Dette papir beskriver en ny model af primære blast traumatisk hjerneskade. En komprimeret luft drevet stødrørs stødbølgehastighed bruges til at afsløre i vitro mus hippocampus skive kulturer til en enkelt trykbølge. Dette er en enkel og hurtig protokol skaber en reproducerbare hjernen vævsskade med en høj overførselshastighed.
Traumatisk hjerneskade er en førende årsag til død og invaliditet i militære og civile befolkninger. Blast traumatisk hjerne skade resultaterne fra detonationen af eksplosive anordninger, men de mekanismer, der ligger til grund for hjerneskade som følge af blast overtryk eksponering er ikke helt forstået og menes at være unikke for denne type af hjerneskade. Prækliniske modeller er afgørende værktøjer, der bidrager til bedre for at forstå blast-induceret hjerneskade. En roman i vitro blast TBI model blev udviklet ved hjælp af en open-ended stødrørs stødbølgehastighed for at simulere virkelige open-felt blast bølger modelleret af Friedlander bølgeform. C57BL/6N mus organotypic hippocampus skive kulturer blev udsat for enkelt chokbølger og udviklingen af skade var kendetegnet op til 72 h, ved hjælp af propidium Iodid, en veletableret fluorescerende markør for celleskader at kun trænger celler med kompromitteret cellemembraner. Propidium Iodid fluorescens var betydeligt højere i skiverne er udsat for en blast wave sammenlignet med fingeret skiver hele varigheden af protokollen. Væv hjerneskade er meget reproducerbare og proportional med peak overtryk af chok bølge anvendes.
Blast traumatisk hjerneskade (TBI) er en kompleks type af hjerneskade, at resultaterne fra detonationen af eksplosive anordninger1,2. Blast TBI fremstod som et stort sundhedsproblem i de sidste 15 år med de seneste militære konflikter i Irak og Afghanistan2,3. Samlet, det anslås, at mellem 4,4% og 22,8% af soldater vender hjem fra Irak og Afghanistan har lidt mild TBI, en stor del af disse er blast-relaterede, med en højere rapporterede blast TBI i de amerikanske styrker sammenlignet med UK styrker4 ,5.
Brugen af improviserede eksplosive anordninger har været ansvarlig for de fleste af blast-associerede traumer, herunder blast TBI, udholdt af militære styrker6. Detonation af en sprængladning resulterer i en meget hurtig — men forbigående — øge i tryk, forekommer i millisekunder. Den resulterende overtryk bølge fra en real-life gratis felt eksplosion er modelleret af funktionen Friedlander med en pludselig stigning til peak overtryk efterfulgt af en eksponentiel henfald7,8. Rækken af ekstreme kræfter og deres hurtige tidsforløb set i en blast begivenhed er normalt ikke oplevet i ikke-blast traumer1,9. Peak overtryk, som er den maksimale tryk af bølgeform, og varigheden af den positive bølge menes at være vigtige bidragsydere til blast hjerneskade og disse afhænger den sprængladning og afstanden fra detonation10, 11.
Det traume, at resultaterne fra en eksplosiv blast er klassificeret som fire diskrete komponenter, udpeget som primær, sekundær, tertiær og kvaternære blast skade10,12,13,14. Hver af disse komponenter er forbundet med specifikke mekanismer til skade. Primære blast skade skyldes direkte aktion af overtryk bølge på organer og væv,2,13. Sekundære blast skade resultaterne fra virkningen af projektil fragmenter, forårsager gennemtrængende og ikke-gennemtrængende sår2,15. Tertiære blast skade opstår når offerets krop er fordrevet mod jorden eller omkringliggende objekter og er forbundet med acceleration/deceleration styrker1,10,13. Kvaternære blast skade beskriver en heterogen gruppe af skader direkte relateret til eksplosionen ikke er omfattet af de første tre skade mekanismer beskrevne12,13. Det omfatter (men er ikke begrænset til) termisk skade, røg indånding, stråling, elektromagnetiske bølger og psykiske bivirkninger13,15. De fleste blast-associerede TBI resultater direkte fra de første tre mekanismer til skade, mens de Kvartære mekanismer af blast skade er normalt forbundet med systemisk skade13. Virkningerne af acceleration/deceleration kræfter (fx, whiplash), stumpe og gennemtrængende traumatisk hjerneskade er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med andre typer af TBI (f.eks.motordrevet køretøj nedbrud, falls, ballistiske skade). Men den primære overtryk trykbølger er unikke til blast skade og dens virkninger på hjernevæv er langt mindre godt forstå16. De primære blast skade mekanismer, forbundet med et overtryk bølge, er først af de mekaniske kræfter til at interagere med hjernen.
Talrige prækliniske TBI modeller er blevet udviklet over de sidste årtier, der har været uvurderligt at forstå blast TBI mekanismer af skade og patofysiologi og undersøge potentielle nye behandlinger, som ellers ville være umuligt at gøre udelukkende i en klinisk indstilling17,18,19. Selv om ingen enkelt prækliniske model kan reproducere kompleksiteten af kliniske blast hjernen traumer, typisk kopiere forskellige prækliniske TBI modeller forskellige aspekter af menneskelig TBI. Den skadelige påvirkning af kræfter tilknyttet en blast eksplosion kan studeres, isoleret eller i kombination i både in vitro- og i vivo blast TBI modeller. In vitro modeller har fordelen, at en stram styring af eksperimenterende miljø (væv fysiologiske forhold og skade biomekanik), som reducerer biologiske variation og forbedrer reproducerbarhed, tillader undersøgelse af specifikke molekylære kaskader uden konfoundere stede i dyre modeller20. Vores mål var at udvikle en in vitro- model for at undersøge virkningerne af primære blast på hjernevæv. Vi havde til formål at udvikle en model med en supersoniske shockwave med Friedlander bølgeform repræsentant for et fri-felt eksplosion som den, der produceres af en improviserede eksplosive anordninger (IED).
Blandt alle mekanismerne af skade tilknyttet blast TBI (primære, sekundære og tertiære blast skade mekanismer), primære blast skade er unik for blast traumer og det er forstået mindst af blast-associerede mekanismer1,2 . Den nye protokol beskrevet her blev udviklet for at studere primære blast TBI ved hjælp af en open-ended stødrørs stødbølgehastighed for at eksponere in vitro- mus hippocampus skive kulturer til en enkelt chok bølge ved hjælp af en enkel og hurtig protokol, der tillader oprettelsen af en reproducerbar primære blast TBI med en høj overførselshastighed.
Første i vitro primære blast TBI modeller anvendes hydrostatisk trykbølger til celler26,27. Pres output ikke model Friedlander funktion som varigheden af en hydrostatisk tryk puls blev meget længere end luftbårne blast overtryk bølger13. Karakteristiske Friedlander funktion kan modelleres let i laboratoriet ved hjælp af et stød rør1,8. Stødrørs stødbølgehastighed kan producere chokbølger, som simulerer virkelige liv friland eksplosioner i en konventionel laboratoriemiljø, samtidig med at den præcis kontrol af bølge parametre, såsom peak overtryk, positive bølge varighed og impuls, ved at variere den mellemgulvet materiale og tykkelse, og driver bind8,28,29.
Enkel in vitro- modeller som cellekulturer mangler normalt heterogenitet celletyper og synaptisk forbindelse30. Effekten af blast på in vitro- hjerne celle ‘spheroids’ indarbejde forskellige celletyper har for nylig været undersøgte31. Yderligere undersøgelser af disse interessante præparater er fortjent; men det er ikke klart, hvordan deres cellulære organisation og connectivity spejle intakt hjernen. OHSC er en veletableret in vitro- eksperimentel model23,32, er nemme at kultur og deres tre-dimensionelle væv cytoarchitecture, Celledifferentiering og synaptisk forbindelse er godt bevaret og meget svarende til i vivo33,34,35,36. OHSCs repræsenterer en mellemliggende niveau af kompleksitet mellem cellekultur og en i vivo model23,32. OHSCs er blevet påvist at reproducere in vitro patologiske neurodegenerative cascades set i i vivo modeller og har været meget nyttig i screening af potentielle neuroprotektive narkotika og forstå deres mekanismer af aktion17,21,22,37,38. Endelig, den anatomiske område studerede, hippocampus, er yderst relevant i translationel TBI undersøgelser, som denne region er ofte beskadiget i TBI patienter39,40,41. OHSC har været brugt til model blast TBI28,42,43,44, men vores model er relativt simpel og kan være tilpasset til eksisterende stødrør i enten vandret eller lodret konfigurationer uden komplekse tilpasninger.
OHSC kan holdes i kultur i mange dage, som letter undersøgelsen af biologiske processer over tid34. I denne model, den vævsskade, der førte fra trykbølge eksponering blev målt dagligt over tre dage, efter at blast eksponering ved hjælp af propidium Iodid, en veletableret markør for celleskader. Propidium Iodid er en ugiftige meget polar farvestof, der trænger ind i celler med kompromitteret cellulære membraner, hvor det binder sig til nukleinsyrer og udstiller en karakteristisk lyse røde fluorescens24,25,45. Fluorescens målt med propidium Iodid har vist sig at have en god korrelation med tilskadekomne celletal bruger Nissl farvning46,47.
Betragtning af, at den skade, der er produceret i denne model var diffuse (figur 2 c), blev fluorescens af det hel skive målt ved udførelse af analyse, svarende til tidligere publicerede artikler i andre hjerne skade paradigmer21,22 , stedet for at bruge bestemte regioner, som er sket i andre in vitro- blast TBI modeller28,43,44,48. Den globale tilgang anvendes i den model, der er beskrevet i denne artikel også eliminerer den potentielle variabilitet, der indføres når skitserer definerede regioner af interesse og giver et mere omfattende billede af den blast-relateret skade. Både trykbølge peak overtryk, 50 kPa og 55 kPa, fremstillet signifikant (p < 0,05 og p < 0,0001, henholdsvis) skade sammenlignet med fingeret skiver (figur 2B). Som forventet, trykbølge med den højeste peak overtryk, fremstillet 55 kPa, mere skade end 50 kPa bølge. I en in vitro- model med isolerede hjernen udsat væv direkte for et shockwave, hvordan man præcist skala til hele organismen eller et menneske er ikke ligetil. Ikke desto mindre er chokbølger brugte vi inden for rækkevidde af peak overtryk observeret i området, typisk 50-1000 kPa8,49.
For at opretholde OHSC udsat for fysiologisk temperatur og niveauer af ilt og kuldioxid, samtidig med at de var fri for forurening i hele trykbølge eksponering protokol, blev vævskultur skær forseglet i sterile polyethylen poser efter en aseptisk teknik, nedsænket i eksperimentel medium opvarmet til 37 ° C og frisk boblede med 95% ilt og 5% kuldioxid, ligeledes til tidligere offentliggjorte arbejde28,43,44 ,48. I modsætning til disse modeller, hvor komplekse enheder blev brugt til at holde de sterile poser under trykbølge eksponering, i denne protokol, blev en enkel og hurtig metode brugt til at suspendere OHSC vævskultur skær foran chok tube outlet (figur 1A, C ). Den model, der er beskrevet i denne hvidbog giver mulighed for hurtig behandling og høj produktivitet, samtidig minimere risikoen for hypotermi. Disse aspekter er særligt relevante for neuroprotection undersøgelser, da nogle terapeutiske indgreb kan have en meget begrænset tidsvindue for potentielle anvendelse efter TBI. Denne roman trykbølge eksponering protokol giver 6 til 9 vævskultur indsætter (typisk 36 til 54 hippocampus organotypic væv skiver) for at blive udsat for en trykbølge i en kort tidsinterval (ca. 1 h).
OHSCs kræver god aseptisk teknik i hele. Det er vigtigt at bruge en aseptisk laminar flow hood i hele den dyrkning og ved overførsel til de sterile poser til blast. For at gennemføre slice imaging under aseptiske forhold med låg af 6-godt plader i sted, bruger vi skræddersyede metalringe for at øge celle kultur skær til brændplanet af mikroskopet. En vigtig del af vores protokol er, at vi medtager uskadt sham skiver i hvert eksperiment. Fingeret skiver behandles ens blast udsnit med den undtagelse at chok-rør ikke er fyret; et andet vigtigt skridt er, at alle skiver er afbildet 1 h før skade eller fingeret behandling, at sikre sundheden for befolkningen i skiver bruges identiske (figur 2B).
Ud over at kvantificere celle skade i skiver over tid, kan vævet fastsættes i slutningen af forsøget for konventionelle Immunhistokemi50. Vi udviklede og evalueret metoden ved hjælp af musen hippocampus skiver. Vores teknik kunne dog let tilpasses til brug andre væv, der kan dyrkes i kultur, såsom rygmarv, nethinden, lunge eller epitelvæv. I dette papir og vores tidligere arbejde med modellen undersøgt vi kun effekt af eksponering for en enkelt blast. Men modellen ville være velegnet til at undersøge virkningerne af gentagen low-level Blaster på hjernen eller andre væv. OHSCs kan opbevares i kultur i mange uger eller endda måneder, giver kroniske virkninger skal undersøges.
In vitro modeller, bliver enklere end i vivo modeller, har en højere overførselshastighed, er billigere og eksperimenter kan normalt gennemføres på en kortere tid skala17. Men resultaterne ved hjælp af in vitro- modeller skal valideres i dyremodeller, som in vitro- kulturperler væv er holdt i et kunstigt miljø og kan reagere på skade forskelligt fra, hvad de ønsker i vivo17. Ikke desto mindre, in vitro- modeller har været meget værdifulde i at øge vores forståelse af hjernen skade kaskader og i screening neuroprotektive narkotika før brug af mere komplekse i vivo modeller17,22 , 51 , 52. trods de mange fordele, som denne model, det er vigtigt at bemærke, at in vitro- modeller mangler nøglen funktioner til TBI er til stede i dyr og i vivo modeller, såsom effekter på vaskulære system, øget intrakranielt pres, systemisk immunrespons og funktionelle adfærdsmæssige værdiforringelse, som fremhæver behovet for at validere resultaterne fundet i in vitro- modeller i hele dyret. In vitro- modeller som den model, der er beskrevet i denne hvidbog er imidlertid yderst nyttige translationally relevante videnskabelige værktøjer.
Afslutningsvis, beskriver dette arbejde en enkel og ligetil roman metode hvor mus organotypic hippocampus vævskulturer udsættes for stramt kontrolleret og reproducerbare virkelige relevante chokbølger ved hjælp af et laboratorium stød rør. Den deraf følgende globale skade, som var kvantificeres ved hjælp af propidium Iodid, en veletableret markør for celleskader, reproducerbare meget og er proportional med peak overtryk af chokbølger anvendes.
The authors have nothing to disclose.
Støttet af: Royal Centre for Defence medicin, Birmingham, Det Forenede Kongerige, Royal British Legion Center for Blast skade studier, Imperial College London, Det Forenede Kongerige. Medical Research Council, London, Storbritannien (MC_PC_13064; MR/N027736/1). Gas sikkerhed tillid, London, Storbritannien. Rita Campos-Pires var modtager af en ph.d.-uddannelse award fra Fundação para en Ciência e Tecnologia, Lissabon, Portugal. Katie Harris var modtager af en PhD studentship fra den Westminster medicinsk skole forskning Trust, London, Storbritannien.
Denne model blev udviklet med støtte af Royal British Legion centrum for Blast skade undersøgelser (RBLCBIS) på Imperial College. Vi vil gerne anerkende den finansielle støtte fra Royal British Legion. Forskere interesseret i samarbejder eller yderligere detaljer kan kontakte forfatterne eller RBLCBIS.
Vi takker Dr Amarjit Samra, direktør for forskning, Royal Centre for Defence medicin, Birmingham, Det Forenede Kongerige, til støtte for dette arbejde, Scott Armstrong, Institut for kirurgi & kræft, Imperial College London, for assistance med foreløbige forsøg , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, Institut for bioteknologi Imperial College London, og William Proud, Institut for fysik Imperial College London, for råd om chok-tube, Raquel Yustos, forskning tekniker, Institut Biovidenskab, Imperial College London, for teknisk support, Paul Brown MBE, workshop manager og Steve Nelson, workshop tekniker, ringe Institut for fysik, Imperial College London, for at gøre metal, Neal Powell af Institut for fysik, Imperial College London, for illustrationer.
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |