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Immunology and Infection

डेंगू वायरस आरएनए को मापने वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा संक्रमित कोशिकाओं की संस्कृति Supernatant में

Published: November 1, 2018 doi: 10.3791/58407
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Infection Control, Osaka Medical College

Summary

वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया विश्लेषण रिवर्स प्रतिलेखन के साथ संयुक्त (RT-qPCR) व्यापक रूप से आरएनए वायरस संक्रमण के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ हम एक प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख प्रस्तुत करते हैं, जिसमें डेंगू वायरस सहित कई आरएनए वायरस के ठहराव के लिए विकसित एक आरएनए शुद्धि चरण की आवश्यकता नहीं है ।

Abstract

वर्तमान में, वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रौद्योगिकी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में वायरल जीनोम का पता लगाने और ठहराव के लिए एक अनिवार्य उपकरण है, साथ ही आणविक निदान के लिए, अपनी संवेदनशीलता, विशिष्टता के कारण, और सुविधा. हालांकि, ज्यादातर मामलों में, मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) आमतौर पर वायरस के संक्रमण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया परख वायरल न्यूक्लिक एसिड की शुद्धि के लिए पहले पीसीआर कदम पर भरोसा है । इस अध्ययन में, प्रतिदीप्ति आधारित रिवर्स प्रतिलेखन qPCR (RT-qPCR) परख एक प्रसंस्करण बफर और एक कदम आरटी-पीसीआर एजेंट के संयोजन के माध्यम से विकसित की है ताकि पूरी प्रक्रिया, संस्कृति supernatant के वायरस से संक्रमित की फसल से वास्तविक समय का पता लगाने जब तक कोशिकाओं, वायरल आरएनए शुद्धि के बिना प्रदर्शन किया जा सकता है । स्थापित प्रोटोकॉल ९० मिनट के भीतर डेंगू वायरस (देंव) की आरएनए सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के ठहराव सक्षम बनाता है । इसके अलावा, एक एंटीवायरल एजेंट के मूल्यांकन के लिए प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख के अनुकूलन क्षमता एक इन विट्रो प्रयोग में एक पहले रिपोर्ट देंव अवरोध करनेवाला, mycophenolic एसिड (MPA) का उपयोग करके प्रदर्शन किया है । इसके अलावा, अन्य आरएनए वायरस, जिनमें येलो फीवर वायरस (YFV), Chikungunya वायरस (CHIKV), और खसरा वायरस (MeV) शामिल हैं, को एक ही प्रोटोकॉल के साथ डायरेक्ट आरटी-quantified द्वारा qPCR किया जा सकता है । इसलिए, इस रिपोर्ट में वर्णित प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख एक सरल और तेजी से तरीके से आरएनए वायरस प्रतिकृति की निगरानी के लिए उपयोगी है, जो आगे एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग अध्ययन और नैदानिक निदान के लिए एक होनहार मंच में विकसित किया जाएगा ।

Introduction

Flaviviridae परिवार की जीनस Flavivirus से अधिक ७० लिफाफे, सकारात्मक असहाय आरएनए वायरस है कि मच्छरों और ticks द्वारा फैलता है शामिल हैं । महत्वपूर्ण बात, मानव में flavivirus संक्रमण अक्सर गंभीर नैदानिक बीमारी की ओर जाता है, जैसे रक्तस्रावी बुखार और इन्सेफेलाइटिस1. दरअसल, Zika वायरस (ZIKV), एक flavivirus का हाल ही का प्रकोप, अमेरिका भर में विस्फोटक फैल गया है और microcephaly2,3सहित स्नायविक जटिलताओं के साथ जुड़े होने के लिए दिखाया गया है । Flaviviruses, इसलिए, आधुनिक समाज पर महत्वपूर्ण नैदानिक और आर्थिक प्रभाव है ।

एक महत्वपूर्ण flavivirus डेंगू वायरस (देंव), एक मच्छर जनित वायरस व्यापक रूप से दुनिया के उष्णकटिबंधीय और उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में वितरित किया जाता है । देंव एडीज मच्छरों द्वारा फैलता है, जिसमें एडीज albopictus और एडीज aegyptiशामिल होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डेंगू का प्रकोप4के वैश्विक प्रसार में होता है । वर्तमान में, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ने डेंगू रोग को तीन श्रेणियों के रूप में वर्गीकरण: डेंगू बिना चेतावनी के संकेत, चेतावनी के संकेत के साथ डेंगू, और गंभीर डेंगू4. हालांकि प्राथमिक संक्रमण देंव के चार serotypes में से एक के साथ (देंव-1 से-4) अक्सर स्पर्शोन्मुख या स्वयं सीमित है, epidemiologic अध्ययन से पता चला है कि अलग serotypes के माध्यमिक संक्रमण डेंगू के अधिक गंभीर रूपों का खतरा बढ़ जाता है । यह ध्यान देने योग्य है कि प्राथमिक संक्रमण के दौरान उत्पादित गैर या बेअसर एंटीबॉडी की वजह से देंव संक्रमण के एंटीबॉडी पर निर्भर वृद्धि, द्वितीयक संक्रमण के रूप में हुई है जो गंभीर डेंगू के एक संभावित तंत्र के रूप में प्रस्तावित किया गया है लायक है । हालांकि, कोई विशिष्ट एंटीवायरल दवा देंव संक्रमण5के लिए उपलब्ध है ।

देंव, दिनचर्या और मजबूत परख है, जो एक उच्च प्रवाह की स्थापना के लिए उत्तरदाई है के खिलाफ एंटीवायरल एजेंटों के विकास के लिए, वायरस प्रतिकृति मात्रात्मक का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । पारंपरिक, जैविक परख (उदाहरणके लिए, पट्टिका परख) संक्रामक वायरस और प्रतिरक्षा परख (जैसे, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख [एलिसा]) वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है देंव पर नजर रखने के लिए इन विट्रो में और vivo6,7में प्रतिकृति । हालांकि, इन परख अक्सर श्रमसाध्य है और कई दिनों को पूरा करने की आवश्यकता है, जो नमूनों की बड़ी संख्या की हैंडलिंग में बाधा उत्पंन । इस संबंध में, RT-qPCR देंव संक्रमण का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय परख है: यह विशिष्ट है, संवेदनशील, और अपेक्षाकृत तेजी से7. इसके अलावा, RT-qPCR तकनीक एक उच्च-प्रवाह स्वरूप में अधिक लाभ है । फिर भी, आरएनए वायरस के लिए आरटी-पीसीआर की विशिष्ट प्रक्रिया एकत्र नमूनों से वायरल न्यूक्लिक एसिड की वसूली की मांग करता है । हालांकि विभिंन निष्कर्षण तरीकों RT-qPCR के लिए नियोजित किया जा सकता है, कई कदम अभी भी शुद्ध वायरल आरएनए प्राप्त करने की जरूरत है । इसके अलावा, RT-qPCR परख आम तौर पर महंगी स्पिन कॉलम या खतरनाक कार्बनिक सॉल्वैंट्स की आवश्यकता होती है, जिससे तैयारी प्रक्रिया को अधिक बोझिल बना । के बाद से परहेज और/या पार के नमूनों के बीच संदूषण वायरल जीनोम के सफल ठहराव के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, एक कम श्रमसाध्य और समय लेने वाली विधि पसंद है, विशेष रूप से अगर आर टी-qPCR को लागू किया जाना है उच्च-प्रवाह स्वरूप ।

यहां, हम संक्रमित कोशिकाओं है कि वायरल आरएनए शुद्धि शामिल नहीं है की एक संस्कृति supernatant में देंव आरएनए को मापने के लिए एक सरल आरटी-qPCR प्रक्रिया की रिपोर्ट । इस अनुकूलित RT-qPCR प्रोटोकॉल दो चरणों से बना है: i) एक प्रसंस्करण बफर के साथ देंव-संक्रमित कोशिका संस्कृति की supernatant की मशीन, और द्वितीय) एक कदम आरटी एक वास्तविक समय पीसीआर साधन पर qPCR । तदनुसार, एक संस्कृति supernatant में देंव आरएनए ९० मिनट (चित्रा 1) के भीतर पता लगाया जा सकता है । हम भी अन्य आरएनए वायरस संक्रमण के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR के आवेदन का वर्णन ।

Protocol

1. आरएनए मानक के डीएनए टेम्पलेट की तैयारी

  1. एक पीसीआर मिक्स तैयार (५० μL की कुल मात्रा, तालिका 1) एक प्लाज्मिड डीएनए वेक्टर युक्त देंव-2 नई गिनी सी (NGC, का उपयोग प्रवेश संख्या: वायुसेना 038403.1) 3 ' अनअनुवादित क्षेत्र (3 ' UTR)8 और प्राइमरी (T7-देंव 3 ' UTR Fwd और देंव 3 ' UTR Rvs) एक ०.२ एमएल ट्यूब में, के रूप में तालिका 2में वर्णित है ।
    नोट: यह कदम किसी भी amplicon से संबंधित उत्पादों के संदूषण से बचने के लिए एक स्वच्छ डाकू (या एक साफ कमरे में) के तहत आयोजित किया जाना है ।
  2. पीसीआर-एक thermocycler में T7 अनुक्रम-जुड़े देंव 3 ' UTR के सीडीएनए बढ़ाना, निंन स्थितियों का उपयोग: 30 चक्र (९८ ° c के लिए 10 s, ५५ ° c के लिए 5 s, और ७२ ° c 5 s के लिए) ।
  3. 6x जेल के 10 μL के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण-डाई लोड हो रहा है और यह एक डीएनए आणविक ०.१ से 10 kilobase जोड़े (kbp) को लेकर सीढ़ी के साथ एक 1% agarose जेल पर लोड ।
  4. एक डीएनए विज़ुअलाइज़ेशन विधि और एक जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग लंबी तरंग दैर्ध्य यूवी प्रकाश के तहत पीसीआर उत्पाद (४७९ आधार जोड़े [बीपी]) कल्पना । एक साफ स्केलपेल का उपयोग कर डीएनए बैंड काट दिया ।
  5. एक डीएनए शोधन किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर डीएनए निकालें ।
    नोट: यह शुद्धिकरण चरण क्लीन हुड के बाहर किया जा सकता है, लेकिन RNase संदूषण से बचने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान एक स्वच्छ वातावरण रखना अनिवार्य है, जो निम्न देंव आरएनए मानक संश्लेषण चरणों में एक प्रमुख समस्या है.
    1. जेल स्लाइस वजन और प्रति कब्जा बफर की १०० μL जोड़ने के १०० मिलीग्राम जेल टुकड़ा एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ।
    2. 5-15 मिनट के लिए ६० ° c पर मशीन द्वारा जेल भंग ।
    3. एक संग्रह ट्यूब के साथ एक डीएनए शुद्धि कॉलम को इकट्ठा करने और भंग नमूना के ६०० μL शुद्धि कॉलम के लिए स्थानांतरण ।
    4. 30 एस के लिए १६,००० x जी पर केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें । नमूना मात्रा ६०० μL से अधिक है, तो पहले स्पिन के बाद डीएनए शुद्धि स्तंभ के लिए नमूने के बाकी लागू करें और इस चरण को दोहराएँ ।
    5. लागू करें ५०० μL धोने बफर के डीएनए शोधन कॉलम ।
    6. 30 एस के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक
    7. स्तंभ को एक नए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रखें ।
    8. ५० रेफरेंस बफर के μL जोड़ें और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कॉलम की मशीन ।
    9. elute डीएनए के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर केंद्रापसारक ।
  6. eluted नमूना के 3 μL का उपयोग कर एक spectrophotometer पर २६० एनएम पर डीएनए के ऑप्टिकल घनत्व को मापने । एक रिक्त के रूप में रेफरेंस बफ़र के समान वॉल्यूम का उपयोग करें ।
    नोट: डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. देंव 3 ' UTR आरएनए मानक का संश्लेषण

नोट: निम्न चरणों का पालन करने के लिए जितना संभव हो ribonuclease (RNase)-मुक्त वातावरण बनाए रखें. एजेंट के सेट अप एक साफ हुड के अंदर प्रदर्शन किया जाना चाहिए, nuclease का उपयोग कर मुक्त pipets, टिप्स, और ट्यूबों ।

