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Neuroscience

एक उपंयास में इन विट्रो मॉडल विस्फोट के दर्दनाक मस्तिष्क चोट

doi: 10.3791/58400 Published: December 21, 2018

Summary

इस कागज प्राथमिक विस्फोट दर्दनाक मस्तिष्क चोट के एक उपंयास मॉडल का वर्णन है । एक संपीड़ित हवा में संचालित सदमे ट्यूब के लिए इन विट्रो माउस हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों में बेनकाब करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक झटका लहर । यह एक सरल और तेजी से एक उच्च प्रवाह के साथ एक reproducible मस्तिष्क ऊतक चोट पैदा प्रोटोकॉल है ।

Abstract

दर्दनाक मस्तिष्क चोट सैंय और नागरिक आबादी में मौत और विकलांगता का एक प्रमुख कारण है । विस्फोट के विस्फोटक उपकरणों के विस्फोट से दर्दनाक मस्तिष्क चोट के परिणाम, हालांकि, तंत्र है कि आबाद मस्तिष्क क्षति विस्फोट से अधिक दबाव जोखिम के परिणामस्वरूप पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे है और मस्तिष्क की चोट के इस प्रकार के लिए अद्वितीय माना जाता है । नैदानिक मॉडल महत्वपूर्ण उपकरण है कि बेहतर विस्फोट प्रेरित मस्तिष्क चोट को समझने में योगदान कर रहे हैं । इन विट्रो ब्लास्ट TBI मॉडल में एक उपन्यास वास्तविक जीवन खुला क्षेत्र विस्फोट तरंगों Friedlander तरंग द्वारा मॉडलिंग अनुकरण करने के लिए एक खुला समाप्त सदमे ट्यूब का उपयोग कर विकसित किया गया था । C57BL/6N माउस organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों एक सदमे तरंगों को उजागर और चोट के विकास के लिए ७२ ज propidium आयोडाइड, कोशिका क्षति के एक अच्छी तरह से स्थापित फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कर रहे थे कि केवल कोशिकाओं के साथ प्रवेश सेलुलर झिल्ली समझौता । Propidium आयोडाइड प्रतिदीप्ति एक विस्फोट की लहर से अवगत कराया स्लाइस में काफी अधिक था जब इस प्रोटोकॉल की अवधि भर में अन्तर्वासना स्लाइस की तुलना में । मस्तिष्क ऊतक चोट बहुत reproducible और सदमे लहर लागू की चोटी के दबाव के लिए आनुपातिक है ।

Introduction

विस्फोट दर्दनाक मस्तिष्क चोट (TBI) विस्फोटक उपकरणों के विस्फोट से परिणाम है कि मस्तिष्क की चोट का एक जटिल प्रकार है1,2. ब्लास्ट TBI इराक और अफगानिस्तान में हाल ही में हुए सैन्य संघर्षों के साथ पिछले 15 सालों में एक प्रमुख स्वास्थ्य मुद्दे के रूप में उभरा है2,3. कुल मिलाकर, यह अनुमान है कि ४.४% और इराक और अफगानिस्तान से लौट रहे सैनिकों के २२.८% के बीच हल्के TBI, इन जा रहा है विस्फोट से संबंधित की एक बड़ी संख्या का सामना करना पड़ा है, अमेरिकी बलों में विस्फोट TBI के एक उच्च दर की सूचना के साथ ब्रिटेन बलों के साथ तुलना में4 ,5.

तात्कालिक विस्फोटक उपकरणों का उपयोग विस्फोट से जुड़े आघात के अधिकांश के लिए जिंमेदार है, ब्लास्ट TBI सहित, सैंय बलों6द्वारा सहा । एक विस्फोटक आरोप के एक बहुत तेजी से परिणाम में विस्फोट-लेकिन क्षणिक-दबाव में वृद्धि, मिसे में होने वाली । एक वास्तविक जीवन मुक्त क्षेत्र विस्फोट से परिणामस्वरूप अधिक दबाव लहर Friedlander समारोह द्वारा मॉडलिंग की है, चोटी एक घातीय क्षय7,8द्वारा पीछा करने के लिए अचानक वृद्धि के साथ । चरम बलों की सीमा और उनके तेजी से समय एक विस्फोट घटना में देखा पाठ्यक्रम आमतौर पर गैर में अनुभव नहीं कर रहे है विस्फोट1,9आघात । तरंग की अधिकतम दबाव है, जो पीक अधिक दबाव, और सकारात्मक लहर की अवधि के लिए मस्तिष्क की चोट विस्फोट और इन विस्फोटक आरोप और विस्फोट से दूरी10पर निर्भर करने के लिए महत्वपूर्ण योगदानकर्ताओं माना जा रहा है, 11.

आघात है कि एक विस्फोटक विस्फोट से परिणाम चार असतत घटकों, प्राथमिक, माध्यमिक, तृतीया और चतुर्धातुक विस्फोट चोट10,12,13,14के रूप में नामित के रूप में वर्गीकृत किया गया है । इन घटकों में से प्रत्येक चोट के विशिष्ट तंत्र के साथ जुड़ा हुआ है । प्राथमिक विस्फोट चोट अंगों और ऊतकों पर अधिक दबाव लहर के प्रत्यक्ष कार्रवाई से परिणाम2,13. द्वितीयक विस्फोट चोट टुकड़े फेंकने के प्रभाव से परिणाम, मर्मज्ञ और गैर-मर्मज्ञ घाव2,15के कारण । तृतीयक विस्फोट चोट तब होती है जब शिकार के शरीर जमीन या आसपास की वस्तुओं के खिलाफ विस्थापित है और त्वरण/मंदी बलों1,10,13के साथ जुड़ा हुआ है । चतुर्धातुक विस्फोट चोट सीधे पहले तीन चोट तंत्र द्वारा कवर नहीं विस्फोट से संबंधित चोटों के एक विषम समूह का वर्णन12,13वर्णित है । यह शामिल है (लेकिन सीमित नहीं है) थर्मल चोट, धुआं साँस लेना, विकिरण, विद्युत चुम्बकीय तरंगों, और प्रतिकूल मनोवैज्ञानिक प्रभाव13,15. सबसे विस्फोट से जुड़े TBI चोट के पहले तीन तंत्र से सीधे परिणाम है, जबकि विस्फोट की चोट के चतुर्धातुक तंत्र आम तौर पर प्रणालीगत चोट13के साथ जुड़े रहे हैं । त्वरण/मंदी बलों के प्रभाव (जैसे, whiplash), कुंद और मर्मज्ञ दर्दनाक मस्तिष्क चोट बड़े पैमाने पर TBI के अंय प्रकार के संबंध में अध्ययन किया गया है (जैसे, मोटर वाहन दुर्घटनाओं, गिरता है, बैलिस्टिक चोट) । हालांकि, प्राथमिक विस्फोट अधिक दबाव लहर चोट विस्फोट और मस्तिष्क के ऊतकों पर इसके प्रभाव के लिए अद्वितीय है बहुत कम अच्छी तरह से16समझ रहे हैं । प्राथमिक विस्फोट चोट तंत्र, एक दबाव लहर के साथ जुड़े, यांत्रिक बलों के पहले मस्तिष्क के साथ बातचीत कर रहे हैं ।

कई नैदानिक TBI मॉडल पिछले दशकों है कि चोट और pathophysiology के विस्फोट TBI तंत्र को समझने के लिए अमूल्य गया है और संभावित नए उपचार है, जो अंयथा करने के लिए विशेष रूप से असंभव हो जाएगा की जांच पर विकसित किया गया है नैदानिक सेटिंग में17,18,19. हालांकि कोई एकल नैदानिक मॉडल नैदानिक विस्फोट मस्तिष्क आघात की जटिलता को पुन: पेश कर सकते हैं, आम तौर पर अलग नैदानिक TBI मॉडल मानव TBI के विशिष्ट पहलुओं को दोहराने । एक विस्फोट विस्फोट के साथ जुड़े बलों की हानिकारक कार्रवाई अलगाव में या दोनों में इन विट्रो में और vivo ब्लास्ट TBI मॉडल में संयोजन में अध्ययन किया जा सकता है । इन विट्रो मॉडल में प्रयोगात्मक पर्यावरण (ऊतक शारीरिक स्थितियों और चोट जैव यांत्रिकी), जो जैविक परिवर्तनशीलता को कम कर देता है और reproducibility में सुधार के एक तंग नियंत्रण की अनुमति का लाभ है, के अध्ययन की अनुमति पशु मॉडल20में मौजूद संस्थापकों के बिना विशिष्ट आणविक कैस्केडिंग । हमारा लक्ष्य एक इन विट्रो मॉडल मस्तिष्क ऊतक पर प्राथमिक विस्फोट के प्रभाव की जांच करने के लिए विकसित करने के लिए किया गया था । हम ऐसी है कि एक तात्कालिक विस्फोटक डिवाइस (आईईडी) द्वारा उत्पादित के रूप में एक मुक्त क्षेत्र विस्फोट की एक Friedlander तरंग प्रतिनिधि के साथ एक सुपरसोनिक shockwave के साथ एक मॉडल विकसित करने के उद्देश्य से ।

Protocol

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों १९८६ के यूनाइटेड किंगडम जानवरों (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) अधिनियम के अनुपालन में किया गया है और पशु कल्याण & नैतिक समीक्षा शरीर इंपीरियल कॉलेज लंदन द्वारा अनुमोदित किया गया है । पशु देखभाल इंपीरियल कॉलेज लंदन के संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुपालन में था ।

१. हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाईस वडा तथा संस्कृति

नोट: इस प्रोटोकॉल Stoppini और मामूली संशोधनों के साथ सहयोगियों द्वारा वर्णित इंटरफेस विधि के अनुसार organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस के उत्पादन की अनुमति देता है21,22,23. आदर्श रूप में, कोई तीन से अधिक जानवरों euthanized और प्रत्येक कदम को सुनिश्चित करने के लिए एक सत्र में विच्छेदित किया जाना चाहिए तेजी से किया जाता है और स्लाइस की गुणवत्ता से समझौता करने से बचने के लिए. भर अपूतित तकनीक का प्रयोग करें ।

  1. सुनिश्चित करें कि निम्न चरण विच्छेदन प्रोटोकॉल प्रारंभ करने से पहले लिया जाता है ।
    1. तैयार और फिल्टर एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर अग्रिम में सभी समाधान निष्फल.
    2. भंडारण के दौरान 4 ° c पर समाधान रखें और सभी समय पर गीला बर्फ पर बैठे एक धातु गर्मी सिंक पर भंडारण कंटेनरों और पेट्री व्यंजन रखने के द्वारा मस्तिष्क विच्छेदन और हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी भर में ।
    3. आटोक्लेव सभी धातु उपकरणों, अंगूठियां और कागज के ऊतकों ।
    4. प्रोटोकॉल के प्रत्येक कदम के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए सभी उपकरणों और सामग्री सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं, पहले से बाहर रखी और ७०% इथेनॉल के साथ छिड़काव । सुनिश्चित करें कि वे शांत और शुष्क करने की अनुमति दी जाती है ।
  2. Euthanize एक 5-7 दिन पुराने C57BL/6N गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और संक्षेप में बाँझ कागज ७०% इथेनॉल में लथपथ ऊतक के साथ पूरे त्वचा की सतह पोंछ द्वारा पिल्ला । पॅट त्वचा सूखी और decapitate मेयो कैंची का उपयोग पिल्ला ।
  3. पश्चकपाल क्षेत्र में शुरू करने और थूथन के पास समाप्त होने और बाद में इसे वापस लेने के सिर के midline साथ आइरिस कैंची के साथ खोपड़ी त्वचा में कटौती ।
  4. फोरमेन मैग्नम में Vannas कैंची की नोक डालें और अनुप्रस्थ साइनस के साथ हड्डी पर दो छोटे पार्श्व कटौती करते हैं, तो midline साथ घ्राण बल्ब को खोपड़ी में कटौती और दो छोटे इस क्षेत्र में midline को सीधा कटौती करते हैं ।
  5. संदंश घुमावदार ठीक बिंदु का उपयोग करना, बाद में midline से दूर हड्डी की फ्लैप वापस लेना, ध्यान से एक छोटे से रंग के साथ मस्तिष्क को हटाने और यह एक ९० मिमी सिलिकॉन elastomer-लेपित पेट्री डिश "विच्छेदन माध्यम" युक्त करने के लिए स्थानांतरण.
    नोट: विच्छेदन मध्यम है Gey संतुलित नमक समाधान (5 मिलीग्राम/एमएल डी-ग्लूकोज, 1% एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान, १०,००० इकाइयों के साथ/एमएल पेनिसिलिन, 10 मिलीग्राम/एमएल streptomycin और 25 µ g/एमएल amphotericin बी) ।
  6. सेरिबैलम निकालें और एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर midline साथ मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग । एक रंग का प्रयोग करें एक नया ९० mm सिलिकॉन elastomer-लेपित पेट्री ताजा बर्फ ठंड विच्छेदन मध्यम से भरा पकवान को मस्तिष्क गोलार्द्धों हस्तांतरण । एक से अधिक पशु एक सत्र में इस्तेमाल किया जा करने के लिए है, तो दोहराएँ कदम 1.2 – 1.6.
  7. एक stereomicroscope के तहत, घ्राण बल्ब और एक उस्तरा ब्लेड के साथ ललाट प्रांतस्था की नोक में कटौती और मस्तिष्क ऊतक के आराम से मस्तिष्क प्रांतस्था ठीक टिप संदंश का उपयोग कर अलग । इस कदम हिप्पोकैम्पस cortical ऊतक के औसत दर्जे का सतह पर उजागर छोड़ देता है । इस कदम से आगे, एक लामिना फ्लो ऊतक संस्कृति हूड का उपयोग करें (पराबैंगनी निष्फल और ७०% इथेनॉल समाधान के साथ साफ) ।
  8. एक फ्लैट प्लास्टिक काट डिस्क के लिए बर्फ ठंडा विच्छेदन मध्यम लागू करें और, एक रंग का उपयोग कर, स्थिति है कि प्रांतस्था के औसत दर्जे की सतह का सामना करना पड़ रहा है और हिप्पोकैम्पस की धुरी काट ब्लेड की धुरी के लिए सीधा है डिस्क पर मस्तिष्क ऊतक ।
  9. एक ठीक टिप पाश्चर पिपेट का उपयोग कर काट डिस्क से विच्छेदन माध्यम से जितना संभव हो निकालें ।
  10. एक ५०% काट गति और बल पर एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग कर ४०० µm स्लाइस में मस्तिष्क में कटौती ।
    नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है कि इस कदम के रूप में जल्दी संभव के रूप में मस्तिष्क ऊतक विच्छेदन मध्यम में जलमग्न नहीं है किया जाता है ।
  11. विच्छेदन मध्यम ताजा बर्फ-ठंडा माध्यम के साथ सिलिकॉन elastomer-लेपित पेट्री डिश में बदलें ।
  12. एक बार ऊतक हेलिकॉप्टर समाप्त हो गया है, ध्यान से ताजा विच्छेदन मध्यम में मस्तिष्क के ऊतकों को जलमग्न, और एक सीधे ब्लेड स्केलपेल का उपयोग कर कटौती ऊतक ९० mm सिलिकॉन elastomer-लेपित पेट्री डिश को वापस हस्तांतरण ।
  13. एक stereomicroscope के तहत, ध्यान से cortical स्लाइस ठीक टिप संदंश का उपयोग कर अलग । प्रत्येक स्लाइस के लिए, आकृति विज्ञान और संभावित ऊतक नुकसान या टुकड़ा करने की क्रिया से जिसके परिणामस्वरूप के लिए हिप्पोकैम्पस का निरीक्षण किया ।
  14. hippocampi को entorhinal प्रांतस्था से और महीन टिप संदंश और छोटी Vannas कैंची का प्रयोग करके fimbria से अलग करें । सामांयतया, लगभग 6 से 8 हिप्पोकैम्पस स्लाइस प्रति गोलार्द्ध उत्पंन होते हैं ।
  15. एक ऊतक संस्कृति के लिए 6 हिप्पोकैम्पस स्लाइस स्थानांतरण एक कट पाश्चर पिपेट का उपयोग कर डालें और यह एक ३५ mm पेट्री डिश के अंदर जगह है । सुनिश्चित करें कि स्लाइसें कुछ मिलीमीटर के अलावा फैला रहे हैं (यह सुनिश्चित करेंगे कि प्रत्येक स्लाइस व्यक्तिगत रूप से imaged किया जा सकता है).
  16. तुरंत एक पेट्री डिश के नीचे करने के लिए बर्फ ठंडा "विकास मध्यम" जोड़ें, ऊतक संस्कृति डालने के तहत, बस ऊतक संस्कृति डालने के रिम के ऊपर नीचे ।
    नोट: वृद्धि मध्यम शामिल हैं ५०% न्यूनतम आवश्यक माध्यम ईगल, 25% हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान, 25% हार्स सीरम, 5 मिलीग्राम/एमएल डी-ग्लूकोज, 2 mmol/l l-glutamine, 1% एंटीबायोटिक-antimycotic सॉल्यूशन, और 10 mmol/l HEPES, titrated से पीएच ७.२ को सोडियम हीड्राकसीड के साथ ।
  17. विकास माध्यम को विच्छेदन के बाद दिन में बदलें और फिर हर 2 से 3 दिन बाद (३७ डिग्री सेल्सियस पर विकास माध्यम का उपयोग करें) । सुनिश्चित करें कि विकास माध्यम पर्याप्त मात्रा में जोड़ा गया है, लेकिन इतना नहीं है कि यह ऊतक संस्कृति डालने झिल्ली पर अधिक से अधिक है, जो ऊतक स्लाइस की व्यवहार्यता समझौता सकता है ।
  18. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में ऊतक स्लाइसें हवा में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 12 से 14 दिनों के लिए पहले प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा रहा रखने के लिए ।

2. प्रायोगिक विस्फोट TBI प्रोटोकॉल के लिए हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाइस की तैयारी

नोट: इस खंड के सभी कदम, इमेजिंग को छोड़कर, एक लामिना फ्लो टिशू कल्चर हुड में जगह ले ।

  1. एक 6 अच्छी तरह से थाली (एक अच्छी तरह से) में कस्टम बनाया स्टेनलेस स्टील के छल्ले डालें ।
    नोट: अंगूठियां एक पायदान के साथ एक रिम है (जो 12 बजे की स्थिति में बैठना चाहिए) और कुएं के अंदर आराम से फिट है, जबकि ऊतक संस्कृति आवेषण इस रिम में आसानी से फिट । यह सुनिश्चित करें कि छल्ले एक जीवाणुनाशक संक्रमित के साथ धोया जाता है, अच्छी तरह से शुद्ध पानी, autoclaved के साथ कुल्ला और अग्रिम में नीचे ठंडा करने की अनुमति दी ।
  2. पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) सीरम मुक्त "प्रयोगात्मक मध्यम" propidium आयोडाइड के साथ के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह भरें ।
    नोट: propidium आयोडाइड के साथ प्रयोगात्मक माध्यम है: ७५% न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल, 25% हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान, 5 मिलीग्राम/एमएल डी-ग्लूकोज, 2 mmol/l l-glutamine, 1% एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान, 10 mmol/l HEPES और ४.५ µmol/l propidium आयोडाइड, titrated पीएच सोडियम हीड्राकसीड के साथ ७.२ को ।
  3. सुनिश्चित करें कि मध्यम का स्तर रिंग के पायदान से ऊपर नहीं पहुंचता है । 1 घंटे के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि मध्यम ३७ डिग्री सेल्सियस पर तुरंत पहले ऊतक संस्कृति आवेषण स्थानांतरित कर रहे है के छल्ले के साथ 6 अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण ।
  4. ३५ mm पेट्री व्यंजन से organotypic स्लाइस के साथ टिशू कल्चर आवेषण को अंगूठा और संदंश के साथ प्रायोगिक माध्यम से 6-वेल प्लेट में ट्रांसफर करें ।
  5. एक स्थाई मार्कर कलम के साथ 3 बजे की स्थिति में डालने के रिम पर एक डॉट बनाओ ।
    नोट: आवेषण प्रयोग के दौरान 6 अच्छी तरह से प्लेट से हटा दिया जा करने के लिए जा रहे हैं और इस कदम सदमे लहर जोखिम के बाद अपनी मूल स्थिति को डालने लौटने की सुविधा और आसानी से प्रोटोकॉल भर में प्रत्येक स्लाइस का ट्रैक रखने के लिए.
  6. एक अद्वितीय नाम & तारीख के साथ प्रत्येक 6 अच्छी प्लेट लेबल और प्रत्येक थाली के कुओं का एक नक्शा बनाने, प्रत्येक अच्छी तरह (जैसे, ए, बी, सी, आदि) और प्रत्येक स्लाइस में एक अच्छी तरह से (जैसे, 1, 2, 3, आदि) का नामकरण, ताकि प्रत्येक स्लाइस एक अद्वितीय पहचानकर्ता है ( जैसे, A1, A2, A3, आदि).
  7. 1 h के लिए मशीन के लिए 6-अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए स्लाइसें इमेजिंग से पहले तुरंत ३७ ° c पर हैं ।
    नोट: मध्यम या ऊतक संस्कृति डालने झिल्ली, जो स्लाइस की व्यवहार्यता समझौता सकता है नीचे हवा के किसी भी बुलबुले के ओवरफ्लो से बचें ।
  8. प्रायोगिक माध्यम में स्थानांतरित करने के बाद 1 ज, छवि प्रत्येक टुकड़ा व्यक्तिगत एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (2x उद्देश्य, एनए ०.०६) एक उपयुक्त उत्तेजना (बीपी 535/50 एनएम) और उत्सर्जन (एल. पी. ६१० एनएम) के साथ फिट का उपयोग करने के लिए चोट से पहले स्लाइस स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए फ़िल्टर प्रोटोकॉल किया जाता है ।
    नोट: स्लाइसें कि इस स्तर पर घने लाल दाग के प्रदर्शन क्षेत्रों समझौता व्यवहार्यता वर्तमान पर विचार किया जाना चाहिए और आगे विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए (इन आम तौर पर उत्पंन स्लाइस की कुल संख्या के 10% से भी कम प्रतिनिधित्व) । सुनिश्चित करें कि इमेजिंग एक अनुक्रमिक तरीके से किया जाता है और के रूप में तेजी से संभव के रूप में समय है कि स्लाइसें मशीन के बाहर है कम करने के लिए (आमतौर पर 6 कुओं बस के तहत ले जाना चाहिए 30 छवि के लिए मिनट) ।
  9. 6-खैर प्लेट का ढक्कन हर समय चालू रखें । कुछ संघनित्र ढक्कन के अंदर पर निर्माण हो सकता है । यदि ऐसा होता है, संक्षेप में कम सेटिंग पर एक हेअर ड्रायर का उपयोग करें ।
  10. यह सुनिश्चित करें कि सभी इमेजिंग स्थितियां विभिंन दिनों और प्रयोगों के बीच समान हों ।
    नोट: इमेजिंग के उद्देश्य ऊतक प्रतिदीप्ति यों तो है, इसलिए इस कदम के परिणाम के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और डेटा की तुलना प्राप्त की अनुमति है ।

3. डुबकी और हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाइस के साथ ऊतक संस्कृति आवेषण के परिवहन

  1. इमेजिंग के तुरंत बाद, एक लामिना प्रवाह हूड में, एक ऊतक संस्कृति डालने के बाहर 6 अच्छी तरह से संदंश का उपयोग कर प्लेट ।
  2. ध्यान से एक बाँझ पॉलीथीन बैग (3 "x 5") पूर्व-गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) प्रयोगात्मक माध्यम हौसले से ९५% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ bubbled की 20 मिलीलीटर के साथ भर में डालने के हस्तांतरण ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड समृद्ध प्रयोगात्मक मध्यम ९५% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड एक scintered-कांच एक Dreschel बोतल के अंदर bubbler का उपयोग और एक अंदर बाँझ पॉलीथीन बैग में स्थानांतरित के साथ कम से ४० मिनट के लिए bubbled था लामिना प्रवाह ऊतक संस्कृति हूड एक 20 मिलीलीटर एक जीवाणु फिल्टर और एक बाँझ भरने ट्यूब (१२७ mm) संलग्न के साथ सिरिंज का उपयोग कर । बैग तुरंत सील और ऊतक संस्कृति डालने के हस्तांतरण से पहले उंहें एक ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए कम से 1 ज के लिए स्थानांतरण ।
  3. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक बाँझ बैग सही ढंग से (थाली और अच्छी तरह से पहचान के साथ) बला है. प्रत्येक ऊतक संस्कृति डालने के लिए इस कदम को दोहराएँ । (बैग के शीर्ष घुमा द्वारा सुरक्षित रूप से किया और एक प्लास्टिक दबाना लागू करके) बाँझ बैग सील पर ध्यान से हवा के बुलबुले को बाहर निकालें ।
  4. ऊतक संस्कृति आवेषण और 6-३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में प्रयोगात्मक माध्यम के साथ अच्छी तरह से प्लेटों के साथ बाँझ बैग लौटें ।
  5. 1 घंटे के बाद, ध्यान से एक थर्मामीटर के अंदर प्लास्टिक बक्से में ऊतक संस्कृति आवेषण के साथ बाँझ बैग पैक-३७ ° c पर de-जल के साथ भरा बॉक्स-के लिए सदमे लहर जोखिम भर में शारीरिक तापमान पर organotypic स्लाइस रखने के लिए प्रोटोकॉल.

4. शॉक ट्यूब और हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाइस शॉक वेव जोखिम की तैयारी

  1. स्टील-पैर की अंगुली सुरक्षात्मक जूते, एक प्रयोगशाला कोट और सदमे ट्यूब की तैयारी और सदमे लहर जोखिम के दौरान दस्ताने पहनते हैं ।
  2. बोल्ट बाहर निकला हुआ किनारा झटका ट्यूब के लिए बाँझ बैग धारक फ्रेम, यह सुनिश्चित करना है कि केंद्रीय छेद सदमे ट्यूब आउटलेट (एक खाली रॉड का उपयोग) के साथ गठबंधन है ।
  3. माउंट दो दबाव ट्रांसड्यूसर रेडियल: सेंसर 1, संचालित अनुभाग के मध्य भाग में और 2 संवेदक सदमे ट्यूब के बाहर निकला हुआ किनारा में (आंकड़ा 1a). किसी वर्तमान स्रोत पावर इकाई के माध्यम से किसी आस्टसीलस्कप पर दबाव ट्रांसड्यूसर कनेक्ट करें ।
  4. सुनिश्चित करें कि सभी सदमे ट्यूब जारी वाल्व और प्रवाह नियंत्रण बंद कर रहे हैं ।
  5. बाहरी संपीड़ित एयर लाइन खोलें और २.५ पट्टी करने के लिए solenoid वाल्व चार्ज ।
  6. संकुचित एयर सिलिंडर सेफ्टी वॉल्व को खोलें और धीरे से लगभग 5 बार प्रेशर बढ़ाने के लिए प्रेशर रेगुलेटर खोलें ।
    नोट: दबाव इस नियामक के लिए सेट उच्चतम डायाफ्राम फट दबाव से थोड़ा ऊपर होना चाहिए ।
  7. 10 x 10 सेमी2 चौकों में 23 µm-मोटी पॉलिएस्टर शीट्स काटने से डायाफ्राम तैयार करते हैं । आटोक्लेव टेप का उपयोग कर संभालती है और उंहें ऊपर और प्रत्येक डायाफ्राम के नीचे चिपके तैयार करते हैं ।
  8. स्थिति एक डायाफ्राम (डबल ब्रीच-एकल डायाफ्राम विंयास के एकल स्लॉट) या दो डायाफ्राम (डबल ब्रीच-डबल डायाफ्राम विंयास के दोनों स्लॉट) ब्रीच (आंकड़ा 1b) में ।
  9. डायाफ्राम केंद्र, और उंहें चार M24 बोल्ट और पागल का उपयोग कर दबाना, उंहें एक तिरछे सममित तरीके से क्रमिक रूप से जकड़ना, और यह सुनिश्चित करना है कि डायाफ्राम शिकन मुक्त हैं ।
  10. प्रत्येक बाँझ बैग व्यक्तिगत रूप से धारक फ्रेम पर ऊर्ध्वाधर स्थिति में दबाना, यह सुनिश्चित करना कि organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस के साथ ऊतक संस्कृति आवेषण की सतह सदमे ट्यूब आउटलेट का सामना करना पड़ रहा है और ऊतक संस्कृति डालने बाँझ के अंदर केंद्रित है बैग (फिगर 1C). सुनिश्चित करें कि बाँझ बैग सुरक्षित सभी के आसपास clamped है फर्म और भी स्थिरीकरण सुनिश्चित करते हैं ।
  11. शॉक ट्यूब दबाव जब कान रक्षकों और सुरक्षा तमाशा पहनते हैं । वर्तमान स्रोत विद्युत इकाई पर स्विच करें और सदमे वेव डेटा प्राप्त करने के लिए आस्टसीलस्कप (५० मेगा नमूनों की प्राप्ति दर, रिकॉर्ड लंबाई 20 ms, १,०००,००० अंक) और बंद solenoid वाल्व ।
  12. सदमे ट्यूब नियंत्रण कक्ष पर प्रवाह नियंत्रण घुंडी का उपयोग करना, धीरे दबाव एकल डायाफ्राम विंयास के लिए सदमे ट्यूब के चालक मात्रा अनुभाग या दोनों चालक मात्रा अनुभाग और डबल डायाफ्राम के लिए सदमे ट्यूब के डबल ब्रीच अनुभाग का प्रयोग कॉन्फ़िगरेशन.
    नोट: एकल डायाफ्राम विंयास के लिए, फट दबाव केवल डायाफ्राम सामग्री और मोटाई पर निर्भर करेगा और डायाफ्राम अनायास टूटना होगा एक बार सामग्री को फोड़ा दबाव तक पहुंच गया है । डबल डायाफ्राम विंयास के लिए, फोड़ा दबाव भी दोनों ड्राइवर और डबल ब्रीच कक्षों में गैस दबाव अंतर पर निर्भर करेगा और, डायाफ्राम के लिए एक नियंत्रित तरीके से फट करने के लिए, डबल ब्रीच सुरक्षा वाल्व मैंयुअल रूप से एक बार खोला है लक्ष्य के दबाव में पहुंच जाते हैं ।
  13. जैसे ही डायाफ्राम टूटना (एक जोर शोर उत्पादन), जल्दी से प्रवाह घुंडी का उपयोग कर संपीड़ित हवा के प्रवाह को बंद करें और solenoid वाल्व खुला ।
    नोट: चालक अनुभाग की कुल मात्रा रिक्त क्षेत्रों की प्रविष्टि द्वारा संशोधित किया जा सकता है, की अनुमति सदमे लहर चोटी अधिक दबाव और अवधि के एक व्यापक रेंज प्राप्त किया जा करने के लिए । सदमे तरंग मापदंडों के आदर्श संयोजन ऊतक चोट का कारण है, लेकिन इतना अधिक नहीं है कि यह ऊतक संस्कृति डालने या बाँझ बैग विरूपण या टूटना का कारण बनता है करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए ।
  14. एक ऊतक संस्कृति डालने के लिए एक एकल झटका ट्यूब लहर के साथ प्रत्येक बाँझ बैग बेनकाब और यह एक नया बाँझ बैग से पहले थर्मामीटरों विनियमित बॉक्स के लिए तुरंत वापस बॉक्स से लिया जाता है और धारक फ्रेम पर clamped. सुनिश्चित करें कि 4.10-4.14 कदम के रूप में सुचारू रूप से और तेजी से संभव के रूप में प्रदर्शन कर रहे है (कुछ ही मिनटों के भीतर) को रोकने के प्रायोगिक माध्यम ठंडा नीचे, तापमान के रूप में ३७ डिग्री सेल्सियस से नीचे की चोट के विकास के साथ हस्तक्षेप
  15. एक बार सभी ऊतक संस्कृति आवेषण एक सदमे की लहर को उजागर किया गया है (या अन्तर्वासना प्रोटोकॉल), मूल 6 के लिए ऊतक संस्कृति आवेषण वापसी-अच्छी तरह से प्लेट और उनके संबंधित अच्छी तरह से (एक लामिना फ्लो टिशू कल्चर हुड के अंदर) और मशीन के लिए वापस ।
  16. ३७ डिग्री सेल्सियस पर हवा में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मशीन में 6 अच्छी तरह से थाली रखें आगे इमेजिंग जब तक ।
  17. प्रत्येक प्रयोग के लिए, एक साथ स्लाइस शॉक वेव एक्सपोजर के लिए अन्तर्वासना नियंत्रणों को शामिल करें ।
    नोट: अन्तर्वासना स्लाइस एक सदमे की लहर को उजागर स्लाइस करने के लिए हूबहू इलाज कर रहे हैं (प्रयोगात्मक माध्यम के साथ बाँझ बैग में बंद, एक ही थर्मामीटरों में सदमे ट्यूब प्रयोगशाला में ले जाया-विनियमित बॉक्स और के एक समकक्ष अवधि के लिए धातु फ्रेम पर निलंबित समय) लेकिन शॉक ट्यूब निकाली नहीं जाती है ।

५. हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाईस इंजरी ठहराव

  1. 24 h, ४८ h और ७२ h पर, छवि चरण २.८ और २.९ में वर्णित के रूप में स्लाइस ।
  2. ७२ पर इमेजिंग के बाद एच पोस्ट सदमे लहर प्रदर्शन, स्थानीय जैविक अपशिष्ट प्रोटोकॉल के बाद ऊतक त्यागें और शुद्ध और धातु के छल्ले आटोक्लेव ।

Representative Results

इस विधि में इस्तेमाल सदमे ट्यूब Friedlander समारोह7,8द्वारा मॉडलिंग वास्तविक जीवन खुला क्षेत्र विस्फोट अनुकरण कि अधिक दबाव यात्रियों की पीढ़ी की अनुमति देता है । ४४० मी (मच १.३) के वेग के साथ सुपरसोनिक आश्चर्य (चित्रा 2a) प्राप्त किया गया । तरंग डेटा रिपोर्ट संवेदक 2 से है, सदमे ट्यूब के संचालित खंड के अंत में रेडियल तैनात ।

प्रोटोकॉल का उपयोग ऊपर वर्णित है, organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस एक सदमे की लहर को उजागर संस्कृतियों (चित्रा 2a) महत्वपूर्ण चोट quantified propidium आयोडाइड, एक उच्च ध्रुवीय फ्लोरोसेंट डाई है कि केवल कोशिकाओं के साथ प्रवेश का उपयोग कर विकसित समझौता सेलुलर झिल्ली24,25 (चित्रा बी, सी) ।

यहां तक कि इष्टतम शर्तों के तहत, और अंय OHSC प्रकाशित मॉडल21,22के अनुरूप, वहां पृष्ठभूमि propidium आयोडाइड प्रतिदीप्ति कारण, भाग में, मामूली नुकसान अंतर्निहित ऊतक जोड़तोड़ से उत्पंन की एक निंन स्तर है ( जैसे संस्कृति अवधि के दौरान मीडिया परिवर्तन या इमेजिंग के लिए मशीन से हटाने के रूप में) । इस विस्फोट TBI प्रोटोकॉल पर्याप्त हेरफेर है कि मध्यम में बाँझ बैग और सदमे लहर जोखिम प्रोटोकॉल के दौरान हैंडलिंग के एक काफी डिग्री के अंदर स्लाइस के डुबकी भी शामिल शामिल है (जैसे, के लिए बाँझ बैग clamping धारक फ्रेम) । हालांकि, अगर सभी चरणों का ध्यान से प्रदर्शन कर रहे हैं, इस अतिरिक्त हेरफेर OHSC के अंतर्निहित स्वास्थ्य पर प्रभाव नहीं है के रूप में कोई महत्वपूर्ण अंतर के रूप में 6-अच्छी तरह से प्लेटों में रखा स्लाइस का एक नियंत्रण समूह के बीच देखा गया हर समय (यानी, आवेषण जलमग्न या संभाला नहीं थे) और शर्म की बात है, जो स्लाइस है कि बाँझ बैग सदमे ट्यूब (चित्रा बी) के लिए clamped अंदर जलमग्न शामिल थे ।

दो सदमे तरंगों चुना, ५० केपीए पर और ५५ केपीए पीक दबाव, भरपुर उत्पादन (पी < 0.05 और पी < 0.0001, क्रमशः) और reproducible चोट जब विस्फोट जोखिम के बाद सभी समय-अंक में घायल अन्तर्वासना स्लाइस की तुलना में प्रोटोकॉल (चित्रा बी) ऊतक संस्कृति आवेषण या बाँझ बैग को किसी भी क्षति के कारण के बिना । आदेश में शिखर-अधिक दबाव में छोटे मतभेदों को मॉडल की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए, हम मान है कि ~ 10% से अलग थे का चयन करने का फैसला किया । इन परिणामों को भी पता चलता है कि, के रूप में की उंमीद है, चोट ५५ केपीए से जिसके परिणामस्वरूप एक ५० केपीए सदमे की लहर के बाद से अधिक है ।

डेटा मतलब का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । महत्व होल्म-Sidak पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग करते हुए प्रसरण का एक 2-तरीका दोहराया उपाय विश्लेषण का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था । फैक्टर 1 समूह था (नियंत्रण, शम, विस्फोट) और 2 कारक चोट के बाद समय था (-1 एच, 24 एच, ४८ एच और ७२ एच), जहां 1 फैक्टर दोहराया कारक था । एकाधिक तुलना के लिए p मान का समायोजन उपयोग किया गया था । P मान से कम ०.०५ समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर इंगित करने के लिए लिया गया था । सांख्यिकीय परीक्षणों एक रेखांकन और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर लागू किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: बाँझ बैग धारक फ्रेम के साथ सदमे ट्यूब डिवाइस की योजनाबद्ध । (). शॉक ट्यूब एक ३.८ मीटर लंबे समय स्टेनलेस स्टील ट्यूब, तीन १.२२ मीटर लंबे वर्गों से बना है, गैसकेट और निकला हुआ किनारा से जुड़ा हुआ है, ५९ मिमी के एक आंतरिक व्यास के साथ. (ख) इनसेट डबल ब्रीच विधानसभा से पता चलता है । एक या दो Mylar डायाफ्राम रबर ओ-छल्ले द्वारा प्रदान की मुहर के साथ विधानसभा में clamped किया जा सकता है । () बाँझ बैग धारक फ्रेम । फ्रेम के शरीर एक केंद्रित परिपत्र छेद (५९ mm व्यास) है कि सदमे ट्यूब आउटलेट के साथ संरेखित के साथ दो धातु प्लेटों के होते हैं । दो मेटल प्लेट्स के बीच सिलिकॉन elastomer के दो पतले (4 एमएम) चादरें फिट की गई हैं । इन चादरों का उद्देश्य बाँझ बैग दबाना करने के लिए एक भी और गैर फिसलन सतह प्रदान करने के लिए है । बैग और शॉक ट्यूब के आउटलेट के बीच की दूरी 7 सेमी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

Figure 2
चित्रा 2: ठेठ shockwave और organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों में जिसके परिणामस्वरूप चोट । (एक) सदमे लहर का प्रतिनिधि उदाहरण 23 µm-मोटी पॉलिएस्टर फिल्म, २.१६ बार फट दबाव, ५५ केपीए पीक दबाव, ०.४ एमएस सकारात्मक लहर अवधि, १०.१ केपीए · ms आवेग का उपयोग कर प्राप्त की । तरंग डेटा 2 सेंसर से प्राप्त कर रहे थे रेडियल झटका ट्यूब संचालित अनुभाग के बाहर निकला हुआ किनारा पर घुड़सवार. सदमे तरंग वेग ४४० मी (मच १.३) था । () चोट के विकास के सदमे की लहर की तीव्रता के लिए आनुपातिक है । दोनों ५० केपीए और ५५ केपीए पीक दबाव सदमे तरंगों महत्वपूर्ण चोट है कि ७२ एच प्रोटोकॉल भर में विकसित किया जब शम समूह के साथ तुलना में कारण । एक ५५ केपीए पीक दबाव लहर जोखिम से उत्पंन चोट से काफी अधिक था ५० केपीए के बाद ४८ एच और ७२ एच. अन्तर्वासना स्लाइसें में हूबहू इलाज किया गया लेकिन सदमे ट्यूब नहीं निकाल दिया गया था । नियंत्रण स्लाइसें किसी भी हेरफेर के बिना एक मशीन में 6 अच्छी तरह से प्लेटों में बनाए रखा गया । पट्टियां मतलब मान और त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटियां है (n = 7, नियंत्रण; n = ४८, शम; n = 30, विस्फोट ५० केपीए; n = ५१, विस्फोट ५५ केपीए; n = स्लाइस की संख्या, 6 अलग प्रयोगों से) । * p < 0.05, * * * *p < 0.0001 की तुलना में अन्तर्वासना. # p < 0.05, # #p < 0.01 ब्लास्ट ५५ केपीए के साथ तुलना में । () प्रतिनिधि propidium आयोडाइड प्रतिदीप्ति से organotypic स्लाइस की छवियां (i) शम, (ii) विस्फोट ५० केपीए और (iii) विस्फोट ५५ केपीए समूहों में चोट के बाद ७२ ज. अन्तर्वासना स्लाइस प्रतिदीप्ति के निम्न स्तर, यानी, चोट, और विस्फोट उजागर स्लाइसें फैलाना चोट के उच्च स्तर दिखाने के लिए, और अधिक स्पष्ट ५५ केपीए चोटी दबाव उजागर स्लाइस (स्केल बार = ५०० µm) पर दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

विस्फोट TBI (प्राथमिक, माध्यमिक और तृतीयक ब्लास्ट चोट तंत्र) के साथ जुड़े चोट के सभी तंत्र के अलावा, प्राथमिक विस्फोट चोट आघात विस्फोट करने के लिए अद्वितीय है और यह विस्फोट से संबंधित1,2 तंत्र की कम से समझ है . उपंयास प्रोटोकॉल यहां वर्णित प्राथमिक विस्फोट TBI का अध्ययन करने के लिए एक खुली समाप्त सदमे ट्यूब का उपयोग करने के लिए इन विट्रो माउस हिप्पोकैम्पस टुकड़ा संस्कृतियों एक सदमे की लहर के लिए एक सरल और तेजी से प्रोटोकॉल है कि एक reproducible के निर्माण की अनुमति देता है का उपयोग कर विकसित किया गया था एक उच्च प्रवाह के साथ प्राथमिक विस्फोट TBI ।

इन विट्रो में पहले प्राथमिक विस्फोट TBI मॉडल26,27कोशिकाओं को हीड्रास्टाटिक दबाव तरंगों लागू । हालांकि, दबाव उत्पादन मॉडल नहीं था Friedlander समारोह एक हीड्रास्टाटिक दबाव पल्स की अवधि के रूप में बहुत हवाई विस्फोट से अधिक लंबे समय तक था दबाव लहरें13. विशेषता Friedlander समारोह एक सदमे ट्यूब1,8का उपयोग कर प्रयोगशाला में आसानी से मॉडलिंग की जा सकती है । सदमे ट्यूब एक पारंपरिक प्रयोगशाला वातावरण में वास्तविक जीवन खुला क्षेत्र विस्फोट अनुकरण कि सदमे तरंगों का उत्पादन कर सकते हैं, इस तरह के चोटी के दबाव के रूप में तरंग मापदंडों, की सटीक नियंत्रण की अनुमति, सकारात्मक लहर अवधि और आवेग, अलग से डायाफ्राम सामग्री और मोटाई, और चालक मात्रा8,28,29

सरल इन विट्रो मॉडल जैसे सेल संस्कृतियों आमतौर पर सेल प्रकार और synaptic कनेक्टिविटी30के विविधता की कमी है । हाल ही में, इन विट्रो में ब्लास्ट का असर ब्रेन सेल ' spheroids ' के विभिन्न सेल प्रकारों को शामिल करते हुए31जांच की गई है. इन रोचक तैयारी की आगे की जांच योग्यता है; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे उनके सेलुलर संगठन और कनेक्टिविटी बरकरार मस्तिष्क दर्पण । OHSC एक अच्छी तरह से स्थापित इन विट्रो प्रयोगात्मक मॉडल23,३२, संस्कृति के लिए आसान कर रहे हैं और उनके तीन आयामी ऊतक cytoarchitecture, कोशिका भेदभाव और synaptic कनेक्टिविटी अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं और बहुत इसी तरह वीवो में३३,३४,३५,३६ OHSCs सेल संस्कृति और vivo मॉडल23,३२ में एक के बीच जटिलता के एक मध्यवर्ती स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं । OHSCs इन विट्रो रोग neurodegenerative में vivo मॉडल में देखा गया है और बहुत ही उपयोगी है संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाओं की स्क्रीनिंग में और उनके तंत्र को समझने में पुन: पेश करने के लिए प्रदर्शन किया गया है कार्रवाई17,21,22,३७,३८। अंत में, शारीरिक क्षेत्र का अध्ययन किया, हिप्पोकैम्पस, शोधों TBI अध्ययनों में अत्यधिक प्रासंगिक है, क्योंकि यह क्षेत्र अक्सर TBI रोगियों३९,४०,४१में क्षतिग्रस्त हो जाता है । OHSC मॉडल विस्फोट TBI28,४२,४३,४४के लिए इस्तेमाल किया गया है, तथापि, हमारे मॉडल अपेक्षाकृत सरल है और या तो क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर में मौजूदा सदमे ट्यूब के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जटिल रूपांतरों के बिना विन्यास ।

OHSC कई दिनों के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है, जो समय३४के साथ जैविक प्रक्रियाओं की जांच की सुविधा । इस मॉडल में, ऊतक चोट है कि सदमे लहर जोखिम से हुई दैनिक तीन दिनों में मापा गया था, विस्फोट propidium आयोडाइड, सेल क्षति की एक अच्छी तरह से स्थापित मार्कर का उपयोग कर जोखिम के बाद । Propidium आयोडाइड एक विषैला उच्च ध्रुवीय डाई कि समझौता सेलुलर झिल्ली, जहां यह न्यूक्लिक एसिड को बांध और एक विशेषता चमकदार लाल प्रतिदीप्ति24,25,४५के साथ कोशिकाओं में प्रवेश है । प्रतिदीप्ति propidium आयोडाइड के साथ मापा घायल सेल Nissl धुंधला४६,४७का उपयोग कर गिनती के साथ एक अच्छा संबंध है दिखाया गया है ।

यह देखते हुए कि इस मॉडल में उत्पादित चोट फैलाना (चित्रा 2c) था, पूरे टुकड़ा के प्रतिदीप्ति जब विश्लेषण, अंय मस्तिष्क चोट मानदंड में पहले प्रकाशित काम के समान प्रदर्शन कर मापा गया था21,22 , के बजाय विशिष्ट क्षेत्रों का उपयोग कर के, के रूप में अंय इन विट्रो ब्लास्ट TBI मॉडल में किया गया है28,४३,४४,४८। वैश्विक दृष्टिकोण इस लेख में वर्णित मॉडल में इस्तेमाल भी संभावित परिवर्तनशीलता है कि जब ब्याज की परिभाषित क्षेत्रों रूपरेखा और विस्फोट से संबंधित चोट की एक और अधिक व्यापक तस्वीर प्रदान करता है पेश किया है समाप्त । दोनों सदमे लहर पीक दबाव, ५० केपीए और ५५ केपीए, भरपुर उत्पादन (पी < 0.05 और पी < 0.0001, क्रमशः) चोट जब अन्तर्वासना स्लाइस की तुलना में (चित्रा 2बी) । के रूप में प्रत्याशित, उच्चतम शिखर दबाव, ५५ केपीए के साथ सदमे की लहर, ५० केपीए वेव से अधिक चोट का उत्पादन किया । में एक इन विट्रो में अलग मस्तिष्क ऊतक के साथ मॉडल सीधे एक shockwave के संपर्क में, कैसे करने के लिए सही पैमाने पर पूरे जीव या एक इंसान सीधा नहीं है. फिर भी, आश्चर्य हम इस्तेमाल पीक क्षेत्र में मनाया दबाव की सीमा के भीतर हैं, आमतौर पर 50-1000 केपीए8,४९

आदेश में शारीरिक तापमान और ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के स्तर को उजागर OHSC बनाए रखने के लिए, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि वे सदमे लहर जोखिम प्रोटोकॉल भर में संदूषण से मुक्त थे, ऊतक संस्कृति आवेषण बाँझ में बंद कर दिया गया एक अपूतित तकनीक के बाद पॉलीथीन बैग, प्रयोगात्मक मध्यम में जलमग्न ३७ ° c को गर्म और हौसले से ९५% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड, इसी तरह से पहले प्रकाशित काम के साथ bubbled28,४३,४४ ,४८. इन मॉडलों के विपरीत जहां जटिल उपकरणों के झटके लहर जोखिम के दौरान बाँझ बैग पकड़ करते थे, इस प्रोटोकॉल में, एक सरल और तेजी से विधि सदमे ट्यूब आउटलेट के सामने OHSC ऊतक संस्कृति आवेषण निलंबित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (आंकड़ा 1a, सी ). इस पत्र में वर्णित मॉडल तेजी से प्रसंस्करण और उच्च प्रवाह, जबकि हाइपोथर्मिया के जोखिम को कम करने की अनुमति देता है । इन पहलुओं neuroprotection अध्ययनों के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है कि कुछ चिकित्सीय हस्तक्षेप TBI के बाद संभावित आवेदन की एक बहुत ही सीमित समय खिड़की हो सकता है । इस उपंयास सदमे लहर जोखिम प्रोटोकॉल 6 से 9 ऊतक संस्कृति आवेषण (आमतौर पर ३६ के लिए ५४ हिप्पोकैम्पस organotypic ऊतक स्लाइसें) की अनुमति देता है समय की एक छोटी अंतराल में एक सदमे की लहर से अवगत कराया (लगभग 1 ज) ।

OHSCs भर अच्छा अपूतित तकनीक की आवश्यकता है । यह संवर्धन भर में एक अपूतित लामिना प्रवाह हुड का उपयोग करें और जब विस्फोट के लिए बाँझ बैग को स्थानांतरित करने के लिए महत्वपूर्ण है । आदेश में 6 के ढक्कन के साथ अपूतित शर्तों के तहत स्लाइस इमेजिंग बाहर ले जाने के लिए जगह में अच्छी तरह से प्लेटें, हम कस्टम धातु के छल्ले का उपयोग करने माइक्रोस्कोप के फोकल विमान के लिए सेल संस्कृति आवेषण बढ़ा । हमारे प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है कि हम हर प्रयोग में घायल अन्तर्वासना स्लाइस शामिल हैं । अन्तर्वासना स्लाइस करने वाले अपवादों के साथ स्लाइस ब्लास्ट करने के लिए हूबहू इलाज किया जाता है जिससे शॉक-ट्यूब नहीं निकाली जाती; एक और महत्वपूर्ण कदम यह है कि सभी स्लाइस चोट या शम उपचार से पहले 1 ज imaged कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि इस्तेमाल किया स्लाइस की जनसंख्या के स्वास्थ्य समान है (आंकड़ा 2 बी) ।

समय के साथ स्लाइस में कोशिका चोट को बढ़ाता है के अलावा, ऊतक पारंपरिक immunohistochemistry५०के लिए प्रयोग के अंत में तय किया जा सकता है । हम विकसित और माउस हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग कर विधि का मूल्यांकन किया । हालांकि, हमारी तकनीक को आसानी से अंय ऊतक कि संस्कृति में विकसित किया जा सकता है, ऐसे रीढ़ की हड्डी, रेटिना, फेफड़े या उपकला ऊतक के रूप में उपयोग अनुकूलित किया जा सकता है । इस अखबार और मॉडल के साथ हमारे पिछले काम में, हम केवल एक ही विस्फोट करने के लिए जोखिम के प्रभाव की जांच की । हालांकि, मॉडल अच्छी तरह से मस्तिष्क या अंय ऊतकों पर दोहराया कम स्तर के विस्फोटों के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूल होगा । OHSCs कई हफ्तों या महीनों के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है, पुराने प्रभाव की अनुमति की जांच की जा ।

इन विट्रो मॉडल में , विवो मॉडल की तुलना में सरल किया जा रहा है, एक उच्च प्रवाह है, कम खर्चीले हैं और प्रयोगों आमतौर पर एक कम समय पैमाने17पर पूरा किया जा सकता है. हालांकि, इन विट्रो मॉडल में का उपयोग कर प्राप्त परिणामों को पशु मॉडलों में के रूप में मांय किया जाना चाहिए इन विट्रो प्रसंस्कृत ऊतकों एक कृत्रिम वातावरण में रखा जाता है और क्या वे vivo17में होगा से अलग चोट का जवाब हो सकता है । बहरहाल, इन विट्रो मॉडल में बहुत मूल्यवान है मस्तिष्क चोट झरने की हमारी समझ को बढ़ाने में और न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाओं स्क्रीनिंग में अधिक जटिल के उपयोग से पहले vivo मॉडल17,22 , ५१ , ५२. इस मॉडल द्वारा की पेशकश की कई फायदों के बावजूद, यह महत्वपूर्ण है कि इन विट्रो मॉडल में जानवरों में और vivo मॉडल में वर्तमान TBI की प्रमुख विशेषताओं की कमी है, जैसे संवहनी प्रणाली पर प्रभाव, बढ़ी हुई intracranial दबाव, प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और कार्यात्मक व्यवहार हानि, जो करने के लिए पूरे जानवर में इन विट्रो मॉडल में पाया परिणाम को मांय करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया । फिर भी, इन विट्रो मॉडल के रूप में इस पत्र में वर्णित मॉडल अत्यंत उपयोगी अनुवाद प्रासंगिक वैज्ञानिक उपकरण हैं ।

अंत में, इस काम का वर्णन एक सरल और सीधा उपंयास विधि जहां माउस organotypic हिप्पोकैम्पस ऊतक संस्कृतियों कसकर नियंत्रित और reproducible वास्तविक जीवन प्रासंगिक सदमे तरंगों को एक प्रयोगशाला सदमे ट्यूब का उपयोग कर उजागर कर रहे हैं । परिणामस्वरूप वैश्विक चोट है, जो propidium आयोडाइड, कोशिका क्षति की एक अच्छी तरह से स्थापित मार्कर का उपयोग कर quantified था, बहुत reproducible है और लागू सदमे तरंगों के शिखर दबाव के लिए आनुपातिक है ।

Disclosures

लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

Acknowledgments

द्वारा समर्थित: रॉयल सेंटर फॉर डिफेंस मेडिसिन, बर्मिंघम, यूनाइटेड किंगडम, रॉयल ब्रिटिश सेना केंद्र ब्लास्ट इंजरी अध्ययन के लिए, इंपीरियल कॉलेज लंदन, यूनाइटेड किंगडम । आयुर्विज्ञान अनुसंधान परिषद्, लंदन, युनाइटेड किंग्डम (MC_PC_13064; श्री N027736/ गैस सुरक्षा ट्रस्ट, लंदन, यूनाइटेड किंगडम । रीता Campos-Pires Fundação पैरा ए Ciência ई ए Tecnologia, लिस्बन, पुर्तगाल से डॉक्टरेट प्रशिक्षण पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था । केटी हैरिस वेस्टमिंस्टर मेडिकल स्कूल रिसर्च ट्रस्ट, लंदन, यूनाइटेड किंगडम से एक पीएचडी के छात्र के प्राप्तकर्ता था ।

इंपीरियल कॉलेज में रॉयल ब्रिटिश सेना सेंटर फॉर ब्लास्ट इंजरी स्टडीज (RBLCBIS) के सहयोग से यह मॉडल विकसित किया गया था । हम रॉयल ब्रिटिश सेना की वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं । सहयोग या आगे विस्तार में रुचि शोधकर्ताओं लेखकों या RBLCBIS संपर्क कर सकते हैं ।

हम डॉ अमरजित समरा, अनुसंधान के निदेशक, रक्षा चिकित्सा, बर्मिंघम, यूनाइटेड किंगडम के लिए रॉयल सेंटर, इस काम के समर्थन के लिए, स्कॉट आर्मस्ट्रांग, सर्जरी के विभाग & कैंसर, इंपीरियल कॉलेज लंदन, प्रारंभिक प्रयोगों के साथ सहायता के लिए धन्यवाद , Theofano Eftaxiopolou, हरि अरोरा & लूज Ngoc गुयेन, इंजीनियरिंग इंपीरियल कॉलेज लंदन के विभाग, & विलियम गर्व, भौतिकी इंपीरियल कॉलेज लंदन के विभाग, सदमे पर सलाह के लिए-ट्यूब, रक़ील Yustos, अनुसंधान तकनीशियन, विभाग जीवन विज्ञान के, इंपीरियल कॉलेज लंदन, तकनीकी सहायता के लिए, पॉल ब्राउन MBE, कार्यशाला प्रबंधक और स्टीव नेल्सन, कार्यशाला तकनीशियन, भौतिकी विभाग, इंपीरियल कॉलेज लंदन, धातु के छल्ले बनाने के लिए, भौतिकी विभाग के नील पॉवेल, शाही कॉलेज लंदन, कलाकृति के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geys balanced salt solution Sigma UK G9779
D-glucose Sigma UK G8270
Antibiotic/antimycotic Sigma UK A5955
Minimum essential medium Eagle Sigma UK M4655
Hanks balanced salt solution Sigma UK H9269
Horse serum Sigma UK H1138
L-glutamine Sigma UK G7513
HEPES VWR Prolabo, Belgium 441476L
Sodium hydroxide Sigma UK S-0945
Tissue culture inserts Millicell CM 30 mm low height Millipore PICM ORG 50
6-well plates NUNC, Denmark 140675
Propidium iodide Sigma UK P4864
Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags Fisherbrand 01-002-30
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127 mm) Smiths Medical Supplies E910
Epifluorescence microscope NIKON Eclipse 80i, UK
Microscope objective Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Microscope filter Nikon G-2B (longpass emission)
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm RS Components UK 785-0782
Pressure transducer Dytran Instruments Inc. 2300V1
Tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. Mcllwain tissue chopper
Silicone elastomer Dow Corning, USA Sylgard 184
Graphing & statistics software GraphPad Software, USA Prism 7.0

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एक उपंयास <em>में इन विट्रो</em> मॉडल विस्फोट के दर्दनाक मस्तिष्क चोट
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Campos-Pires, R., Yonis, A., Macdonald, W., Harris, K., Edge, C. J., Mahoney, P. F., Dickinson, R. A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (142), e58400, doi:10.3791/58400 (2018).More

Campos-Pires, R., Yonis, A., Macdonald, W., Harris, K., Edge, C. J., Mahoney, P. F., Dickinson, R. A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (142), e58400, doi:10.3791/58400 (2018).

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