本文介绍了一种新的原发性爆炸创伤性脑损伤模型。压缩空气驱动的激波管被用来暴露在体外小鼠海马切片培养器的单个冲击波。这是一个简单而快速的协议, 产生可重复的脑组织损伤, 具有较高的吞吐量。
创伤性脑损伤是军事和平民死亡和残疾的主要原因。爆炸创伤性脑损伤是爆炸装置爆炸造成的, 然而, 爆炸超压暴露造成的脑损伤背后的机制并不完全了解, 被认为是这种脑损伤所独有的。临床前模型是有助于更好地了解爆炸诱发脑损伤的关键工具。利用开放式激波管模拟了用弗里德曼波形模拟的现实生活中的露场冲击波, 建立了一种新的体外爆炸 tbi 模型。c57bl/6n 小鼠单型海马切片培养物暴露在单冲击波下, 使用碘化钠 (一种成熟的细胞损伤荧光标记) 对损伤的发展进行了活据, 该假体仅穿透细胞影响了细胞膜。在整个协议期间, 暴露在冲击波中的片中, 碘化丙酸的荧光比假片高得多。脑组织损伤是非常可重复的, 并与所应用的冲击波的峰值超压成正比。
爆炸创伤性脑损伤 (tbi) 是一种复杂的脑损伤类型, 是由1,2爆炸装置爆炸引起的。在过去15年中, 随着伊拉克和阿富汗最近的军事冲突,爆炸 tbi 已成为一个主要的健康问题。总体而言, 据估计, 从伊拉克和阿富汗返回的士兵中, 有 4.4% 至 22.8% 的人遭受了轻微的 tbi, 其中很大一部分是与爆炸有关的, 据报道, 美军的爆炸 tbi 率高于英国军队 ,5。
使用简易爆炸装置造成了大多数与爆炸有关的创伤, 包括军队遭受的爆炸 tbi 6.炸药的引爆会导致压力的迅速–但短暂的–增加, 以毫秒为单位。由此产生的现实生活中自由场爆炸的超压波是由弗里德兰德函数模拟的, 突然上升到峰值超压, 然后是指数衰减7,8。在爆炸事件中看到的极端力的范围及其快速的时间过程通常在非爆炸创伤 1,9中没有经历过。峰值超压, 即波形的最大压力, 正弦波的持续时间被认为是造成爆炸脑损伤的重要因素, 而这些因素取决于爆炸装药和与爆炸10的距离, 11个。
爆炸爆炸造成的创伤被分为四个离散部件,分别为一级、二级、三级和四级爆炸伤害10、12、13、14。这些成分中的每一个都与具体的伤害机制有关。原发性爆炸损伤是由于超压波对器官和组织2,13的直接作用造成的。继发性爆炸损伤是由于弹丸碎片的撞击造成的, 造成穿透性和非穿透性伤口2,15.当受害者的身体被移位到地面或周围物体上, 并与加速减速力1、10、13 有关时, 就会发生三级爆炸伤害。第四纪爆炸伤害描述的是与爆炸直接相关的异质伤害群体, 前三种伤害机制未涵盖描述的 12,13.它包括 (但不限于) 热损伤、吸入烟雾、辐射、电磁波和不利的心理影响13,15。大多数与爆炸相关的 tbi 直接产生于前三种损伤机制, 而爆炸损伤的第四纪机制通常与全身损伤13有关。与其他类型的 tbi (如机动车撞车、坠落、弹道损伤) 有关的加速减速力 (如鞭子)、钝性和穿透性创伤性脑损伤的影响已得到广泛研究。然而, 原发爆压波是爆炸损伤所独有的, 其对脑组织的影响却远没有得到很好的理解。与超压波相关的主要爆炸损伤机制是与大脑相互作用的第一磁力。
在过去的几十年里, 开发了许多临床前 tbi 模型, 这些模型对于了解爆炸 tbi 损伤机制和病理生理学以及研究潜在的新治疗方法非常宝贵, 否则这些方法是不可能完全做到的在临床设置17,18,19。虽然没有一个单一的临床前模型可以重现临床爆炸脑外伤的复杂性, 典型的临床前 tbi 模型复制人类 tbi 的不同方面。与爆炸有关的力的破坏性作用可以在体外和体内爆炸 tbi 模型中孤立或结合研究。体外模型的优点是可以严格控制实验环境 (组织生理条件和损伤生物力学), 从而减少生物变异性并提高重现性, 从而允许研究没有动物模型20中存在的混淆物的特定分子级联。我们的目标是开发一个体外模型, 以研究原生爆炸对脑组织的影响。我们的目标是开发一个具有超声速冲击波的模型, 该冲击波代表了一个自由场爆炸, 例如简易爆炸装置 (ied) 产生的爆炸。
