Detta dokument beskriver en ny modell av primära blast traumatisk hjärnskada. En tryckluft driven signalledares används för att exponera in vitro- mus Hippocampus slice kulturer till en enda chockvåg. Detta är en enkel och snabb protokoll som genererar en reproducerbar hjärnskada vävnad med ett högt dataflöde.
Traumatisk hjärnskada är en ledande orsak till död och funktionshinder i militära och civila befolkningar. Blast traumatisk hjärnan skada resultat från detonation av spränganordningar, men de mekanismer som ligger bakom de hjärnskador som följd av blast övertryck exponering inte är helt klarlagda och tros vara unikt för denna typ av hjärnskada. Prekliniska modeller är avgörande verktyg som bidrar till att bättre förstå blast-inducerad hjärnskada. En TBI romanen in vitro- blast modell har utvecklats med en förutsättningslös signalledares för att simulera verkliga öppna-fältet blast vågor modellerades av Friedlander vågformen. C57BL/6N mus organotypic Hippocampus slice kulturer utsattes för enda chockvågor och utvecklingen av skada präglades upp till 72 h använder propidium jodid, en väletablerad fluorescerande markör för cellskador som bara tränger celler med äventyras cellulära membran. Propidium jodid fluorescens var betydligt högre i de skivor som utsätts för en tryckvågor jämfört med sham skivor under hela protokollet. Hjärnans vävnadsskada är mycket reproducerbara och proportion till peak övertrycket av de tryckvågor som tillämpas.
Blast traumatisk hjärnskada (TBI) är en komplex typ av hjärnskada som resulterar från detonation av spränganordningar1,2. Blast TBI har uppstått som ett stort hälsoproblem i de senaste 15 åren med de senaste militära konflikterna i Irak och Afghanistan2,3. Övergripande, det uppskattas att mellan 4,4% och 22,8% av soldater som återvänder från Irak och Afghanistan har lidit mild TBI, en stor del av dessa är blast-relaterade, med en högre frekvens av blast TBI i de amerikanska styrkorna jämfört med UK krafter4 ,5.
Användning av spränganordningar har varit ansvarig för de flesta av blast-associerade trauma, inklusive blast TBI, fick utstå den militära styrkor6. Detonation av en explosiv laddning resulterar i en mycket snabb — men övergående — ökning av tryck, som förekommer i millisekunder. Den resulterande övertryck våg från en verkliga livet gratis-fältet explosion är modellerad av funktionen Friedlander, med en plötslig ökning till peak övertrycket följt av en exponentiell förruttnelse7,8. Utbudet av extrema krafter och deras snabba tid kursen sett i en blast händelse upplevs vanligtvis inte i icke-blast trauman1,9. Topp övertrycket, vilket är det maximala trycket i vågformen, och varaktigheten av den positiva våg tros vara viktig bidragsgivare till blast hjärnskada och dessa beror på sprängladdning och avståndet från detonation10, 11.
Traumat att resultat från en explosiv blast klassificeras som fyra diskreta komponenter betecknas som primär, sekundär, tertiär och Kvartär blast skada10,12,13,14. Var och en av dessa komponenter är associerade med specifika mekanismer för skada. Primära blast skada resultat från den direkta åtgärden av övertryck vågen på organ och vävnader2,13. Sekundära blast skada resultat från inverkan av projektil fragment, orsakar genomträngande och icke-penetrerande sår2,15. Tertiär blast skadan uppstår när offrets kropp är förskjuten mot marken eller omgivande föremål och är associerad med acceleration/retardation krafter1,10,13. Kvartära blast skada beskriver en heterogen grupp av skador direkt relaterade till explosion inte omfattas av de första tre skada mekanismer beskrivna12,13. Det inkluderar (men begränsas inte till) termisk skada, rök inandning, strålning, elektromagnetiska vågor och psykologiska biverkningar13,15. De flesta blast-associerade TBI resultat direkt från de första tre mekanismerna för skada, medan de Kvartära mekanismerna för blast skada associeras vanligtvis med systemisk skada13. Effekterna av acceleration/retardation styrkor (t.ex., whiplash), trubbig och genomträngande traumatisk hjärnskada har studerats i förhållande till andra typer av TBI (t.ex.motorfordon kraschar, falls, ballistiska skada). Men den primära tryckvågor övertryck är unik för blast skada och dess effekter på hjärnvävnaden är mycket mindre förstådda16. De primära blast skada mekanismer, är associerad med ett övertryck vågen, är först av de mekaniska styrkorna att interagera med hjärnan.
Ett flertal prekliniska TBI modeller har utvecklats under de senaste årtiondena som har varit ovärderligt att förstå blast TBI mekanismer av skada och patofysiologi och utreda potentiella nya behandlingar, som annars skulle vara omöjligt att göra uteslutande i den kliniska inställningen17,18,19. Även om ingen enda preklinisk modell kan återge komplexiteten i kliniska blast hjärna trauma, vanligtvis replikera olika prekliniska TBI modeller olika aspekter av mänskliga TBI. Skadliga verkan av de krafter som är associerad med en blast explosion kan studeras isolerat eller i kombination i både in vitro- och in-vivo blast TBI modeller. In vitro -modeller har fördelen att en sträng kontroll av experimentella miljön (vävnad fysiologiska tillstånd och skada biomekanik), vilket minskar biologisk variabilitet och förbättrar reproducerbarhet, tillåter studier av specifika molekylära kaskader utan confounders som är närvarande i djur modeller20. Vårt mål var att utveckla ett in vitro- modell för att undersöka effekterna av primära blast på hjärnvävnad. Vi syftar till att utveckla en modell med en supersonic shockwave med Friedlander vågform representant för en gratis-fältet explosion som produceras av en improviserad sprängladdning (IED).
Bland alla mekanismer för skada som är associerad med blast TBI (primär, sekundär och tertiär blast skada mekanismer), primära blast skada är unika för blast trauma och det är den minst förstådda av blast-associerade mekanismer1,2 . Det nya protokollet som beskrivs här har utvecklats för att studera primära blast TBI använder en öppen signalledares för att exponera in vitro- mus Hippocampus slice kulturer till en enda chockvåg som med en enkel och snabb protokoll som möjliggör skapandet av en reproducerbar primära blast TBI med ett högt dataflöde.
De första in vitro- primära blast TBI modellerna tillämpas hydrostatiska tryckvågor celler26,27. Tryck utdata dock inte modell funktionen Friedlander som varaktigheten av en hydrostatiskt tryck puls var mycket längre än luftburna blast övertryck vågor13. Karakteristiskt Friedlander funktion kan modelleras enkelt i laboratoriet använder en shock tube1,8. Chocken röret kan producera chockvågor som simulerar verkliga livet öppna fältet explosioner i konventionella laboratoriemiljö, samtidigt som den exakt kontrollen av våg parametrar, såsom peak övertryck, positiva våg varaktighet och impuls, genom att variera den membran material och tjocklek, och de driver volym8,28,29.
Enkelt in vitro- modeller såsom cellkulturer saknar oftast heterogenitet celltyper och synaptic anslutning30. Effekten av blast på in vitro- hjärncell ‘spheroids’ införliva olika celltyper har nyligen varit undersökta31. Ytterligare utredning av dessa intressanta preparat är meriterade; men är det inte klart hur deras cellulära organisation och connectivity speglar intakt hjärnan. OHSC är en väletablerad i vitro experimental modell23,32, är lätt att kultur och deras tredimensionella vävnad cytoarchitecture, celldifferentiering och synaptic anslutning är väl bevarade och mycket liknar det i vivo33,34,35,36. OHSCs representerar en mellanliggande nivå av komplexitet mellan cellkultur och en i vivo modell23,32. OHSCs har visat att reproducera i vitro patologiska neurodegenerativa cascades sett i i vivo modeller och har varit mycket användbar i screening av potentiella neuroprotektiva droger och förstå deras verkningsmekanismer åtgärd17,21,22,37,38. Slutligen det anatomiska området studeras, hippocampus, är mycket relevant i translationell TBI studier, denna region är ofta skadad i TBI patienter39,40,41. OHSC har använts till modell blast TBI28,42,43,44, men vår modell är relativt enkel och kan anpassas till befintliga chock-rör i antingen horisontell eller vertikal konfigurationer utan komplexa anpassningar.
OHSC kan hållas i kultur i många dagar, vilket underlättar utredningen av biologiska processer över tid34. I denna modell var den vävnadsskada som resulterade från chockvåg exponering mätas dagligen under tre dagar, efter den blast exponeringen med hjälp av propidium jodid, en väletablerad markör för cellskador. Propidium jodid är ett giftfritt mycket polar färgämne som penetrerar cellerna med komprometterad cellulära membran, där det binds till nukleinsyror och uppvisar en karakteristisk ljusa röd fluorescens24,25,45. Fluorescensen mätt med propidium jodid har visat sig ha en god korrelation med skadade celler använder Nissl färgning46,47.
Med tanke på att den skada som produceras i denna modell var diffus (figur 2 c), mättes fluorescensen i den hela sektionens när du utför analysen liknar tidigare publicerade arbete i andra hjärnan skada paradigm21,22 , istället för att använda särskilda regioner, som har gjorts i andra in vitro- modeller blast TBI28,43,44,48. Den övergripande strategin som används i den modell som beskrivs i den här artikeln eliminerar också det potentiella variabilitet som införs när beskriver definierade regioner av intresse och ger en mer heltäckande bild av den blast-relaterad skadan. Både chockvåg peak overpressures, 50 kPa och 55 kPa, producerat signifikant (p < 0,05 och p < 0,0001, respektive) skada jämfört med sham skivor (figur 2B). Som väntat, stötvågen med högsta topp övertrycket, produceras 55 kPa, mer skada än 50 kPa vågen. I in vitro- modell med isolerade hjärnans utsatta vävnad direkt för en shockwave, hur man korrekt skala till hela organismen eller en människa är inte okomplicerad. Ändå är de chockvågor som vi använt inom spänna av peak overpressures observerats i området, normalt 50-1000 kPa8,49.
För att upprätthålla den OHSC utsätts för fysiologisk temperatur och nivåer av syre och koldioxid, samtidigt som man säkerställer att de var fria från föroreningar i hela chockvåg exponering protokollet, beseglades vävnadsodling skären till steril polyetylenpåsar efter en aseptisk teknik, nedsänkt i experimentell medium värmas till 37 ° C och nymalen bubblade med 95% syre och 5% koldioxid, på samma sätt som tidigare publicerade arbete28,43,44 ,48. Tvärtemot dessa modeller där komplexa enheter användes för att hålla de sterila påsarna under chockvåg exponering, i detta protokoll, användes en enkel och snabb metod att avbryta OHSC vävnadsodling skären framför utloppet shock tube (figur 1A, C ). Den modell som beskrivs i detta dokument tillåter snabb behandling och hög genomströmning, samtidigt som du minimerar risken för hypotermi. Dessa aspekter är särskilt relevanta för neuroprotektion studier med tanke på att några terapeutiska interventioner kan ha en mycket begränsad tidsfönstret för potentiella program efter TBI. Denna roman chockvåg exponering protokoll tillåter 6 till 9 vävnadsodling skär (normalt 36 till 54 Hippocampus organotypic vävnad skivor) för att utsättas för en chockvåg i ett kort tidsintervall (ca 1 h).
OHSCs kräver bra aseptisk teknik i hela. Det är viktigt att använda en aseptisk LAF i hela odling och vid överföring till sterila påsar för blast. För att genomföra slice bildtagning under aseptiska förhållanden med locken av 6-väl plattorna på plats, använder vi skräddarsydda metallringar för att höja cell kultur skären till fokalplanet av mikroskopet. En viktig del av vårt protokoll är att vi inkluderar oskadd sham skivor i varje experiment. Sham skivor behandlas identiskt till blast skivor med undantaget att inte avfyras chock-röret; ett annat viktigt steg är att alla skivor är avbildade 1 h innan skada eller simulerad behandling, så att hälsan hos befolkningen i skivor som används är identiska (figur 2B).
Förutom att kvantifiera cell skada i skivor över tid, kan vävnaden vara fast i slutet av experimentet för konventionella immunohistokemi50. Vi utvecklade och utvärderade metoden som använder mus Hippocampus skivor. Vår teknik kan dock enkelt anpassas till använda annan vävnad som kan odlas i kultur, såsom ryggmärgen, näthinnan, lunga eller epitelvävnad. I detta papper och vårt tidigare arbete med modellen undersökte vi bara effekten av exponering för en enda signal. Modellen skulle dock väl lämpad att undersöka effekterna av upprepad lågaktivt Blaster på hjärnan eller annan vävnad. OHSCs kan hållas i kultur i flera veckor eller t.o.m. månader, vilket gör att kroniska effekter ska undersökas.
In vitro modeller, att vara enklare än i vivo modeller, har en högre genomströmning, är billigare och experiment kan oftast utföras på en kortare tid skala17. De resultat som erhålls med hjälp av in vitro- modeller behöver dock valideras i djurmodeller som i vitro odlade vävnader hålls i en artificiell miljö och kan svara på skada annorlunda från vad de skulle i vivo17. Ändå, in vitro- modeller har varit oerhört värdefullt för att öka vår förståelse av hjärnan skada kaskader och screening neuroprotektiva droger innan användningen av mer komplexa i vivo modeller17,22 , 51 , 52. Trots de många fördelarna som erbjuds av denna modell, är det viktigt att notera att in vitro- modeller saknar nyckeln dragen av TBI presentera i djur och i vivo modeller, såsom effekter på kärlsystemet, ökat intrakraniellt Tryck, systemisk immunsvar och beteendemässiga funktionsnedsättningar, som belyser behovet av att validera resultaten i in vitro- modeller i hela djuret. In vitro- modeller såsom den modell som beskrivs i detta dokument är dock mycket användbara translationally relevanta vetenskapliga verktyg.
Avslutningsvis beskriver detta arbete en enkel och okomplicerad roman metod där mus organotypic Hippocampus vävnadskulturer utsätts för hårt kontrollerade och reproducerbara verkliga relevanta chockvågor använder ett laboratorium signalledares. Resulterande globala skadan, som kvantifierades använder propidium jodid, en väletablerad markör för cellskador, är mycket reproducerbara och är proportionell mot peak övertrycket av den chock som tillämpas.
The authors have nothing to disclose.
Stöds av: Royal Centre för försvar medicin, Birmingham, Storbritannien, Royal British Legion centrum för Blast skada studier, Imperial College London, Storbritannien. Medicinska forskningsrådet, London, Storbritannien (MC_PC_13064; MR/N027736/1). Gassäkerhet Trust, London, Storbritannien. Rita Campos-Pires var mottagare av en forskarutbildning award från den Fundação para en Ciência e en Tecnologia, Lissabon, Portugal. Katie Harris var mottagare av doktorand från Westminster medicinska skolan forskning Trust, London, Storbritannien.
Denna modell har utvecklats med stöd av Royal British Legion centrum för Blast skada studier (RBLCBIS) vid Imperial College. Vi vill erkänna det finansiella stödet från de Royal British Legion. Forskare intresserade av samarbeten eller ytterligare information kan kontakta upphovsmännen eller RBLCBIS.
Vi tackar Dr Amarjit Samra, forskningschef, Royal Centre för försvar medicin, Birmingham, Storbritannien, för att stödja detta arbete, Scott Armstrong, Avd för kirurgi & Cancer, Imperial College London, för hjälp med preliminära experiment , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, Institutionen för bioteknik Imperial College London, och William Proud, Institutionen för fysik Imperial College London, för råd om chock-röret, Raquel Yustos, forskning tekniker, Institutionen Biovetenskap, Imperial College London, för teknisk support, Paul Brown MBE, verkstadschefen och Steve Nelson, workshop tekniker, ringar Institutionen för fysik, Imperial College London, för att göra metallen, Neal Powell av Institutionen för fysik, Imperial College London, för konstverk.
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |