Summary
نقدم بروتوكولات هنا لعزل عالية الغلة من ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا وفحوصات البروتين النقل بلاستيدات الخضراء التوأم ارجينين إزفاء (كتات)، الافرازية (cpSec1)، وإشارة التعرف على مسارات الجسيمات (كبسرب).
Abstract
الجبيلة هي العضيات في النباتات الخضراء المسؤولة عن القيام بالعديد من الأيضية الأساسية، أبرزها عملية التمثيل الضوئي. ضمن المعايشة، النظام غشاء ثايلاكويد يضم جميع أصباغ التمثيل الضوئي ومجمعات مركز رد الفعل، ومعظم حاملات الإلكترون، وهي مسؤولة عن توليف ATP تعتمد على الضوء. أكثر من 90% بروتينات بلاستيدات الخضراء المشفرة في النواة ومترجمة في سيتوسول واستيرادها فيما بعد إلى بلاستيدات الخضراء. زيادة البروتين النقل إلى أو عبر غشاء ثايلاكويد يستخدم واحد من أربعة مسارات إزفاء. هنا، يمكننا وصف أسلوب عالية الغلة لعزل ثيلاكويدس النقل المختصة من البازلاء (بيسوم Pisum)، جنبا إلى جنب مع فحوصات النقل خلال الثلاث تعتمد على الطاقة كبتات و cpSec1، وكبسرب بوساطة مسارات. هذه الأساليب تمكن التجارب المتصلة بالتعريب البروتين ثايلاكويد وعلم الطاقة النقل آليات إزفاء البروتين عبر الأغشية البيولوجية.
Introduction
يجب أن يكون ترانسلوكاتيد ما يقرب من جميع البروتينية الآلية المسؤولة عن وظيفة بلاستيدات الخضراء المناسبة من سيتوسول1. في المغلفات بلاستيدات الخضراء، يتم استيراد ركائز البروتين من خلال ترانسلوكون الغشاء الخارجي (TOC) وترانسلوكون من الغشاء الداخلي (عرة)2. مواصلة استهداف ثايلاكويد غشاء والتجويف يحدث خلال إزفاء (كتات) ارجينين التوأم3و الافرازية (cpSec1)4، إشارة اعتراف الجسيمات (كبسرب)5ومسارات الإدراج التلقائي6 . طريقة لعزل عالية الغلة المعايشة النشطة فسيولوجيا والأغشية ثايلاكويد ضروري لقياس علم الطاقة وحركية الحدث إزفاء، فهم آليات النقل المتنوعة في كل مسار، وتعريب بروتين معين الركيزة لمصلحة أي من المقصورات متميزة ستة من بلاستيدات الخضراء.
عزل أغشية من بلاستيدات الخضراء عروض أفضل التجريبية السيطرة على العوامل البيئية (مثل تركيزات الملح والركيزة، ووجود ATP/غتب، وظروف الأس الهيدروجيني) التي تؤثر على قياس النقل علم الطاقة و حركية. هذه البيئة في المختبر يفسح المجال لاستكشاف تفاصيل إزفاء آليا لنفس الأسباب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما تحسنت البرمجيات التنبؤية لتعريب بروتينات بلاستيدات الخضراء7،8، في المختبر فحوصات النقل توفر طريقة أسرع لتأكيد عبر فحوصات الفلورسنت المستندة إلى الفحص المجهري أن تتطلب علامة نيون وراثيا مرمزة، تحول النباتات و/أو أجسام مضادة محددة. نقدم هنا، بروتوكولات للعزلة بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد من البازلاء (بيسوم بسام)، وكذلك لفحوصات النقل الأمثل لكل من المسارات إزفاء ثايلاكويد المعتمدة على الطاقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-المواد الأولى
- نقع حوالي 55 غ البازلاء لمدة 3 ساعات في 400 مل ماء المقطر ومن ثم تبذر في علبة بلاستيكية (35 سم × 20 سم × 6 سم) في التربة مغطاة بطبقة رقيقة من الفيرميكوليت.
- تنمو في علبة البازلاء عند 20 درجة مئوية تحت الضوء/الظلام (50 µE/م2ق) ح 12/12 دورة 9 إلى 15 يوما.
- تعد الركيزة البروتين وفقا لطريقة مفضلة.
ملاحظة: لقد أعددنا ركائز البروتين باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك 1) النسخ في المختبر من والبلازميدات المنقي تليها الترجمة باستخدام مقتطفات جرثومة القمح أو أرنب خلية شبكية ليساتيس حضور [ح]3[--لوسين أو [35S]--الميثيونين، 2) في المختبر الترجمة باستخدام مجموعة أدوات ترجمة/نسخ إلى جانب مثل تي أن تي مجموعات من بروميجا، مع راديولابيلينج على النحو المذكور أعلاه، و 3) تنقية البروتين overexpressed في كولاي. عموما هي تطفئ المشعة في المختبر منتجات الترجمة مع 50 ملم حمض أميني الباردة قبل استخدامها في النقل من ردود الفعل. كل من هذه الأساليب يتطلب عادة بعض التحسين لكل الركيزة البروتين الجديد. للحصول على مثال نظام يقترن في المختبر ، راجع لينغ وجارفيس (2016)9.
2-بلاستيدات الخضراء العزلة والتحديد الكمي
ملاحظة: هو الخطوة الأولى في إعداد ثيلاكويدس عزلة المعايشة سليمة10. ينبغي أن تظل جميع المواد الباردة أثناء الإعداد. استثارة للمعايشة ينبغي التعامل معها بلطف، كما الكسر في هذه الخطوة يمكن أن تحد بشدة من الغلة ثايلاكويد اللاحقة.
- إعداد عقب حلول مسبقاً.
- 2 × Grinding المخزن المؤقت (2xGB): 100 مم حبيس ك الأس الهيدروجيني 7.3، السوربيتول 660 مم، 2 مم مجكل2, 2 مم2من الحركة، 4 مم يدتا، جيش صرب البوسنة 0.2%.
- 2 x استيراد المخزن المؤقت (2xIB): 100 مم تريسيني ك أو K-حبيس pH 8.0، السوربيتول 660 ملم، 8 ملم مجكل2.
ملاحظة: استخدمت تركيزات مجكل2 تتراوح من 3 ملم إلى 10 ملم دون اختلافات ملحوظة.
- إعداد تدرج كثافة مستمر سينتريفوجينج خليط من 15 مل بيركول و 15 مل من 2xGB في 30,900 ز في دوار زاوية ثابتة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية مع الفرامل قبالة.
- حصاد حوالي 25 جرام البازلاء يوم 9-15 القديمة وتجانسه في 95 مل 1xGB. وقد استخدمت بنجاح خلاط مع شحذ شفرات أو بوليترون. تصفية هذا الخليط من خلال طبقات 2 على الأقل من ميراكلوث في قمع.
ملاحظة: الحد من كمية الأنسجة الجذعية ليس ضروريا لكن يمكن جعل عملية التذويب أسهل، مما يقلل من الكسر بلاستيدات الخضراء التي يمكن أن تحدث مع مزج المطول. - بيليه في 3,000 ز في دوار دلو يتأرجح لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وريسوسبيند برفق في 1 مل 1xGB. قد تكون الرسام أسلوب استثارة أكثر لطيف.
- طبقة تعليق الخضراء على رأس التدرج بركل وأجهزة الطرد المركزي في 8,000 ز في دوار دلو يتأرجح لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية مع الفرامل قبالة بعناية.
- حصاد الشريط الأخضر السفلي يحتوي على المعايشة سليمة في أنبوب جديد بعناية. تدور المعايشة سليمة المستردة في 1,800 ز في دوار دلو يتأرجح لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية ولطف ريسوسبيند بيليه في 1xIB. كرر هذا يغسل الخطوة مرة أخرى، ريسوسبيندينج في 30 مل 1xIB في كل مرة، مع تعليق النهائي في 1 مل 1xIB.
- للتحديد الكمي لمحتوى الكلوروفيل (شيلي)، مزيج 10 ميليلتر للمعايشة حراكه تماما مع 5 مل من الأسيتون 80% وتصفية من خلال ورق الترشيح 1 واتمان (سمك الاسمية 180 ميكرون). سجل امتصاص في 720 نانومتر، 663 شمال البحر الأبيض المتوسط، و 645 نانومتر في جهاز المطياف الضوئي وحساب تركيز شيلي باستخدام الصيغة التالية11:
[شيلي] مغ/مل = [40.2* (663 –720) + 101.4* (645 –720)] * 0.1 - ضبط المعايشة إلى 1 مغ/مل مكافئات شيلي مع 1xIB.
3-عزل ثيلاكويدس
ملاحظة: ثيلاكويدس يعدها تحلل ناقص التوتر للمعايشة سليمة. ويتحقق ذلك بتعريض المعايشة للمخزن مؤقت ناقص التوتر التي تفتقر إلى السوربيتول. ثيلاكويدس معزولة يمكن أن تستخدم لفحص أي من مسارات إزفاء، لكن استخراج stromal (جنوب شرق) كما يجب عزلة أثناء إعداد هذا إذا كانت المسارات أما cpSec1 أو كبسرب التحقيق.
- إعداد وقت مبكر الحلول التالية.
- ناقص التوتر تحلل العازلة: 50 مم تريسيني ك أو K-حبيس pH 8.0، 8 مم مجكل2.
- 2 × النفط الخام المخزن المؤقت ستروما (لتركيز SE): 100 مم كحبيس pH 8.0، السوربيتول 660 ملم، 8 ملم مجكل2.
- لايملي عينة المخزن المؤقت (للحزب الديمقراطي الصربي صفحة، وتستكمل مع يدتا): 125 ملم تريس الأس الهيدروجيني 6.8، 10% الحزب الديمقراطي الصربي، الجلسرين 20%, 0.05 مغ/مل بروموفينول الأزرق, 10% β-mercaptoethanol، 10 مم يدتا.
- إذا كان استرداد سراج الدين ليس ضروريا، الطرد المركزي المعايشة سليمة في 1,000 ز في دوار دلو يتأرجح لمدة دقيقة 6 في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند إلى 1 مغ/مل في "المخزن المؤقت لتحلل ناقص التوتر". تبني على الجليد في الظلام لمدة 10 دقيقة، مع خلط أحياناً.
- استرداد ثيلاكويدس من سينتريفوجينج في 3,200 ز في يتأرجح دلو الدوار لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. أغسل ثيلاكويدس مرتين، ريسوسبيندينج مع 1 إلى 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل كل الوقت. ريسوسبيند مع 1 مل 1xIB وريكوانتيفي شيلي أعلاه في البروتوكول العزلة بلاستيدات الخضراء.
4-stromal استخراج الانتعاش وتركيز
- إذا كان من الضروري استعادة سراج الدين، تقسيم المعايشة سليمة إلى 600 ميليلتر مختبرين في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل والطرد المركزي كل أنبوبة في 1,000 ز في يتأرجح دلو الدوار لمدة دقيقة 6 في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذا المجلد مناسب عند استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، مما يساعد على منع الاضطرابات بيليه في نهاية المطاف للأغشية المتبقية.- ريسوسبيند إلى 1 مغ/مل شيلي في "المخزن المؤقت لتحلل ناقص التوتر" واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 10 دقيقة، كما هو الحال في الخطوة 3.2.1.
- الطرد المركزي كل أنبوبة في س 3,200 ز في يتأرجح دلو الدوار لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل ضوء أخضر أو أصفر طافية التالية بلاستيدات الخضراء تحلل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة مع وحدة تخزين تساوي 2 × النفط الخام المخزن المؤقت سدى.
- أغسل ثيلاكويدس مع وحدات التخزين 2 تحلل المخزن المؤقت (تقارب 0.5 ملغ/مل) وتجميع باستخدام الطرد المركزي في 3,200 ز في يتأرجح دلو الدوار لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند إلى 1 مغ/مل شيلي في 1xIB على الجليد.
- الطرد المركزي ستروما الخام في 42,000 ز في دوار زاوية ثابتة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة أغشية متبقية. يمكن استخدام إيمونوبلوتينج للبروتينات المغلف الخارجي والداخلي للتحقق من نقاء المادة طافية.
- جمع 95% الحجم من كل أنبوبة دون إزعاج بيليه الأصفر والأخضر الصغيرة. ملاحظة حجم مأخوذة من كل أنبوبة.
- إعداد المقتطف stromal تتركز (SE)، تجمع supernatants جمعها والتركيز على استخدام خمسة إضعاف مركز موكو كاتشين 4 مل 30.
ملاحظة: سراج الدين أعد بهذه الطريقة ما يعادل ستروما مشتقة من المعايشة في 2.5 ملغ/مل التناظر إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون سراج الدين تتركز عشرة إضعاف إلى 5 ملغ/مل مكافئات شيلي. سراج الدين وسيكون اللون الذهبي ولزج. في أجهزة الطرد المركزي المختبر RT أسطورة مع يتأرجح دلو الدوار، وهذا يتطلب حوالي 10 دقيقة لكل مل مركزة.
5-النقل عن طريق كتات المسار
ملاحظة: على عكس cpSec1 أو كبسرب، مسار كبتات لا تتطلب مكونات قابلة للذوبان أو مناشئ إضافة مصادر الطاقة؛ فقط هو القوة الدافعة بروتون يحركها الخفيفة اللازمة3. ولذلك، فقط معزولة من البروتين ثيلاكويدس والركيزة مطلوبة من أجل المقايسة. ركائز النموذجية هي الوسيطة أشكال كاتشين 17 (كما يتضح في الشكل رقم 1) و 23 مفارز كاتشين الأكسجين المتطورة المعقدة، و iOE17 و iOE23، على التوالي، ولكن أشكال السلائف، و prOE17، و prOE23، ويمكن أيضا بنجاح نقلها. تحتوي النماذج السلائف ثنائية الطرفي ن الاستهداف التسلسل الكامل، بينما الأشكال الوسيطة فقط ثايلاكويد استهداف التسلسل.
- إعداد مزيج النقل كتات مع 0.33 ملغ/مل ثيلاكويدس شيلي، 5 ملم ATP من مخزون أعدت في 1xIB، وديثيوثريتول 8 مم (DTT) من أسهم على استعداد في 1xIB، على الجليد. ATP غير مطلوب تماما لرد الفعل هذا إذا أجريت تحت الإضاءة.
- بدء النقل عن طريق إدخال 01:30 وحدة التخزين بحجم مزيج البروتين الركيزة في النقل. إذا لم تكن مستعدة البروتين الركيزة في 1xIB، إعداد إضعاف مع 2xIB أولاً، ثم استخدم 01:30 وحدة التخزين بحجم من الركازة المخفف في مزيج النقل 1:1.
ملاحظة: تتنوع استناداً إلى طريقة إعداد تركيزات الركازة. عادة، سيتيح التحضير في المختبر nanomolar للمبالغ micromolar، بينما overexpression سيسمح ل micromolar المبالغ ميليمولار. يجب أيضا النظر في أساليب الكشف، كما أكثر حساسية من إيمونوبلوتينج أوتوراديوجرافي وفلوروجرافي. - إلقاء الضوء على تعليق 80-100 µE/م2s من الإشعاع النشط متعددات (الاسمية) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وإذا لزم حركية النقل، قبل حجته مزيج ثيلاكويدس ورد فعل إلى درجة حرارة الغرفة وتُضِيءُ لمدة تصل إلى 30 دقيقة.
- التوقف عن رد فعل النقل مع تمييع 8-fold 1xIB المثلج واسترداد ثيلاكويدس بالطرد المركزي في 3,200 ز في ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة الركازة المتبقية التي لم يكن قد تم نقلها، ريسوسبيند بيليه ثايلاكويد في 120 ميليلتر من 1xIB وهضم البروتين الخارجية بإضافة 6 ميليلتر من 2 مغ/مل ثيرموليسين و 10 مم كاكل2 في 1xIB.
- احتضان حوزتي رد فعل على الجليد لمدة 40 دقيقة، وآرو حوزتي ثم بمضاعفة الحجم مع 25 مم يدتا أعدت في 1xIB.
- استرداد ثيلاكويدس من سينتريفوجينج في 3,200 ز في ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. أغسل ثيلاكويدس المستردة في ميكروليتر 120 مم 5 يدتا في 1xIB ونقل إلى أنبوب جديد.
- الطرد المركزي في 3,200 ز في ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند في وحدة تخزين مناسبة لايملي عينة المخزن المؤقت تستكمل مع 10 ملم يدتا. حجم ميليلتر 40 عادة ما يكفي كشف الركازة على هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ويحافظ على عينة لتكرار الهلام عند الضرورة.
- وضع العينات في حمام مائي يغلي لمدة 10 دقائق وتحليلها بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة. قد استخدمت بنجاح لكشف البروتينات نقلها أوتوراديوجرافي أو فلوروجرافي، أو النشاف الغربية من البروتينات غير أصلي أو حانمه معلم.
6-النقل من خلال مسار cpSec1
ملاحظة: النقل من خلال ترانسلوكون cpSec1 يتطلب البروتين stromal cpSecA112،13، التي يمكن شراؤها عبر overexpression في14، كولاي15 أو استردادها من خلال التركيز ستروما خلال ثايلاكويد العزلة. هو ركيزة نموذجية فرعية كاتشين 33 من الأكسجين في التطور المعقدة (prOE33)، كما هو مبين في الشكل 2.
- إعداد مزيج cpSec1 النقل مع 0.33 ملغ/مل ثيلاكويدس شيلي، شيلي 0.83 مغ/مل سي أي ما يعادل أو 1.5 ميكروغرام من cpSecA1 المؤتلف، و 5 ملم ATP على الجليد، واحتضان لمدة 10 دقائق. خليط رد فعل نقل نموذجية هنا 72 ميكروليتر، يصل من 60 ميكروليتر بسبب إضافة سراج الدين.
- إذا كان سيتم استخدام cpSecA1 المؤتلف بدلاً من سراج الدين، ضبط cpSecA1 المنقي مع حجم متساوية من 2xIB، ثم تضعف بتركيز مناسب لإضافة إلى ردود فعل النقل (مثلاً، 0.75 ميكروغرام/ميليلتر).
ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، cpSecA1 يتم تخزين على الجليد في غرفة مبردة، والتي تسيطر عليها بعد تنقية كما يلغي تجميد النشاط.
- إذا كان سيتم استخدام cpSecA1 المؤتلف بدلاً من سراج الدين، ضبط cpSecA1 المنقي مع حجم متساوية من 2xIB، ثم تضعف بتركيز مناسب لإضافة إلى ردود فعل النقل (مثلاً، 0.75 ميكروغرام/ميليلتر).
- بدء النقل عن طريق إدخال 01:10 وحدة التخزين بحجم مزيج البروتين الركيزة للنقل. إذا لم تكن مستعدة البروتين الركيزة في 1xIB، إعداد إضعاف 1:1 مع 2xIB وإضافة 01:10 وحدة التخزين بحجم البروتين المخفف لهذا المزيج النقل.
- تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تحت 80 – 100 µE/م2s الاسمية. مرة أخرى، قد يلزم وقت أطول لحركية أو بعض ركائز.
- بعد المعالجة الخفيفة، تمييع 8 إضعاف مع ردود فعل 1xIB وأجهزة الطرد المركزي المثلج في 3200 ز في ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تعامل مع ثيرموليسين وآرو مع يدتا أعلاه في خطوات 5.5 من خلال 5.7.
- الطرد المركزي في 3,200 ز في ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه في وحدة تخزين مناسبة لايملي عينة المخزن المؤقت تستكمل مع 10 ملم يدتا. مكان في حمام الماء لمدة 10 دقيقة قبل تحميلها على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل يغلي.
7-الإدراج عن طريق كبسرب المسار
ملاحظة: يتطلب إدماج كبسرب بوساطة الضوء حصاد البروتينات المعقدة (لهكب) ينظر في الشكل 3 cpSRP54 و cpSRP43، وكبفتسي16. يتم توفير هذه المكونات إلى رد فعل النقل عن طريق استخراج stromal مركزة، كما هو موضح لبروتوكول النقل cpSec1.
- إعداد كبسرب نقل المزيج مع 0.33 ملغ/مل ATP شيلي ثيلاكويدس، 0.83 مغ/مل شيلي يعادل سراج الدين، و 5 ملم على الجليد واحتضان لمدة 10 دقائق.
- بدء النقل عن طريق إدخال 01:10 وحدة التخزين بحجم مزيج البروتين الركيزة للنقل. إذا لم تكن مستعدة البروتين الركيزة في 1xIB، إعداد إضعاف 1:1 مع 2xIB وإضافة 01:10 وحدة التخزين بحجم البروتين المخفف لهذا المزيج النقل.
- تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 80 – 100 µE/م2s الاسمية.
- بعد المعالجة الخفيفة، تمييع 8 إضعاف مع ردود فعل 1xIB وأجهزة الطرد المركزي المثلج في 3,200 ز في ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 120 ميليلتر من 1xIB.
- تعامل مع ثيرموليسين أعلاه في أقسام 5.5 من خلال 5.7. الهضم ثيرموليسين ضروري هنا لتقييم التكامل غشاء ناجحة. أغسل ثيلاكويدس المستردة في ميكروليتر 120 مم 5 يدتا في 1xIB ونقل إلى أنبوب جديد.
- الطرد المركزي في 3,200 ز في ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه مرة أخرى في وحدة تخزين مناسبة العازلة x Laemmli 2 وتستكمل مع 10 ملم يدتا. مكان في الغليان حمام الماء لمدة 10 دقيقة قبل التحليل بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
ملاحظة: يتم تقييم إدماج ناضجة لهكب (ملهكب) بظهور المنتجات المحمية بحوزتي التدهور (ملهكب-د) حوالي 1.5-2 كاتشين أصغر من ملهكب أونكليفيد17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقياس كمية الركازة نقلها بنجاح، فإنه مفيد لتشمل الممرات "إدخال النسبة المئوية" واحد أو أكثر. واستخدمت البيانات المعروضة أدناه، 10% من رد فعل النقل النهائي دون ثيلاكويدس. هذا "إدخال النسبة المئوية" كما يساعد على تصور حجم الركيزة السلائف. النسبة المئوية تمثل كمية محددة ومعروفة للركيزة التي على الركازة مقارنة نقل ضد ويمكن تحجيمها لأعلى أو أسفل كما يلزم في البداية باستخدام إعداد البروتين. بالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن تحميل أقل من 4 ميكروغرام من مكافئات شيلي في ممر واحد على 0.75 مم polyacrylamide الجل تجنب الفرقة تشويه وتلطيخ. وأعدت أدناه جميع ركائز وراديولابيليد باستخدام أدوات الترجمة في المختبر .
نقل iOE17 عن طريق ممر كتات
الشكل 1 . النقل من iOE17through في مسار كتات. فلوروجراف من [ح]3[-iOE17 النقل معاملة المقايسة وثيرموليسين من الركازة غير المنقولة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويمكن الكشف عن النقل كتات الناجح لمعظم تأت ركائز تحول حجم عند الانقسام ومن الطرفي ن إشارة هضميد3. في ركائز التي يوجد فيها لا إشارة كليفابل الببتيد،من1819، مطلوب علاج مبطلات لتكشف عن الركيزة التي عبرت الغشاء، وبذلك تصبح غير قابلة للوصول الهضم التي حوزتي. في الشكل 1، معالجة نقل نتائج iOE17 في تحول حجم حوالي 2-3 كاتشين بين الركازة المدخلة وناضجة في النموذج. عدم نقل الركيزة المتدهورة عن طريق علاج مبطلات (لين 4).
نقل prOE33 من خلال مسار cpSec1
الشكل 2 . نقل prOE33 عن طريق ممر cpSec1. أوتوراديوجراف [35S]-الفحص النقل prOE33 استخدام سراج الدين، cpSecA1 المنقي أو كليهما في نفس الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يمكن تقييم النقل عبر ممر cpSec1 (الشكل 2) ومن خلال حجم تحول في الركيزة ناضجة إذا كان يحتوي على الركازة ثايلاكويد كليفابل استهداف إشارة، فضلا عن حماية حوزتي من الركازة تنقل20.
تكامل برلهكب من خلال مسار كبسرب
الشكل 3 . دمج برلهكب من خلال مسار كبسرب. أوتوراديوجراف [35S]-برلهكب والهضم للمنتج ملهكب-د بعد الإدراج في الغشاء ثايلاكويد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويمكن تقييم إدراج برلهكب في غشاء ثايلاكويد عبر ممر كبسرب عن طريق الهضم ثيرموليسين. تحول حجم حوالي 1.5-2 كاتشين يدل على الإدراج غشاء ناجحة كما يحمي الغشاء البروتين ناضجة أونكليفيد من بروتيوليسيس كاملة15. في الشكل 3، ملهكب-د المنتجات المحمية بحوزتي مرئية بوضوح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عزل بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد
يمكن أن يؤدي إلى الكسر المفرط في بلاستيدات الخضراء الفقراء العزل ومن ثم ثايلاكويد الفقيرة تسفر عن بعد الانفصال في التدرج. فمن الأفضل مجانسة الأنسجة المقطوع بلطف بضمان أن جميع المواد هي غارقة قبل المزج والنبض في 15 ثانية دورات حتى تجانس تماما. إذا لزم الأمر، استخدم عدة جولات أقصر من المزج مع أنسجة أقل في كل جولة.
التبريد جميع المواد التي تتلامس مع الأنسجة المقطوع يساعد المعايشة معزولة الإبقاء على نشاط يصل إلى ساعتين. من المهم الاحتفاظ المعايشة في الجليد في الظلام بعد عزلة، وكذلك.
من الأهمية بمكان أن تدرج المغنيسيوم في المخازن المؤقتة للاتصال ثيلاكويدس معزولة. عدم القيام بذلك يؤدي إلى ديستاكينج جرانال وخطيرة تؤثر على توليد قوة دافعة بروتون عند إضاءة21. ثيلاكويدس قد استخدمت في نقل ردود الفعل إلى ساعتين بعد عزلة عندما أبقى على الجليد وفي الظلام.
الاستفادة المثلى من ردود فعل النقل
ثيلاكويدس معزولة تسوية سريعة ويمكن أن ينتج معادلات شيلي غير المتكافئة بين ردود الفعل. على هذا النحو، من المهم أن مزيج ثيلاكويدس جيدا قبل استخدامها، خاصة عند إعداد عدد كبير من العينات.
مسار تأت
ويمكن تقليل كفاءة النقل عن طريق المسار تأت عند الغسيل المفرط ثيلاكويدس منذ Tha4 يمكن استخراج (تاتا) جزئيا من الغشاء22. في مثل هذه الحالات، يكون من المفيد لتقليل الخطوات أغسل ثايلاكويد قبل رد فعل النقل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين أوقات أطول في إنارة الكشف حيث ينقلون ركائز سيئة تحت ظروف النموذجية.
مسار cpSec1
كمية cpSecA1 في جنوب شرق تتركز عند المعايرة في مسار cpSec1، ينبغي دعم النقل، إلا أن النقل قد يكون ضعيفا. كفاءة النقل في ثيلاكويدس متفرقة قد تستفيد من إضافة cpSecA1 المنقي لبعض البروتينات، على الرغم من stromal مرافقين في حد ذاتها قد يساعد أيضا في زيادة كفاءة النقل15. علاوة على ذلك، لا يمكن تجميد الاستعدادات للبروتين cpSecA1 قبل الاستخدام في النقل، وهذا يقلل من نشاط النقل. وبالمثل، سراج الدين المجمدة أقل نجاعة من استخراج الطازجة. كما هو الحال في النقل تأت، يمكن أن تساعد أطول من فترات حضانة في مزيج النقل مع ركائز صعبة.
كبسرب الطريق
في حين تم إعادة تشكيل كبسرب النقل باستخدام مكونات فردية يؤديها23، مريحة لتوريد cpSRP43، cpSRP54، وهو كبفتسي مع المقاومة ذاتها ثيرموليسين المعايير الأكثر صرامة ل التكامل لهكب16، 17، لكن انتزاع القلوية يمكن أداؤها جيدا17. في حين غالباً ما يمكن السلائف المجمدة والمخزنة في-80 درجة مئوية للعديد من ردود فعل النقل، ينبغي أن تستخدم برلهكب أعده التوليف في المختبر للنقل فورا بعد توليف دون تجميد.
توصيف الركيزة رواية استهداف المسار
في الحالات التي يكون فيها المسار إزفاء اتخذتها الركازة رواية غير معروفة، من المستصوب للتحقيق في أول إشارة ممكنة الببتيدات في السيليكون باستخدام تسلسل الأحماض الأمينية من السلائف أو النموذج المتوسط. عادة يتطلب المسار كتات فكرة توأم محددة توافق ارجينين في الببتيد إشارة ولا ATP للنقل الناجحة تحت الاسمية3. على عكس مسار تأت، يتطلب المسار cpSec1 ATP والبروتين cpSecA1. فشل النقل في ظروف تفتقر إلى هذه المكونات تشير إلى المسار cpSec120. المسار كبسرب يتطلب العثور على الجسيمات الاعتراف إشارة في SE. فشل النقل باستخدام cpSecA1 المنقي و ATP، ولكن عدم وجود التوأم ارجينين فكرة توافق الآراء في الببتيد إشارة، تشير إلى المسار كبسرب23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقد أعدت هذه المخطوطة مع التمويل من شعبة العلوم الكيميائية وعلوم الأرض، والعلوم البيولوجية، مكتب 408 من علوم الطاقة الأساسية "إدارة الطاقة الأمريكية" عن طريق المنح دي-SC0017035
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