在与爆炸 tbi (一级、二级和三级爆炸损伤机制) 相关的所有损伤机制中, 初级爆炸损伤是爆炸创伤所独有的, 在与爆炸相关的机制1、2 中, 这种损伤是最不了解的.本文所述的新协议是利用开放式激波管研究初级爆炸 tbi 的, 该方法利用简单而快速的协议将小鼠海马切片培养体暴露在单个冲击波中, 从而能够创建一种可重现性具有较高的吞吐量的主爆炸 tbi。
第一个体外原生爆炸 tbi 模型将静水压力波应用于细胞 26,27。然而, 压力输出并没有模拟弗里德曼函数, 因为静水压力脉冲的持续时间比机载爆炸超压波13要长得多。使用激波管 1,8,可以很容易地在实验室中模拟弗里德曼功能。激波可以产生冲击波, 在传统的实验室环境中模拟现实生活中的露天爆炸, 同时允许精确控制波参数, 如峰值超压、正波持续时间和脉冲, 方法是改变隔膜材料和厚度, 以及驱动器体积 8,28,29。
简单的体外模型, 如细胞培养, 通常缺乏异质性的细胞类型和突触连接30。近年来, 爆炸对不同细胞类型的体外脑细胞 “球体” 的影响进行了研究.对这些有趣的准备工作进行进一步调查是值得的;然而, 目前尚不清楚他们的细胞组织和连接是如何反映完整的大脑的。ohsc 是一个成熟的体外实验模型23,32, 易于培养, 其三维组织细胞结构, 细胞分化和突触连接保存良好, 非常类似于体内33,34, 35,36.ohsc 代表了细胞培养和体内模型 23,32之间的中间复杂性水平。ohsc 已被证明可以在体内模型中看到的体外病理神经退行性级联的繁殖, 并在筛选潜在的神经保护药物和了解其机制方面非常有用。行动17,21,22,37,38。最后, 所研究的解剖区域海马体在翻译 tbi 研究中具有高度的相关性, 因为在 tbi 患者39、40、41中经常受损。ohsc 已被用于模型爆炸 tbi28,42,43, 44, 但是, 我们的模型是相对简单的, 可以适应现有的水平或垂直的冲击管配置, 而无需复杂的调整。
ohsc 可以在培养中保存许多天, 这有助于随着时间的推移对生物过程的调查34。在该模型中, 在爆炸暴露后, 每天测量冲击波照射造成的组织损伤, 爆炸后使用碘化物, 这是细胞损伤的既定标记。碘化钠是一种无毒的高极性染料, 它能穿透细胞, 并与核酸结合, 并表现出典型的明亮的红色荧光 24,25,45。用 nisl 染色46, 47 检测出碘化丙酯的荧光与损伤细胞计数有很好的相关性。
鉴于该模型中产生的损伤是漫反射的 (图 2c), 在进行分析时测量了整个切片的荧光, 类似于以前在其他脑损伤范式21、22 中发表的工作, 而不是使用特定的区域, 就像在其他体外爆炸 tbi 模型28,43,44,48所做的那样。本文中描述的模型中使用的全局方法还消除了概述所定义的感兴趣区域时引入的潜在可变性, 并提供了与爆炸有关的伤害的更全面的情况。与假片相比, 50 kpa 和55千帕的冲击波峰值超压都产生了明显的 (p & lt;0.05 和lt;0.0001 ) 损伤 (图 2b)。不出所料, 峰值超压 5 5千帕的冲击波造成的伤害超过 5 0千帕波。在一个离体模型中, 分离的脑组织直接暴露在冲击波中, 如何准确地缩放到整个生物体或人类是不简单的。然而, 我们使用的冲击波在现场观测到的峰值超压范围内, 通常为 50–1000千 kpa8,49。
为了保持 ohsc 暴露在生理温度以及氧气和二氧化碳的水平下, 同时确保它们在整个冲击波暴露过程中不受污染, 组织培养插入物被密封成无菌聚乙烯袋采用无菌技术, 淹没在实验介质中加热至 37°c, 新鲜起泡95% 的氧气和5% 的二氧化碳, 类似于先前发表的作品28,43,44 ,48岁。与这些模型不同的是, 在冲击波照射过程中使用了复杂的装置来固定无菌袋, 在该协议中, 使用了一种简单而快速的方法将 ohsc 组织培养插入物挂在激流管出口前 (图 1a, c)).本文中描述的模型允许快速处理和高吞吐量, 同时最大限度地降低低温风险。这些方面与神经保护研究特别相关, 因为一些治疗干预措施在 tbi 之后可能有非常有限的潜在应用时间。这种新的冲击波暴露协议允许6至9个组织培养插入物 (通常为36至54海马组织切片) 在短时间内 (约 1小时) 暴露在冲击波中。
ohsc 在整个过程中都需要良好的无菌技术。重要的是要在整个培养过程中和转移到无菌袋爆炸时使用无菌层流罩。为了在无菌条件下进行切片成像, 并在6孔板的盖子上进行成像, 我们使用定制的金属环将细胞培养插入物提高到显微镜的焦平面上。我们协议的一个重要部分是, 我们在每个实验中都包括未受伤的假片。除了不发射冲击管的情况外, 对页片的处理方式与爆破片相同;另一个重要步骤是, 所有切片在受伤或假治疗前1小时进行成像, 以确保所使用的切片人群的健康状况相同 (图 2b)。
除了随着时间的推移对切片中的细胞损伤进行定量分析外, 在常规免疫组织化学 50的实验结束时, 还可以固定组织。我们开发并评估了使用小鼠海马切片的方法。然而, 我们的技术可以很容易地适应使用其他组织, 可以在培养中生长, 如脊髓, 视网膜, 肺或上皮组织。在本文和我们以前的工作与模型, 我们只研究了暴露在一个单一的爆炸的影响。然而, 该模型非常适合研究反复的低级爆炸对大脑或其他组织的影响。ohsc 可以在培养中保存数周甚至数月, 从而对慢性影响进行调查。
体外模型比体内模型简单, 吞吐量较高, 成本较低, 实验通常可以在较短的时间范围内完成.然而, 使用体外模型获得的结果需要在动物模型中得到验证, 因为体外培养的组织保存在人工环境中, 对损伤的反应可能与在体内17 不同。尽管如此,体外模型在提高我们对脑损伤级联的认识和在体内使用更复杂的模型 17、22 之前筛选神经保护药物方面具有极大的价值,51,52. 尽管该模型提供了许多优点, 但必须指出,体外模型缺乏动物体内存在的 tbi 的关键特征, 体内模型缺乏对血管系统的影响, 增加了颅内压力、全身免疫反应和功能行为障碍, 这突出表明需要验证在整个动物的体外模型中发现的结果。然而,体外模型, 如本文所描述的模型是非常有用的翻译相关的科学工具。
总之, 这项工作描述了一种简单而直接的新方法, 在这种方法中, 小鼠的器官型海马组织培养物暴露在严格控制和可重现的现实生活中相关冲击波中, 使用实验室的激波。由此产生的全球损伤, 是用碘化钠—-一种成熟的细胞损伤标记—-进行量化的, 它是非常可重复的, 并且与所施加的冲击波的峰值超压成正比。
The authors have nothing to disclose.
支助单位: 英国伯明翰皇家国防医学中心、英国伦敦皇家军团爆炸伤害研究中心、英国伦敦帝国学院。医学研究理事会, 联合王国伦敦 (MC_PC_13064;mrs来/n0277361)。天然气安全信托基金, 伦敦, 联合王国。rita campos-pires 获得了葡萄牙里斯本 cincia a 的 cincia 和 tecnologia 基金会颁发的博士培训奖。凯蒂·哈里斯是英国伦敦威斯敏斯特医学院研究信托基金博士生的获得者。
这种模式是在帝国学院英国皇家军团爆炸伤害研究中心 (rblcbis) 的支持下开发的。我们要感谢英国皇家军团的财政支持。对合作或更多细节感兴趣的研究人员可能会联系作者或 rblcbis。
我们感谢联合王国伯明翰皇家国防医学中心研究主任 amarjit samra 博士支持这项工作, 伦敦帝国学院外科 & 癌症系的 scott armstrong 为初步实验提供了协助, theofano eftaxiopolou, hari arora & luz ngoc nguyen, 伦敦生物工程帝国学院系, & 伦敦物理帝国学院系 william proud, 就冲击管 raquel yustos 提供咨询意见, raquel yustos, 研究技术员, 系伦敦帝国学院生命科学公司, 为寻求技术支持, paul brown mbe, 车间经理和史蒂夫·纳尔逊, 讲习班技术员, 物理系, 物理系, 物理系,伦敦帝国学院, 艺术品。
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |