Questo articolo descrive un nuovo modello di ferita di cervello traumatica esplosione primaria. Un tubo di aria compressa guidato d’urto viene utilizzato per esporre in vitro culture hippocampal fetta di mouse per una singola onda d’urto. Si tratta di un protocollo semplice e rapido, generando una lesione del tessuto di cervello riproducibile con un throughput elevato.
Ferita di cervello traumatica è delle cause principali di decesso e invalidità in popolazioni militari e civili. Risultati di ferita di cervello traumatica esplosione dalla detonazione di ordigni esplosivi, tuttavia, i meccanismi che sottendono il danno cerebrale derivando dall’esposizione di sovrapressione di esplosione interamente non sono capiti e sono creduti per essere unico per questo tipo di lesione cerebrale. Modelli preclinici sono strumenti fondamentali che contribuiscono a comprendere meglio la lesione cerebrale indotta da esplosione. Un modello TBI del blast romanzo in vitro è stato sviluppato utilizzando un tubo d’urto a tempo indeterminato per simulare le onde di vita reale campo aperto blast modellate dalla forma d’onda di Friedlander. Su colture organotipiche hippocampal fetta del mouse C57BL/6N sono stati esposti a onde d’urto singole e lo sviluppo della lesione è stato caratterizzato fino a 72 h utilizzando ioduro di propidio, un marcatore fluorescente consolidato di danno delle cellule che solo penetra le cellule con compromesse le membrane cellulari. Fluorescenza di ioduro di propidio era significativamente più alta nelle fette esposte a un’onda d’urto quando confrontato con fette di sham per tutta la durata del protocollo. La ferita del tessuto di cervello è molto riproducibile e proporzionale per la sovrappressione di picco dell’onda shock applicato.
Ferita di cervello traumatica di scoppio (TBI) è un tipo complesso del trauma cranico che deriva dalla detonazione di ordigni esplosivi1,2. Blast TBI è emersa come un importante problema di salute negli ultimi 15 anni con i recenti conflitti militari in Iraq e Afghanistan2,3. Nel complesso, si stima che tra il 4,4% e 22,8% dei soldati di ritorno da Iraq e Afghanistan hanno sofferto TBI delicato, una grande percentuale di questi che sono correlate a scoppio, con un più alto tasso segnalato di blast TBI in forze statunitensi rispetto con le forze di UK4 ,5.
L’uso di dispositivi esplosivi improvvisati è stato responsabile per la maggior parte del trauma blast-collegato, tra cui esplosione TBI, sopportato il6di forze militari. La detonazione di una carica esplosiva si traduce in un rapidissimo — ma transitoria — aumento della pressione, che si verificano in millisecondi. L’onda di sovrapressione risultante da un’esplosione di vita reale campo libero è modellata dalla funzione Friedlander, con un aumento improvviso per la sovrappressione di picco, seguita da un decadimento esponenziale7,8. La gamma di forze estreme e loro corso rapido tempo visto in un evento di esplosione sono solitamente non esperti nel non-blast traumi1,9. La sovrappressione di picco, che è la pressione massima della forma d’onda e la durata dell’onda positiva sono creduti per essere contributori importanti alla ferita di cervello di scoppio e questi dipendono la carica esplosiva e la distanza dalla detonazione10, 11.
Il trauma che risultati da un’esplosione è classificata come quattro componenti discreti, designati come primario, secondario, terziario e Quaternario esplosione ferita10,12,13,14. Ciascuno di questi componenti è associata con meccanismi specifici della ferita. Ferita di scoppio primario deriva dall’azione diretta dell’onda di sovrapressione su organi e tessuti2,13. Risultati di lesioni di scoppio secondario dall’impatto dei frammenti di proiettile, causando penetrante e non-penetrante ferite2,15. Ferita di scoppio terziario si verifica quando il corpo della vittima è spostato contro la terra o di oggetti circostanti ed è associato con le forze di accelerazione/decelerazione1,10,13. Ferita di scoppio quaternario descrive un gruppo eterogeneo di lesioni direttamente collegate all’esplosione non rientrano le prime tre lesioni meccanismi descritti12,13. Esso include (ma non è limitato a) lesioni termiche, inalazione di fumo, radiazioni, onde elettromagnetiche e gli effetti psicologici negativi13,15. Maggior parte blast-collegata TBI risultati direttamente dai primi tre meccanismi della ferita, mentre i meccanismi quaternari della ferita di scoppio sono associati solitamente con lesioni sistemiche13. Gli effetti delle forze di accelerazione/decelerazione (ad es., colpo di frusta), smussare e penetrante lesioni cerebrali traumatiche sono stati ampiamente studiati in relazione ad altri tipi di trauma cranico (ad es., incidenti automobilistici, cadute, balistica ferita). Tuttavia, l’onda di sovrapressione di esplosione primaria è univoco per ferita di scoppio e i suoi effetti sul tessuto cerebrale sono molto meno ben compreso16. I meccanismi di lesione primaria blast, connessi con un’onda di sovrapressione, sono i primi delle forze meccaniche di interagire con il cervello.
Numerosi modelli preclinici di TBI sono stati sviluppati negli ultimi decenni che sono stati preziosi per comprendere meccanismi TBI scoppio della ferita e della patofisiologia e indagare su potenziali nuovi trattamenti, che altrimenti sarebbero impossibili da fare esclusivamente nel clinico impostazione17,18,19. Sebbene nessun singolo modello preclinico in grado di riprodurre la complessità del trauma del cervello clinico blast, in genere diversi modelli preclinici di TBI replicano aspetti distinti di TBI umano. L’azione dannosa delle forze connesso con un’esplosione di esplosione può essere studiato isolatamente o in combinazione in modelli esplosione TBI sia in vitro che in vivo . Modelli in vitro hanno il vantaggio di consentire uno stretto controllo dell’ambiente sperimentale (condizioni fisiologiche dei tessuti e biomeccanica lesioni), che riduce la variabilità biologica e migliora la riproducibilità, permettendo lo studio di senza i confounders presenti nell’animale modelli20cascate molecolari specifici. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello in vitro per studiare gli effetti di esplosione primaria sul tessuto cerebrale. Abbiamo mirato a sviluppare un modello con un’onda d’urto supersonico con un rappresentante di forma d’onda di Friedlander di un’esplosione di campo libero come quello prodotto da un ordigno esplosivo improvvisato (IED).
Fra tutti i meccanismi della ferita si è associata con blast TBI (meccanismi di ferita di scoppio primario, secondario e terziario), primario ferita di scoppio è unico al trauma di scoppio ed è la meno compresa del meccanismi di esplosione-collegata1,2 . Il romanzo protocollo descritto qui è stato sviluppato per studiare esplosione primaria TBI utilizzando un tubo d’urto a tempo indeterminato per esporre in vitro culture hippocampal fetta di mouse a un’onda d’urto singola utilizzando un protocollo semplice e rapido che permette la creazione di un riproducibile esplosione primaria TBI con un throughput elevato.
I primi modelli TBI in vitro esplosione primaria applicato onde di pressione idrostatica a cellule26,27. Tuttavia, la pressione di uscita non modello la funzione Friedlander come la durata di un impulso di pressione idrostatica era molto più lungo nell’aria blast sovrapressione onde13. La caratteristica funzione di Friedlander può essere facilmente modellata in laboratorio utilizzando una scossa tubo1,8. Il tubo d’urto in grado di produrre onde d’urto che simulare esplosioni di campo aperto di vita reale in un ambiente di laboratorio convenzionali, pur consentendo il controllo preciso dei parametri di onda, come sovrappressione di picco, durata onda positiva e impulso, variando la diaframma materiale e spessore e il driver volume8,28,29.
Modelli semplici in vitro come colture cellulari in genere mancano l’eterogeneità dei tipi cellulari e connettività sinaptica30. Recentemente, l’effetto di scoppio su in vitro cellula cerebrale ‘sferoidi’ che incorporano diversi tipi di cellule è stato studiato31. L’indagine successiva di queste preparazioni interessanti è meritato; Tuttavia, non è chiaro come la loro organizzazione cellulare e connettività specchi cervello intatto. OHSC sono una ben consolidata in vitro sperimentale modello23,32, sono facili da cultura e loro citoarchitettura tridimensionale del tessuto, la differenziazione cellulare e la connettività sinaptica sono ben conservati e molto simile a quello in vivo33,34,35,36. OHSCs rappresentano un livello intermedio di complessità tra coltura cellulare e una in vivo modello23,32. OHSCs sono stati dimostrati per riprodurre in vitro patologiche neurodegenerative cascades visto in modelli in vivo e sono stati molto utili nello screening di potenziali farmaci neuroprotettivi e nella comprensione dei loro meccanismi di azione17,21,22,37,38. Infine, l’area anatomica studiata, l’ippocampo, è altamente rilevante in studi traslazionali di TBI, poiché questa regione è danneggiata frequentemente in pazienti TBI39,40,41. OHSC sono stati utilizzati a scoppio modello TBI28,42,43,44, tuttavia, il nostro modello è relativamente semplice e può essere adattato a shock-tubi esistenti in orizzontale o verticale configurazioni senza complessi adattamenti.
OHSC possono essere tenute in coltura per molti giorni, che facilita lo studio dei processi biologici nel corso tempo34. In questo modello, la lesione del tessuto che è derivato dall’esposizione di onda d’urto è stata misurata ogni giorno per tre giorni, dopo l’esposizione di scoppio con ioduro di propidio, un indicatore ben consolidato di danno delle cellule. Ioduro di propidio è un colorante non tossico altamente polare che penetra le cellule con compromessi delle membrane cellulari, dove si lega agli acidi nucleici ed esibisce una caratteristica fluorescenza rosso brillante24,25,45. La fluorescenza misurata con ioduro di propidio ha dimostrata di avere una buona correlazione con conta cellulare danneggiato utilizzando46,47di colorazione di Nissl.
Dato che la lesione prodotta in questo modello era diffusa (Figura 2), la fluorescenza della fetta intera è stata misurata durante l’esecuzione dell’analisi, simile al lavoro precedentemente pubblicato in altri cervello lesioni paradigmi21,22 , invece di utilizzare specifiche regioni, come è stato fatto in altri in vitro blast TBI modelli28,43,44,48. L’approccio globale utilizzato nel modello descritto in questo articolo, inoltre, Elimina la variabilità potenziale che è stato introdotto quando delineare regioni di interesse definite e fornisce un quadro più completo della ferita correlate a scoppio. Sia le sovrapressioni di picco di onda d’urto, 50 kPa e 55 kPa, prodotto significativo (p < 0,05 e p < 0,0001, rispettivamente) lesioni rispetto alle fette di sham (Figura 2B). Come anticipato, l’onda d’urto con la sovrappressione di picco più alta, 55 kPa, prodotto più lesione che l’onda di 50 kPa. In un modello in vitro con cervello isolato tessuto esposto direttamente a un’onda d’urto, come scalare con precisione a tutto l’organismo o un essere umano non è semplice. Tuttavia, l’onda d’urto che abbiamo usato è all’interno della gamma di sovrapressioni di picco osservato nel campo, in genere 50-1.000 kPa8,49.
Al fine di mantenere il OHSC esposto alla temperatura fisiologica e livelli di ossigeno e anidride carbonica, garantendo nel contempo che erano liberi da contaminazione in tutto il protocollo di esposizione di onda d’urto, gli inserti di coltura del tessuto sono stati sigillati in sterile sacchi in polietilene seguendo una tecnica asettica, sommersa in mezzo sperimentale riscaldato a 37 ° C e appena fatto gorgogliare con 95% di ossigeno e 5% anidride carbonica, analogamente al lavoro precedentemente pubblicato28,43,44 ,48. Contrariamente a questi modelli dove sono stati utilizzati dispositivi complessi per tenere i sacchetti sterili durante l’esposizione di onda d’urto, in questo protocollo, un metodo semplice e veloce è stato utilizzato per sospendere gli inserti di coltura del tessuto OHSC davanti alla presa del tubo di scossa (Figura 1A, C ). Il modello descritto in questa carta consente un’elaborazione rapida e una portata elevata, riducendo al minimo il rischio di ipotermia. Questi aspetti sono particolarmente rilevanti per gli studi di neuroprotezione, dato che alcuni interventi terapeutici possono avere una finestra di tempo molto limitato potenziale applicazione dopo TBI. Questo protocollo di esposizione romanzo shock wave permette 6 a 9 coltura tissutale inserisce (in genere 36 a 54 hippocampal organotypic fettine di tessuto) per essere esposti a un’onda d’urto in un breve intervallo di tempo (circa 1 h).
Il OHSCs richiede buona asettiche. È importante utilizzare una cappa a flusso laminare asettica durante la messa in coltura e durante il trasferimento i sacchetti sterili per blast. Al fine di effettuare l’imaging fetta in condizioni asettiche con i coperchi delle piastre 6 pozzetti in luogo, utilizziamo anelli di metallo su misura per sollevare gli inserti di cultura delle cellule per il piano focale del microscopio. Una parte importante del nostro protocollo è che includiamo fette sham illeso in ogni esperimento. Sham fette sono trattati in modo identico a fette di esplosione con l’eccezione che il tubo d’urto non è licenziato; un altro passo importante è che tutte le fette sono Imaging 1h prima ferita o trattamento sham, per garantire che la salute della popolazione di fette utilizzati sono identici (Figura 2B).
Oltre a quantificare la lesione delle cellule nelle fette nel corso del tempo, il tessuto può essere fissato alla fine dell’esperimento per immunohistochemistry convenzionali50. Abbiamo sviluppato e valutato il metodo utilizzando fette hippocampal del topo. Tuttavia, la nostra tecnica potrebbe essere facilmente adattata a utilizzare altri tessuti che possono essere coltivati in cultura, come il midollo spinale, retina, del polmone o del tessuto epiteliale. In questa carta e il nostro lavoro precedente con il modello, abbiamo studiato solo l’effetto dell’esposizione ad una singola esplosione. Tuttavia, il modello sarebbe adatto per studiare gli effetti di basso livello ripetuti scoppi il cervello o di altri tessuti. OHSCs possono essere tenute in coltura per molte settimane o addirittura mesi, consentendo effetti cronici di essere studiato.
Modelli in vitro , di essere più semplice rispetto ai modelli in vivo , hanno un throughput più elevato, sono meno costosi ed esperimenti di solito possono essere completati su un più breve tempo scala17. Tuttavia, i risultati ottenuti utilizzando modelli in vitro devono essere convalidati in modelli animali come tessuti in vitro coltivate sono conservati in un ambiente artificiale e possono rispondere a un danno in modo diverso da quello che farebbero in vivo17. Ciò nonostante, modelli in vitro sono stati estremamente utili per aumentare la nostra comprensione delle cascate di ferita di cervello e nello screening droghe neuroprotective prima l’uso di più complesse in vivo modelli17,22 , 51 , 52. nonostante i numerosi vantaggi offerti da questo modello, è importante notare che in vitro modelli mancano la chiave caratteristiche di TBI presentano in animali e modelli in vivo , quali gli effetti sul sistema vascolare, aumentato intracranico pressione, risposta immunitaria sistemica e compromissione funzionale del comportamento, che evidenzia la necessità di convalidare i risultati trovati in modelli in vitro nell’animale intero. Tuttavia, in vitro modelli come il modello descritto in questa carta sono estremamente utili traduzionalmente pertinenti strumenti scientifici.
In conclusione, questo lavoro descrive un nuovo metodo semplice e diretto dove mouse organotipiche colture hippocampal sono esposti a strettamente controllate e riproducibile reali pertinenti onde d’urto utilizzando un tubo di scossa di laboratorio. La ferita globale risultante, che è stata quantificata utilizzando ioduro di propidio, un indicatore ben consolidato di danno cellulare, è molto riproducibile ed è proporzionale la sovrappressione di picco delle onde shock applicati.
The authors have nothing to disclose.
Supportato da: Royal centro difesa medicina, Birmingham, Regno Unito, Royal British Centre Legione per Blast lesioni studi, Imperial College London, Regno Unito. Medical Research Council, Londra, Regno Unito (MC_PC_13064; MR/N027736/1). Il Gas sicurezza Trust, Londra, Regno Unito. Rita Campos-Pires è stato il destinatario di un premio di formazione dottorale da Fundação para un Ciência e Tecnologia, Lisbona, Portogallo. Katie Harris è stato il destinatario di un PhD studentship da il Westminster Medical School Research Trust, Londra, Regno Unito.
Questo modello è stato sviluppato con il supporto del centro Royal British Legion per Blast lesioni studi (RBLCBIS) presso l’Imperial College. Vorremmo riconoscere il sostegno finanziario di Royal British Legion. I ricercatori interessati a collaborazioni o ulteriori dettagli possono contattare gli autori o RBLCBIS.
Ringraziamo Dr Amarjit Samra, direttore della ricerca, Royal Centre per difesa medicina, Birmingham, Regno Unito, per sostenere questo lavoro, Scott Armstrong, dipartimento di chirurgia & cancro, Imperial College di Londra, per assistenza con esperimenti preliminari , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, dipartimento di Bioingegneria Imperial College London, William Proud, dipartimento di fisica Imperial College di Londra, per un Consiglio sul tubo della scossa, Raquel Yustos, tecnico, dipartimento di ricerca di Scienze della vita, Imperial College di Londra, per supporto tecnico, Paul Brown MBE, officina e Steve Nelson, tecnico di laboratorio, dipartimento di fisica dell’Imperial College di Londra, per rendere il metallo anelli, Neal Powell del dipartimento di fisica, Imperial College di Londra, per opera d’arte.
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |