologique de l’animal dont la croissance, la lactation et la maladie. Dans le passé, cette technique a servi principalement à examiner l’association de la consommation d’oxygène mitochondriale et la contribution de fuite de protons pour se nourrir ou de l’efficacité énergétique. Cependant, pendant que notre compréhension du rôle des mitochondries dans le métabolisme augmente, l’importance de cette technique permettra également d’augmenter surtout en combinaison avec d’autres mesures mitochondriales comme les activités enzymatiques de la chaîne de Transport d’électron, calcium dynamique dans l’apoptose et les activités enzymatiques du cycle TCA.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par Alltech et USDA Hatch des fonds du centre santé animale de nourriture à UC Davis School of Veterinary Medicine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

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References

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Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein
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Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

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