本稿では、プライマリ爆発外傷性脳損傷の新たなモデルについて説明します。圧縮空気駆動型衝撃波管を使用して、単一の衝撃波にマウス海馬スライス培養体外を公開します。高スループットで再現可能な脳組織の損傷を生成する簡単かつ迅速なプロトコルです。
外傷性脳損傷は、軍と民間人の集団における死亡や障害の主要な原因です。爆発装置の爆発からの爆風外傷性脳傷害の結果しかし、爆発圧力の露出に起因する脳損傷の根底にあるメカニズムに完全に理解されない、脳損傷のこのタイプに固有であると考えられています。前臨床モデルは、ブラストによる脳損傷を理解に寄与する重要なツールです。フリードランダー波形をモデル化した現実野外爆発波をシミュレートするために、自由回答式衝撃波管を用いた新規体外ブラストの TBI モデルが開発されました。C57BL/6 n マウス脊髄海馬スライス培養された単一衝撃波にさらされ、損傷の開発は最大 72 時間細胞に浸透し、細胞の損傷だけの老舗蛍光マーカーによる特徴づけられました。細胞膜が損なわれます。Propidium ヨウ化蛍光プロトコルの全期間にわたって偽スライスと比較すると爆風にさらされるスライスで有意に高値だった。脳組織の損傷は非常に再現性のある適用衝撃波のピーク過圧に比例です。
爆発外傷性脳損傷 (TBI) は、爆発装置1,2の爆発に起因する脳損傷の複合型です。ブラスト TBI は、健康問題にイラクとアフガニスタンの2,3の最近の軍事衝突の最後の 15 年間で、主要なとして登場しました。全体的にみて、推定されている 4.4% とイラクとアフガニスタンからの帰還兵の 22.8% の穏やかな TBI、ブラスト関連英国軍4 と比較して米軍にブラスト TBI の報告された率が高いとされているこれらの大きい割合に苦しんでいます。 ,5。
即席爆発装置の使用は、ブラスト TBI、軍隊6耐えを含む、ブラスト関連の外傷のほとんどを担当しています。爆薬の爆轟により非常に急速な-しかし、過渡-ミリ秒単位で発生する圧力の増加します。現実自由場爆発から結果の重圧の波がフリードランダー関数、指数関数的減衰7、8に続いてピーク過圧に急激な増加をモデル化しました。極端な力と爆発イベントで彼らの急速な時間経過の範囲通常経験のない非爆発のトラウマ1,9。波形の最大圧力と肯定的な波の期間であるピーク過圧ブラスト脳損傷への重要な貢献者と考えられているし、これらは、爆薬と起爆10からの距離に依存 11。
爆破の結果を一次、二次、第三紀と第四紀の爆発負傷10,12,13,14として指定された 4 つの個別のコンポーネントとして分類するトラウマ。これらの各コンポーネントは、傷害の特定のメカニズムに関連付けられます。プライマリ爆発損傷臓器や組織の2,13重圧の波の直接行動からの結果します。投射物のフラグメントの影響から二次爆発傷害の結果、傷を2,15貫通と非貫通を引き起こします。第三爆発損傷は、犠牲者の体は地面や周囲のオブジェクトに対して変位、加速/減速力1,10,13と関連付けられる場合に発生します。第四紀の爆発の損傷では、最初の 3 つの傷害メカニズム説明12,13でカバーされない爆発に直接関連傷害の異種グループについて説明します。それは (しかしに限定されていません) が含まれています熱損傷、煙の吸入、放射線、電磁波、心理的悪影響13,15。爆風損傷の第四紀のメカニズムは通常全身負傷13に関連付けられてほとんどのブラスト関連 TBI は傷害の最初の 3 つの機構から直接結果します。効果 (例えばむち打ち症) 加速/減速力を鈍らせるし、外傷性脳損傷の浸透が盛ん TBI (例えば、自動車クラッシュ、滝、弾道傷害) の他のタイプに関連して。ただし、爆風損傷にユニークなプライマリ爆風過圧、脳組織への影響はあまりよく理解されて16。重圧の波に関連付けられているプライマリ爆発傷害メカニズムは、脳を操作する機械の力の最初です。
多くの前臨床 TBI モデル ブラスト TBI 機構傷害の病態生理を理解し、それ以外の場合、排他的に行うことが可能となるだろう潜在的な新しい治療法を調査する貴重なされている最後の十年にわたって開発されています。臨床設定の17,18,19を実行します。単一の前臨床モデルで臨床ブラスト脳外傷の複雑さを再現しないが通常異なる臨床 TBI モデルは人間 TBI の異なる側面をレプリケートします。爆発爆発に関連付けられている力の有害な作用は、単独で、あるいは両方生体外でそして生体内のブラスト TBI モデルでの組み合わせで学ぶことができます。In vitroモデル生物学的変動が減少し、向上の研究を許可する再現性実験環境 (組織の生理学的な条件および傷害バイオメカニクス) の厳格な制御を許可する利点があります。特定の分子は、動物の存在の交絡因子モデル20なしに重ねて表示します。私たちの目標は、脳組織に及ぼす主な爆発を調査するための in vitroモデルを開発することでした。即席爆発装置 (IED) によって生成されるよう自由場爆発フリードランダー波形代表と超音速衝撃波とモデルの開発を目指しました。
ブラスト TBI (プライマリ、セカンダリ、三次爆発損傷機構)、プライマリ爆発損傷は爆風トラウマにユニークなブラスト関連メカニズム1,2 の理解に関連する傷害のすべてのメカニズムの間で.ここで説明する新しいプロトコルのプライマリ爆発 TBI により、再現を作成簡易かつ迅速なプロトコルを使用して単一の衝撃波にマウス海馬スライス培養体外を公開するオープン エンドのショック チューブを使用して開発スループットの高いプライマリ爆発 TBI。
最初の in vitroプライマリ爆発 TBI モデルは細胞26,27に静水圧波を適用しました。ただし、圧力出力はモデル フリードランダー関数静水圧パルスの持続時間は空中爆発重圧の波13よりもはるかに長かった。フリードランダー関数の特性は、ショック チューブ1,8を使用して実験室で簡単に組み立てることも可能します。衝撃波管を変えることによってピーク過圧、正波継続時間、衝動的などの波パラメーターの正確な制御を可能にしながら従来の研究室では、実際生活露地爆発をシミュレートする衝撃波を作り出すことができる、ダイアフラム材質と厚みドライバー ボリューム8,28,29
モデル シンプルな体外培養細胞などは通常種類の細胞とシナプス接続30の不均一性を欠いています。最近では、’楕円’ 異なる種類の細胞を組み込んだ脳細胞の in vitroでの爆発の効果は調査31をされています。これらの興味深い準備の更なる調査が報われます。しかし、わかりにくい細胞組織との接続がそのまま脳にミラー化。一部は、OHSC が定評の in vitroの実験モデル23,32, 文化しやすく、自分の三次元組織細胞構築、細胞分化とシナプス結合がよく維持され、非常にその体内33,34,35,36.のようOHSCs は、細胞培養との間、体内モデル23,32複雑さの中間レベルを表します。OHSCs は体内のモデルに見られるin vitro病理学的変性カスケードを再現し、潜在的な神経保護薬のスクリーニングとそのメカニズムを理解する上で非常に有用されているが示されています。アクション17,21,22,37,38。最後に、解剖学的領域は、海馬を調査した、この地域は頻繁に TBI 患者39,40,41で破損して、トランスレーショ TBI で関連性の高い。一部は、OHSC モデル ブラスト TBI28,42,43,44に使用されている、しかし、我々 のモデルは比較的簡単、または垂直か水平に既存衝撃波管に適応することができます。複雑な適応なしの構成。
時間34以上の生物学的プロセスの調査を容易にする多くの日のための文化の一部は、OHSC で保管できます。このモデルで衝撃波に起因する組織の損傷を毎日測定した、細胞の損傷の確立されたマーカーによる爆発の露出に続く 3 日間。Propidium ヨウ化は危険にさらされた細胞膜、それが核酸に結合し、独特の明るい赤の蛍光24,25,45の展示と細胞に浸透し無毒水性染料です。Propidium ヨウ化で測定した蛍光は、ニッスル染色46,47を使用して負傷した細胞数と良好な相関を持っている示されています。
その他脳損傷パラダイム21,22で以前出版された仕事と同様の解析を実行するとき、全体のスライスの蛍光を測定したこのモデルで生成された傷害がびまん性 (図 2)、、他の in vitroで行われている特定の領域を使用する代わりにブラスト TBI モデル28,43,44,48。この資料に記載されているモデルで使用されているグローバルなアプローチが導入されたとき、関心領域を定義されたアウトラインとブラスト関連の傷害のより包括的な画像を提供する潜在的な変動もなくなります。衝撃波ピーク加圧、50 kPa と 55 kPa の両方重要な生産 (p < 0.05、 p < 0.0001、それぞれ) 損傷偽スライス (図 2B) と比較した場合。予想通り、最も高いピーク過圧と衝撃波 55 kPa は 50 kPa 波よりより多くの損傷を作り出した。分離脳の in vitroモデルで組織に直接公開、衝撃波や人間の全体の有機体に正確にサイズ変更する方法は簡単ではありません。それにもかかわらず、我々 が使用される衝撃波が、野外、通常 50-1,000 kPa8,49で観察されたピーク加圧の範囲内。
滅菌に密封された培養挿入衝撃波露出プロトコル全体の汚染から解放されたことを確保しながら生理学的温度と酸素と二酸化炭素のレベルにさらされて、一部は、OHSC を維持するために37 ° C に加温し、たて同様に過去に発表された28,43,44 95% 酸素、5% 炭酸ガスのバブルの実験中に浸漬、無菌ポリエチレン袋、48。これらのモデルは、複雑なデバイスは、このプロトコルでは、衝撃波の露光中に滅菌バッグを保持するために使用されていた場所に反して簡易迅速法は衝撃管出口 (図 1 a、C の前に一部は、OHSC 培養挿入を中断する使用されました。).本稿で説明するモデルでは、低体温症のリスクを最小限に抑えながら高速処理と高スループットをことができます。これらの側面は、いくつかの治療上の介在は TBI 後潜在的なアプリケーションの非常に限られた時間ウィンドウを必要があることを考える神経保護研究のため特に関連しています。露出にあるこの小説の衝撃波のプロトコルにより 6 に 9 組織培養時間 (約 1 時間) の短い間隔で衝撃波にさらされる (通常 36 に 54 海馬切片組織スライス) を挿入します。
OHSCs は、全体の良い無菌技術を必要とします。培養中とブラストの滅菌袋に転送するとき無菌層流フードを使用することが重要です。場所 6 ウェルプレートの蓋無菌条件下でのスライス画像を遂行するために顕微鏡の焦点面に細胞文化挿入を高めるために特注の金属リングを使用します。プロトコルの重要な部分は、すべての実験で無傷の偽スライスが含まれてです。偽のスライスは、衝撃波管は発生しません; 例外とブラスト スライスを同一に扱われますもう一つの重要なステップは、すべてのスライスが 1 h をイメージ化けがや偽治療、確実に同じ (図 2 b) 使用されるスライスの人口の健康にする前に、です。
スライスで時間をかけての細胞損傷の定量化、に加えて、従来免疫組織化学50の実験の終わりに組織を固定できます。開発し、マウス海馬スライスを用いた評価.ただし、本手法は他の組織文化、脊髄、網膜、肺上皮性のティッシュなどで栽培することができますを使用する簡単に合わせることができます。本稿およびモデルと私たちの以前の仕事は、のみ 1 つの爆発への露出の効果を調べた。ただし、モデルは、脳やその他の組織に及ぼす繰り返し低レベルの爆発を調査するためよく適しているでしょう。多くの週のための文化 OHSCs を保つことができるあるいは 3カ月間で、慢性的な影響を検討します。
In vitroモデル、体内モデルよりも簡単高スループット、安価と実験は、短い時間スケール17で通常完了ことができます。ただし、体外モデルを使用して得られた結果体外培養組織の人工環境で保たれます、何から異なる傷害に応答可能性があります動物モデルで検証する必要があります彼らは生体内で17。それにもかかわらず、生体外モデルと脳損傷カスケードの私達の理解を高めることで非常に貴重なされているより複雑な生体内での使用前に神経保護薬のスクリーニング モデル17,22,51,52の in vitroモデルに動物と体内のモデルでは、血管系に及ぼす影響などに存在する TBI の機能キーがないことに注意することが重要だ、このモデルによって提供される多くの利点にもかかわらず増加頭蓋内。圧力、全身の免疫反応の in vitroモデル全体の動物では、結果を検証する必要性を強調機能の行動障害。それにもかかわらず、このペーパーで説明されているモデルなどの in vitroモデルは、非常に便利な並進関連する科学的なツールです。
結論としては、この作業はマウス海馬切片培養組織がしっかりと管理して再現性のある実際の生活関連衝撃波研究所衝撃波管を用いたにさらされているシンプルで簡単な手法を説明します。による、細胞の損傷の確立されたマーカーの定量化を行った結果の世界的な傷害、非常に再現性のある適用衝撃波のピーク過圧に比例しています。
The authors have nothing to disclose.
サポートされている: イギリスの防衛医学、バーミンガム、イギリス、爆発損傷研究、インペリアル カレッジ ロンドン、ロイヤル ブリティッシュ軍団センター ロイヤル センター。医療研究評議会、ロンドン、イギリス (MC_PC_13064;MR/N027736/1)。ガスの安全性の信頼、ロンドン、イギリス。リタ カンポス ピレスだったカルースト パラから博士課程賞を受賞 Ciência e、技術、リスボン、ポルトガル。ケイティ ・ ハリスは、ウェストミン スター医療学校研究の信頼、ロンドン、イギリスから思い立ったの受信者だった。
このモデルは、インペリアル ・ カレッジでの爆発損傷研究 (RBLCBIS) のロイヤル英国リージョン センターの支援を受けて開発されました。我々 は、ロイヤル英国在郷軍人会の助成を受けたいと思います。著者または RBLCBIS、研究者のコラボレーションやさらなる詳細に興味がお問い合わせください。
ありがとう Dr Amarjit Samra、調査担当ディレクター、ロイヤル センター防衛医学、バーミンガム、イギリス、この作業を支援するスコット ・ アームスト ロング、外科・がん、インペリアル カレッジ ロンドン、予備実験について、ウィリアム誇りに思う, 部の物理ロンドン大学インペリアル カレッジ、ラケル Yustos 衝撃波管についてのアドバイスを、部門の技術者を研究・ ルス ゴック グエン、部の生物工学ロンドン大学インペリアル カレッジ、ハリ アローラ Theofano Eftaxiopolou生命科学、ロンドン大学インペリアル カレッジ、テクニカル サポート、ポール ・ ブラウン MBE ワーク ショップ マネージャーのスティーブ · ネルソン、工場の技術者、金属を作るためのインペリアル カレッジ ロンドン物理学、リング、物理学教室のニール ・ パウエルインペリアル ・ カレッジ ・ ロンドン、アートワークの。
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |