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Biochemistry

Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

Qui, si condividono i metodi di misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale, un concetto di definizione di energetica nutrizionale e perdita di protone, la causa primaria di inefficienza nella generazione mitocondriale di ATP. Questi risultati possono rappresentare 30% di energia perdita nell'utilizzazione dei nutrienti per aiutare a valutare la funzione mitocondriale.

Abstract

Consumo di ossigeno, (PMF) della forza motrice protonica e perdita del protone sono misurazioni di respirazione mitocondriale, o quanto bene i mitocondri sono in grado di convertire NADH e FADH in ATP. Poiché i mitocondri sono anche il luogo primario per l'uso di ossigeno e nutrienti ossidazione ad anidride carbonica e acqua, quanto efficientemente usano ossigeno e produrre ATP direttamente riguarda l'efficienza del metabolismo dei nutrienti, esigenze nutrizionali dell'animale, e salute dell'animale. Lo scopo di questo metodo è quello di esaminare la respirazione mitocondriale, che può essere utilizzata per esaminare gli effetti di diversi farmaci, le diete e gli effetti ambientali sul metabolismo mitocondriale. I risultati includono consumo di ossigeno misurato come respirazione dipendente protone (stato 3) e protone perdita dipendente respirazione (stato 4). Il rapporto della respirazione 4 3 / stato stato è definito come rapporto di controllo respiratorio (RCR) e può rappresentare l'efficienza energetica mitocondriale. Perdita di mitocondriale del protone è un processo che permette la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP) da disgiungere fosforilazione ossidativa da ADP diminuendo l'efficienza della sintesi di ATP. Ossigeno e TRMP + elettrodi sensibili con substrati mitocondriali e inibitori della catena di trasporto degli elettroni sono utilizzati per misurare State 3 e 4 di stato respirazione, membrana mitocondriale PMF (o il potenziale di produrre l'ATP) e perdita del protone. Limitazioni a questo metodo sono che il tessuto del fegato deve essere più fresco possibile e tutte le biopsie e le analisi devono essere eseguite in meno di 10 ore. Questo limita il numero di campioni che possono essere raccolti ed elaborati da una sola persona in un giorno per circa 5. Tuttavia, è necessario solo 1 g di tessuto del fegato, quindi in grandi animali, come bovini da latte, la quantità di campione necessaria è piccola rispetto alle dimensioni del fegato e c'è poco tempo di recupero necessario.

Introduction

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I mitocondri sono molto sensibili allo stress e loro ambiente cellulare può contribuire a una vasta gamma di malattie metaboliche. Consumo di ossigeno e perdita di protoni in mitocondri sono indicatori della salute di mitocondri. I metodi descritti in questa efficienza energetica mitocondriale di carta stima utilizzando RCR basano sul consumo di ossigeno con e senza perdita di protoni. Questi risultati possono rappresentare 30% dell'energia perdita in utilizzazione nutriente1. Cambiamenti nella perdita del protone e consumo di ossigeno possono identificare la disfunzione mitocondriale che contribuisce alla malattia metabolica e si traduce in una riduzione dell'efficienza energetica. Questi metodi possono essere utilizzati anche per esaminare l'effetto di trattamenti diversi su respirazione mitocondriale. L'obiettivo generale di misurare il consumo di ossigeno mitocondriale e cinetica di perdita del protone è di valutare la funzione mitocondriale ed efficienza energetica.

Disfunzione mitocondriale epatica è stata associata con parecchie malattie nei bovini da latte. La capacità del metabolismo cellulare per passare tra combustibili del carboidrato e del lipido di fronte a un deficit energetico in lattazione iniziale è influenzata dal numero e dalla funzione dei mitocondri in cellule2. Difetti nella capacità di adattarsi a un aumento della domanda di energia e β-ossidazione aumentata dei mitocondri possono portare ad accumulo di lipidi intracellulari associati con insulino-resistenza e possono portare alla formazione di fegato grasso nelle vacche da latte di inizio lattazione. I mitocondri, come il sito di produzione di corpi chetonici e l'uso, possono giocare un ruolo chiave in chetosi nelle vacche da latte3. Una mancanza di mitocondri o disfunzione mitocondriale urterà la disponibilità di carburante alla periferia e rifletteva in variazioni di consumo di ossigeno o RCR.

Modifiche di consumo di ossigeno mitocondriale in risposta ad infiammazione. Sette-giorno-vecchio polli da carne sono stati assegnati a un gruppo infettato da Eimeria maxima e un gruppo di controllo4. Polli da carne che non subissero sfida coccidiosi aveva più basso consumo di ossigeno a causa di perdita di protone e RCR superiore che indica che i mitocondri del fegato rispondano ad una sfida immune da crescente perdita di protoni. Durante la perdita di protone e reattiva produzione di specie di ossigeno una volta era considerata un segno di disfunzione mitocondriale della membrana e dannosa per l'efficienza energetica, ora è conosciuto che è importante per l'importazione di proteine e di calcio in mitocondri5 e per la generazione di calore1.

Perdita di elettroni dalla catena respiratoria rende i mitocondri suscettibile di produzione di specie reattive dell'ossigeno ed il danno ossidativo alle proteine della membrana mitocondriale, lipidi e DNA mitocondriale. Come età di mitocondri, danno può accumularsi soprattutto al mtDNA causando ulteriore disfunzione nel metabolismo mitocondriale6 e una maggiore suscettibilità della mucca alla malattia. In pratica, molti animali da allevamento sono alimentati alti livelli di integratori come Cu, Zn e Mn per amplificare la funzione antiossidante. Tuttavia, d'alimentazione alti livelli di Cu, Zn e Mn diminuita produzione di latte e aumento del consumo di ossigeno a causa di protone perdita (stato 4 respirazione)7.

Precedenti ricerche sul ruolo della funzione mitocondriale dell'efficienza energetica nei bovini è focalizzata sui cambiamenti nel consumo di ossigeno mitocondriale e perdita di protoni. Molto pochi studi sono stati pubblicati nei bovini da latte e la maggior parte delle carte confrontare l'efficienza di produzione sotto forma di assunzione di mangime residuo (RFI) per la funzione mitocondriale in bovini da carne. Variabilità nella respirazione mitocondriale tariffe sono state esaminate misurando stato 3 4 e RCR in fegati da vacche Holstein in lattazione e allattamento manzo mucche (Angus, Hereford and Brangus)8. I ricercatori non hanno trovato alcuna correlazione nella respirazione mitocondriale con crescita o mungitura tratti per bovini da carne, ma hanno dato una correlazione tra la respirazione mitocondriale e tratti per Holsteins di mungitura. In due studi, RFI è stato confrontato in bovini da carne a tasso di respirazione mitocondriale (stato 3, stato 4 e RCR) nel muscolo mitocondri9,10. Tassi di respirazione mitocondriale ha cambiato in risposta a DMI e tassi bassi sono stati associati con meno efficiente manzo manzi. In un altro studio, RFI di manzi da tori RFI alte o basse sono stati confrontati con i tassi di respirazione mitocondriale e cinetica di perdita del protone fra i due gruppi di progenie11. Le differenze erano dovuto guadagno conferma la conclusione che guadagno fa non respirazione mitocondriale di impatto nei bovini da carne.

In questa carta, un esperimento esame fegato RCR in risposta all'alimentazione 3 minerali antiossidanti per bovini da latte durante l'allattamento viene illustrato l'utilizzo di metodi per misurare il consumo di ossigeno durante stato 4 e stato 3 PMF e respirazione.

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Protocol

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Tutti i metodi, protocollo e studi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California, Davis.

1. ottenere una biopsia del fegato da una mucca da latte dell'Holstein

Nota: Una biopsia del fegato deve essere eseguita da un veterinario autorizzato. Le biopsie del fegato possono essere eseguite sul sito latteria dove si trovano le mucche. Vacche da latte in lattazione possono continuare a essere munte normalmente e latte non deve necessariamente essere ritirata dall'approvvigionamento di cibo, prima o dopo la procedura. È consigliabile che almeno 4 persone sono necessari per eseguire la biopsia del fegato su una mucca da latte: un veterinario per eseguire la biopsia, un gestore di animale a stare a fianco della mucca per proteggere la zona di biopsia e veterinario, un tecnico di laboratorio all'esterno della penna per trasf er di strumenti, materiali e biopsia del campione da e per il veterinario e mantenere la zona pulita, che può essere nella parte posteriore di un veicolo (Figura 1) e un tecnico per recuperare il campione epatico e iniziare isolamento mitocondriale.

  1. Un mese prima le biopsie del fegato, dare le mucche una vaccinazione di clostridi. Creare pacchetti di chirurgiche di asciugamani chirurgico di sterilizzazione in autoclave, strumento di biopsia, titolari di bisturi e apparecchiature chirurgiche.
  2. Un giorno prima della biopsia del fegato, iniettare la mucca con Ceftiofur cloridrato 0,044 mL/kg di peso corporeo per via sottocutanea nel collo. Monitorare la temperatura della mucca, assunzione e fecali punteggi da utilizzare come base per la funzione normale.
  3. Creare i mitocondri isolamento media (MIM) contenenti 220 mM mannitolo, saccarosio 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA e 0,1% (p/v) dell'acido grasso libero BSA, a pH 7,4 a 4 ° C. Saranno necessari circa 30 mL per campione.
  4. Trattenga mucca fisicamente utilizzando un headlock con una cavezza come necessario (Figura 2). Usando la cavezza, legare la testa sul lato sinistro del tubo portante. Se necessario, un sistema di ritenuta chimica (xilazina cloridrato 100 mg/mL IV a 0,010-0,015 mg/kg di peso corporeo) può essere utilizzato.
  5. L'area della biopsia si trova presso lo spazio intercostale di destra 10 - 11 (Figura 3). Disegnare una linea retta da coxae di tubero giusto al punto della spalla destra. Il sito di biopsia è dove questa linea si interseca con il 10-11 ° spazio intercostale. Sterilizzare la zona della mucca per essere sottoposte a biopsia di rasatura un'area quadrata di 10 cm (Figura 4). Lavare la zona con 10% providone scrub (Figura 5) con un movimento circolare. Nebulizzare con soluzione di etanolo 70% (Figura 6). Ripetere lavaggi providone ed etanolo.
    Nota: Il fegato è in una posizione leggermente diversa nel bovino da latte Holstein rispetto ai bovini da carne.
  6. Iniettare lidocaina 2% HCl (10-15 mL) localmente nella zona per fornire l'anestesia della pelle e del muscolo sottostante e del tessuto connettivo (Figura 7). Ripetere providone e lavaggi di etanolo 70%.
    Nota: Le terminazioni nervose sono in pelle e muscoli, ma non interni organi, così solo un locale anesthestic sono necessario. Al massimo, la mucca dovrebbe sentire solo un po' di pressione e nessun dolore durante la procedura di biopsia.
  7. Fare un'incisione di 1-2 cm attraverso la pelle dello spazio intercostale 10-11 (Figura 8). Passare uno strumento di biopsia del fegato bovino Schackelford-Courtney attraverso la pelle e diretto strumento di biopsia in senso craniale leggero pur continuando attraverso il diaframma e nel fegato (Figura 9, Figura 10). Ottenere un campione di 1 g di fegato e rimuovere lo strumento (Figura 11). Chiudere la pelle con posizionamento della sutura (Figura 12).
  8. Fegato di collocare il campione in una provetta conica con abbastanza MIM per coprire il campione, il ghiaccio per l'isolamento dei mitocondri immediato
  9. Incisione di controllo per qualsiasi arrossamento, gonfiore, calore, o dolore entro 24 ore dalla biopsia e iniettare la mucca con Ceftiofur cloridrato 0,044 mL/kg di peso corporeo per via sottocutanea nel collo una volta al giorno per i prossimi 3 giorni (Figura 13). Monitorare quotidianamente la mucca temperatura, assunzione e punteggi fecale per 1 settimana dopo la biopsia del fegato. Se si sviluppa una febbre, è possibile continuare gli antibiotici a discrezione del veterinario.
    Nota: Se una mucca è che presentino segni di dolore, come calci presso il sito di incisione, recumbancy, arrossamento, calore o reazione al tatto entro 1 h dopo la biopsia del fegato, un'iniezione di IV 1 mg/kg di peso corporeo di flunixin meglumine può essere utilizzato per alleviare il dolore e l'infiammazione. Una seconda iniezione può essere somministrata se necessario.
  10. Rimuovere le suture 7 giorni dopo la biopsia.

2. isolare i mitocondri da fegato di mucca da latte

  1. Appena possibile dopo l'esempio del fegato è stato rimosso dalla mucca, lavare il campione epatico in MIM (punto 1.3) per rimuovere le cellule di anima rosse e tritare finemente il campione con le forbici. Il fegato deve essere tritato in un bicchiere ghiacciato contenente sufficiente supporto di isolamento per mantenere il tessuto umido.
  2. Inserire il fegato tritato in un flaconcino di vetro di 30ml con un pestello di teflon della clearance di 0.16 mm incubati in ghiaccio e contenente MIM (1:4 w/v).
  3. Omogeneizzare il campione epatico nel pestello teflon a 500 giri/min per un min con 4 colpi/min.
    Nota: L'omogenati di fegato sono mantenuto in un becher da ghiaccio-pranzo in MIM durante l'intero processo, e tutti i seguenti passaggi di centrifugazione sono stati completati a 4 ° C
  4. Centrifugare omogeneato a 500 x g per 10 min, scartare pellet, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga refrigerata e poi Centrifugare il surnatante risultante a 10.000 x g per 10 min ottenere il pellet mitocondriale.
  5. Risospendere e lavare la pallina in 10 mL di MIM con acido grasso libero BSA e centrifugare a 8100 x g per 10 min. Discard surnatante.
  6. Risospendere e lavare la pallina in 10 mL di MIM senza acido grasso libero BSA e centrifugare a 8100 x g per 10 min. Discard surnatante.
  7. Sospendere il pellet in 200 µ l di media di isolamento e metterli su ghiaccio fino a quando non utilizzato per il consumo di ossigeno e test di cinetica enzimatica perdita del protone.
  8. Determinare la concentrazione nella proteina della sospensione della pallina (diluizione 1/100) utilizzando il kit di (BCA) acido bicinconinico secondo il protocollo del produttore con BSA come standard. Tutte le proteine sono considerata proteina mitocondriale.

3. misurare il consumo di ossigeno mitocondriale (stato 4 3 e statali)

  1. Creare supporti di consumo di ossigeno (OCM) da 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA, pH 7,4 a 30 ° C con 0.3% disoleate BSA. Saranno necessari circa 3 mL per campione. Anche preparare una soluzione di 8 μg/mL oligomycin in etanolo.
  2. Incubare OCM a 30 ° C. Impostare elettrodo di camera, pompa e ossigeno di respirazione secondo le indicazioni del produttore (sistema oxygraph). Il software di oxygraph dovrebbe già essere installato sul computer.
  3. Posizionare 1 mL di OCM nella camera di respirazione e mescolare energicamente. Questo vi aiuterà a garantire che la soluzione diventa saturo di aria.
  4. Aggiungere una proteina 0,35 mg di proteina mitocondriale alla camera di respirazione e mantenere la temperatura a 30 ° C.
  5. Registrare il consumo di ossigeno per circa 5 min. La concentrazione di ossigeno oxygraph record di sistema così come aumenti di respirazione, concentrazione di ossigeno diminuisce. Quando il consumo di ossigeno diventa costante (una linea retta decrescente), consumo di ossigeno record (pendenza della retta = concentrazione di ossigeno/ora). Si tratta di consumo di ossigeno basale.
  6. 1.25 µ l di soluzione di rotenone di 4 mM per inibire complesso ho e quindi aggiungere 5 µ l di soluzione di succinato di 1 M per raggiungere una concentrazione finale nella camera respiratoria di succinato di 5 mM. Si tratta di respirazione di stato 4.
  7. Aggiungere 1 µ l di soluzione di ADP 100 mM per raggiungere una concentrazione finale nella camera di respirazione di 100 μM. Concentrazione di ossigeno diminuisce (respiratorio aumentato) e poi dopo circa 5 minuti diventa una linea retta. Registrare il consumo di ossigeno (pendenza della retta = concentrazione di ossigeno/ora). Questo è stato 3 respirazione.
  8. Opzionale: Al termine della corsa, aggiungere FCCP (volume totale di 0,2 μM) per indurre la massima respirazione. Registrare la respirazione per circa 5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record. Si tratta di massimo consumo di ossigeno.
  9. Calcolare il rapporto respiratorio di controllo (RCR) utilizzando l'equazione di stato 3 consumo di ossigeno / stato 4 consumo di ossigeno.
  10. Aspirare tutte le soluzioni nella camera di respirazione. Sciacquate la vaschetta più volte con acqua deionizzata doppia.

4. misurare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e forza motrice protonica (PMF)

  1. Preparare la soluzione di 80 ng/mL Nigericina in etanolo.
    Nota: Questi prodotti chimici sono dissolti in etanolo, e ogni sforzo dovrebbe essere fatto per limitare la quantità di etanolo che viene aggiunto a meno di 1 μL, poiché etanolo può disgiungere il sistema di trasporto dell'elettrone e causare la disfunzione di l.
  2. Dopo aver sciacquato accuratamente la camera con doppia acqua deionizzata, posizionare 1 mL di OCM nella camera di respirazione e mescolare energicamente con un ancoretta magnetica. Questo vi aiuterà a garantire che la soluzione diventa saturo di aria. Aggiungere metil-Trifenil-fosfonio (TPMP +) sensibile elettrodo per camerare installazione. TPMP + elettrodo deve essere collegato ad un misuratore di pH e valori vengono letti dal pH-metro.
  3. Aggiungi 0,35 mg di proteina mitocondriale alla camera di respirazione.
  4. 1.25 µ l di soluzione di rotenone di 4 mM per inibire la respirazione del complesso I. Record per 2-5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record.
  5. Aggiungere 0,56 μL di soluzione di oligomycin 8 μg/mL per una concentrazione finale di 2,8 µ g oligomycin 0,35 mg di proteina mitocondriale di inibire l'utilizzo di ADP. Registrare la respirazione per 2-5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record.
  6. Aggiungere 0,112 μL 80 ng/mL Nigericina soluzione per abolire il gradiente di pH attraverso la membrana mitocondriale interna. Registrare la respirazione per 2-5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record.
    Nota: Rotenone e oligomycin sono usati per bloccare il trasporto di elettroni della catena nel complesso io e trifosfato di adenosina synthase, rispettivamente. Nigericina viene aggiunto per convertire transmembrana H + sfumatura in una sfumatura di K + che può essere misurata con un elettrodo.
  7. Preparare una curva standard per TPMP + aggiungendo 5 µ l di soluzione TPMP + 10 mM per l'incubazione mitocondriale. Ripetere questo passaggio quattro volte fino a una concentrazione totale di 2,5 μM TPMP + è stato aggiunto.
  8. Avviare la respirazione aggiungendo 5 μL di 1m succinato alla camera.
  9. Registrare la respirazione fino a quando non avete raggiunto una traccia stabile, e quindi titolare il sistema aggiungendo malonato. Aggiunte di malonato dovrebbero essere 1 µ l, 0,5 µ l, 1,5 µ l, µ l 3,0, 6,0 µ l, µ l 9.0, quindi 12,5 µ l della 0,1 malonato soluzione per raggiungere aggiunte successive di malonato concentrazioni nella camera di incubazione di 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 e 2,5 mM.
  10. Raccogliere dati dai due elettrodi (ossigeno e TPMP+). Software di acquisizione dati dal sistema oxygraph consente di raccogliere misurazioni simultanee di consumo di ossigeno mitocondriale e potenziale di membrana mitocondriale e osservare i cambiamenti nel consumo di ossigeno in tempo reale. La figura 14 Mostra come il sistema di oxygraph registra il consumo di ossigeno come il procedere dell'esperimento.
  11. Calcolare MMP in base all'equazione di Nernst mV:
    MMP = 61,5 log ([TPMP +] aggiunto – esterno [TPMP +]) correzione associazione x TPMP+ / (x 0.001 mg di proteina/mL x [TPMP +])
    Una correzione di associazione TPMP + 0,4 µ l/mg di proteina mitocondriale-1 viene utilizzata.
    Esempio di calcolo basato sulle concentrazioni nel protocollo:
    MMP = log x 61,5 (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg proteina mitocondriale/mL x 2 µM)
    MMP = 198,9 mV
  12. Stima PMF tracciando un grafico MMP vs del consumo di ossigeno (Figura 15). PMF è segnalato come consumo di ossigeno a un potenziale di membrana di 165 mV.
    Nota: Titolazione della catena di trasporto degli elettroni con malonato (0.1-2.5 mM) Mostra la risposta cinetica di perdita protonica di MMP. Quindi, tramando MMP contro il consumo di ossigeno determina cinetica di perdita del protone. PMF è determinato calcolando il consumo di ossigeno a un potenziale di membrana comune (165 mV).
  13. Alla fine dell'ultima esecuzione del campione, aggiungere FCCP (volume totale di 0,2 μM) per indurre la massima respirazione e rilasciare TPMP + per la correzione della linea di base.
  14. Aspirare tutte le soluzioni nella camera di respirazione. Sciacquate la vaschetta più volte con acqua deionizzata doppia. Alla fine della giornata, la camera anche lavare un paio di volte con etanolo.

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Representative Results

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Risultati positivi risultati RCR e protone perdita cinetica sono mostrati in tabella 1 e Figura 15, rispettivamente. In questo studio7, RCR e proteina perdita cinetica sono stati misurati in vacche Holstein a 70 giorni nel latte dopo le mucche erano state alimentate 1 di 5 diversi livelli di Cu, Zn e Mn per 28 giorni. Stato 4, respirazione di protone massima perdita-dipendente, aveva la tendenza a essere influenzato dall'assunzione di minerali di Cu, Mn e Zn (p < 0,1). Stato 3 respirazione (massimo ATP stimolata respirazione) e RCR = 3 stato / stato 4 (rapporto di controllo respiratorio) non è stata influenzata dall'assunzione di minerali. 4 stato respirazione era più alta in LowMn e più basso nel controllo, che indica che Mn svolge un ruolo importante nella minimizzazione della respirazione dipendente di perdita protonica. Manganese, attraverso l'enzima superossido dismutasi manganese è noto per ridurre le specie reattive dell'ossigeno nella matrice mitocondriale e protone perdita12. Più alto dichiara 4 respirazione è stata associata con latte inferiore e la produzione di proteine del latte. Poiché la perdita di protoni è una componente importante dell'efficienza energetica, riducendo State 4 respirazione attraverso il completamento Mn potrebbe migliorare l'efficienza.

Trattamenti1
Alta Med Basso LowMn Controllo SEM
Latte, kg 47,4ab 50,9un 46.0ab 43,6b 49,7un 2.9
Proteine del latte, kg 1,38ab 1,44un 1.40ab 1.23b 1.43una 0,09
Stato 3 75,8 64,4 78,2 73 64,1 13
Stato 4 26,2ab 22,6ab 25,9ab 27,1un 22.0b 3
RCR 2.89 2.76 2.98 2.65 2,83 0,27
un b Mezzi all'interno di una riga non seguita dalla stessa lettera in apice sono significativamente differenti (P < 0,1).
1 trattamento alta contiene livelli elevati di Cu, Zn e Mn tutto ben di sopra di requisiti13, Med trattamento contiene livelli intermedi di Cu, Zn e Mn sopra requisiti, trattamento basso contiene i livelli più bassi di Cu, Zn e Mn, ma ancora di sopra requisiti, trattamento basso Mn contiene i livelli più bassi di Mn (e livelli inferiori di Cu e Zn) ma ancora sopra requisiti e controllo trattamento contiene i livelli più bassi di Cu e Zn, che sono vicino ai requisiti.

Tabella 1: effetto di Cu, Mn e Zn completamento sulla produzione di latte e consumo ossigeno mitocondriale del fegato vacche da latte a 70 giorni nel latte. Questa tabella è stata adattata da Acetoze et al 20177.

Perdita di mitocondriale del protone è un processo che dissipa MMP attraverso il movimento dei protoni attraverso la membrana mitocondriale interna senza produzione di ATP14. Cinetica di perdita del protone sono valutati calcolando i tassi di consumo di ossigeno a un potenziale di membrana comune di 165 mV. Un potenziale di membrana inferiore significa che i protoni sono 'perdite' attraverso la membrana mitocondriale, che si traduce nella sintesi di ATP inferiore (Figura 15). Nello studio della mucca Holstein, protone epatica perdita dipendente respirazione era più grande in LowMn e il più basso nel controllo, che concorda con risultati in tabella 1, che dichiara 4 respirazione era più grande in LowMn e il più basso nel controllo.

Figure 15
Figura 15. Cinetica di perdita protonica nelle vacche Holstein alimentati diverse quantità di Cu, Mn e Zn. Questo grafico è basato su dati da Acetoze et al 20177. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati negativi sono illustrati nella tabella 2 e Figura 16. L'efficienza di alimentazione (RFI) era più alto in Angus Manzi nati dal Bassi tori RFI di alte tori RFI, ma questo non è stata riflessa in mitocondriale RCR (tabella 2) o cinetica di perdita del protone (Figura 16). Non c'erano differenze nella respirazione mitocondriale e cinetica di perdita protonica tra gruppi di Manzi, ma c'era una differenza di RFI. Non c'erano inoltre differenze (p = 0,88) in protonica mitocondriale epatico perdita alta e bassa Manzi RFI (Figura 16). C'erano grandi errori standard associati a misure di respirazione mitocondriale e Curve cinetiche di perdita protonica erano piatte. I campioni di fegato da questo studio sono stati ottenuti dopo manzi macellati, un processo di raccolta dei campioni del fegato e l'elaborazione di un'ora in ritardo. Variazione nelle misure di respirazione mitocondriale può riflettere la degradazione di respirazione mitocondriale a causa della morte del tessuto. Linee cinetiche di perdita protonica erano piatte perché misure del consumo di ossigeno non hanno cominciato fino 8 min quando l'altopiano era già stato raggiunto a causa di un malfunzionamento di apparecchiature.

Basso RFI Alta RFI SEM Valore di P
(n = 7) (n = 8)
RFI -0,58 -0.01 0.1 0.05
Stato 3 31.3 30,8 9,42 0.9
Stato 4 9.76 10.4 3.23 0,8
RCR 3,05 3,03 0,24 0.93

Tabella 2: prestazioni e respirazione mitocondriale di alta e bassa assunzione di mangime residuo (RFI) Angus bull progenie. Questa tabella è stata adattata da Acetoze et al 201511.

Figure 16
Figura 16. Cinetica di perdita del protone per la progenie dei tori di RFI Angus di alta e basse. Questo grafico è stato adattato da Acetoze et al 201511. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 1
Figura 1: pulire la zona per chirurgici e materiali di biopsia si trova nella parte posteriore di un veicolo e fuori la penna di mucca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: moderazione della mucca utilizzando un halter legato ad un palo trasversale della testa serratura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: l'area della mucca per pulire per la biopsia e la posizione della biopsia presso lo spazio intercostale di destra 10 - 11 trovato tracciando una linea retta da coxae di tubero giusto al punto della spalla destra. Il sito di biopsia è dove questa linea si interseca con il 10-11 ° spazio intercostale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: un'area di 10 cm della mucca di prepararsi a sterilizzare per la biopsia di rasatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: lavare l'area di biopsia della mucca con 10% providone scrub con un movimento circolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Nebulizzare biopsia zona con soluzione di etanolo 70%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: iniettare lidocaina 2% HCl (10-15 mL) localmente nella zona per fornire l'anestesia della pelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: un'incisione di 1-2 cm attraverso la pelle dello spazio intercostale 10-11 per inserire strumento di biopsia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: inserimento dello strumento di biopsia del fegato bovino attraverso la pelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: lo strumento di biopsia deve essere orientato in senso craniale leggero pur continuando attraverso il diaframma e nel fegato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11: un campione di 1 g di fegato viene spostato da strumento di biopsia a tubo Falconer per il trasporto alla stazione di isolamento mitocondriale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Figura 12: sutura della pelle per chiudere l'incisione di biopsia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 13
Figura 13: iniezione della mucca con Ceftiofur cloridrato 0,044 mL/kg di peso corporeo per via sottocutanea nel collo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 14
Figura 14: Oxygraph software risultati risultati ossigeno le risposte di consumo alla aggiunta di ogni sostanza per misurare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e protone motivo forzare (PMF). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Il punto più critico nel protocollo è ottenere un campione rappresentativo del tessuto del fegato e cominciando l'isolamento dei mitocondri più presto possibile dopo la biopsia. Variazione nelle misurazioni di respirazione è bassa (tabella 1) a causa di un tempo breve trasporto dalla mucca al laboratorio. Per ridurre i tempi di trasporto, un piccolo laboratorio è stato istituito presso l'ufficio del caseificio, e campioni di fegato sono stati guidati al laboratorio ufficio come ciascuno è stato raccolto così che i mitocondri sono stati isolati entro 10 min di biopsia. Installazione e collaudo di elettrodi (ossigeno, TPMP +) e la camera di respirazione con il pH-metro utilizzato per registrare differenze nelle pendenze del protone il giorno prima della raccolta e trattamento dei campioni può evitare malfunzionamenti quali mancanti prime misurazioni in perdita protonica cinetica (Figura 16).

A causa della necessità per i campioni di fegato freschi e rapido isolamento dei mitocondri, il numero di campioni che possono essere raccolti ed elaborati in un giorno è limitato. Ogni campione richiede circa 5-6 h per completare; Pertanto, solo circa 5 campioni al giorno possono essere raccolti e analizzati per alloggiamento di respirazione. Non si tratta di un metodo di alto rendimento; la dimensione del campione per i trattamenti è limitata e piccoli errori possono aumentare la variabilità connessa con i risultati e la capacità di rilevare il significato.

La tecnica di isolamento può escludere alcuni mitocondri che sono associati con alcuni componenti di cellula e rimangono incorporati nel pellet o mitocondri più piccoli possono essere perso nei lavaggi di pellet durante le fasi di centrifugazione. Questo può portare a risultati che non riflettono la popolazione completa dei mitocondri. I mitocondri possono cambiare in dimensioni e densità a seconda degli stati fisiologici come la fame e l'esercizio (formazione)15. Stimare il numero mitocondriale con attività enzimatica utilizzando citrato sintasi16 o succinato deidrogenasi17 per corroborare i risultati possono essere necessari.

Non sono state apportate modifiche alle tecniche originali stabilite nei roditori per isolamento mitocondriale18, respirazione19 e protone perdite cinetica20. Questa tecnica può subire modifiche a seconda della fonte di tessuto di mitocondri e trattamenti sperimentali. BSA (sgrassato) viene utilizzato per associare gli acidi grassi liberi nel tessuto. Se il tessuto ha un sacco di acidi grassi (superiori al 10%) associati con esso, più sgrassata BSA può essere aggiunto perché gli acidi grassi liberi interferisce con le misurazioni mitocondriale.

Consumo di ossigeno mitocondriale e cinetica di perdita protonica utilizzando questa tecnica di misura è la procedura standard. Fegato è stato il tessuto della scelta principalmente perché ha un sacco di mitocondri, sono abbastanza facili da estrarre e il fegato è il luogo primario del trattamento nutriente. Le modifiche di questa tecnica sono state utilizzate per misurare il consumo di ossigeno in altri tessuti quale il muscolo e mammario. Tuttavia, le tecniche di isolamento mitocondriale devono essere modificati per adattare il tessuto. Per esempio, nel muscolo, i mitocondri sono incorporati nelle fibre muscolari e quindi la procedura di isolamento deve includere una digestione di proteine e la digestione deve essere controllati per garantire che la funzione mitocondriale non è interrotto.

Ci sono altri metodi per misurare la respirazione mitocondriale che richiedono un analizzatore specificamente progettato per misurare la respirazione. Le cellule devono essere raccolte dal tessuto e fissate alle piastre di incubazione. Il tasso di consumo Analizzatore ossigeno cellule intere misure (OCR; basale), ATP legato OCR (associato con i mitocondri), nonmitochondrial OCR e massima OCR. Tuttavia, poiché i mitocondri sono inibiti durante alcune dell'incubazione, misurazioni di mitocondri isolati non sono possibili. Questo metodo è stato utilizzato per esaminare i cambiamenti di OCR con droga e malattia interventi21 in esseri umani.

Applicazioni attuali e Future

Il contributo di perdita del protone al fabbisogno di energia dell'animale possa essere grandi e indicativo dello stato fisiologico dell'animale compresa la crescita, l'allattamento e malattia. In passato, questa tecnica è stato principalmente utilizzata per esaminare l'associazione del consumo di ossigeno mitocondriale e contributo di perdita protonica per alimentare o dell'efficienza energetica. Tuttavia, come si espande la nostra comprensione del ruolo dei mitocondri nel metabolismo, l'importanza di questa tecnica aumenterà anche soprattutto in combinazione con altre misure mitocondriale quali attività enzimatiche di catena di trasporto degli elettroni, calcio dinamica attività di apoptosi e degli enzimi del ciclo del TCA.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi Alltech e USDA Hatch attraverso il centro per la salute di cibo animale presso UC Davis School of Veterinary Medicine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

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References

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Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein
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Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

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