  1. मिक्स इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT) प्रतिक्रिया (20 μL की कुल मात्रा के) १०० एनजी के साथ T7 आरएनए प्रवर्तक अनुक्रम-जुड़े देंव 3 ' UTR डीएनए टेम्पलेट (चरण १.६ से) एक ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूब में वर्णित के रूप में तालिका 3.
  2. 2 एच के लिए thermocycler में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण की मशीन ।
  3. IVT प्रतिक्रिया के लिए DNase के 1 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन जारी है ।
  4. शुद्ध में इन विट्रो एक आरएनए शुद्धि किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर आरएनए लिखित ।
    1. जोड़ें ८० μL की RNase-free ज2O और ३५० μL का कैप्चर बफ़र, जिसमें 1% β-mercaptoethanol है ।
    2. IVT प्रतिक्रिया करने के लिए १००% इथेनॉल के २५० μL जोड़ें और यह अच्छी तरह से pipetting द्वारा मिश्रण ।
    3. एक संग्रह ट्यूब के साथ एक आरएनए शुद्धि स्तंभ को इकट्ठा करने और शुद्धि स्तंभ के लिए आरएनए नमूना हस्तांतरण ।
    4. यह 15 एस के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    5. लागू करें ५०० धोने बफर के μL आरएनए शुद्धि कॉलम के लिए और यह 2 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. स्तंभ को १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रखें ।
    7. जोड़ें ५० μL के RNase-मुफ्त एच2ओ और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कॉलम की मशीन ।
    8. यह आरएनए elute करने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर यह केंद्रापसारक ।
  5. एक spectrophotometer पर २६० एनएम पर आरएनए के ऑप्टिकल घनत्व को मापने, eluted नमूना के 3 μL का उपयोग कर. एक रिक्त के रूप में H2O के समान वॉल्यूम का उपयोग करें ।
  6. संश्लेषित देंव 3 ' UTR आरएनए की प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करें । 1 देंव 3 ' UTR आरएनए के एनजी (४६२ कुर्सियां, चित्रा 2) ४.०५ x 109 प्रतियां के बराबर है ।
  7. आरएनए मानक पर-८० ° c का उपयोग जब तक स्टोर ।

3. आरटी-qPCR के लिए वायरस के नमूनों की प्रोसेसिंग

नोट: कदम 3.1 – 3.3 एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर किया जा करने के लिए कर रहे हैं. विशेष रूप से, एक संक्रामक वायरस युक्त संस्कृति supernatant की हैंडलिंग के तहत आयोजित किया जाना चाहिए एक उच्च सुरक्षा स्तर 2 (या उच्चतर) पर्यावरण ।

  1. मिश्रण १९९ एक प्रसंस्करण बफर के μL और nuclease के 1 μL-free proteinase K.
  2. प्रश्नपत्र पतला करने के लिए संश्लेषित देंव 3 ' UTR आरएनए (कदम २.६ से) 1:10 प्राप्त करने के लिए 5 x 109 to 5 x 103 प्रतियां/μL आरएनए मानक का उपयोग सेल संस्कृति माध्यम (उदा., DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक [DMEM/10% FBS]) जिसमें ४० इकाइयां/एमएल RNase अवरोधक शामिल हैं ।
  3. देंव-संक्रमित कोशिकाओं के कल्चरल supernatant के 5 μL को मिलाएं और देंव 3 ' UTR आरएनए स्टैण्डर्ड विथ 5 μL प्रोसेसिंग बफर/proteinase K सॉल्यूशन (स्टेप ३.१ से) 8-ट्यूब पीसीआर स्ट्रिप्स या एक ९६-वेल पीसीआर प्लेट का प्रयोग करें । एक गैर टेंपलेट नियंत्रण (एनटीसी) के रूप में, मिश्रण 5 सेल संस्कृति माध्यम के μL (यानी, कोई वायरस शामिल है) प्रसंस्करण बफर के 5 μL/proteinase K समाधान के साथ ।
  4. एक संक्षिप्त केंद्रापसारक के बाद, एक thermocycler में नमूनों की मशीन निंनलिखित शर्तों का उपयोग कर: 1 चक्र (10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के लिए और ७५ ° c 5 मिनट के लिए) ।
    नोट: यदि वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण उसी दिन किया जाता है तो प्रोसेस्ड नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है । लंबी अवधि के भंडारण के लिए, नमूनों पर-८० डिग्री सेल्सियस संग्रहित किया जाना चाहिए ।

4. वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण

नोट: यह अत्यधिक किसी भी amplicon-संबंधित उत्पादों या RNase के संदूषण को कम करने के लिए एक क्लीन हूड के अंदर चरण 4.1 – 4.4 निष्पादित करने के लिए अनुशंसित है ।

  1. एक rt-qPCR मास्टर मिश्रण को एक-चरण rt-पीसीआर रिएजेंट (सामग्री तालिका) में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (RNase-फ्री) का उपयोग करके देंव 3 ' UTR-विशिष्ट प्राइमरों और एक fluorogenic जांच (टेबल 1) के साथ तैयार करें । प्रत्येक घटक की मात्रा स्केल (तालिका 4) 11% नमूनों की कुल संख्या के अधिक के अनुसार, मानक आरएनए और एनटीसी प्रतिक्रियाओं सहित.
  2. Aliquot 8 μL में मास्टर मिश्रण की अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर प्लेट (सामग्री की मेज) में इस्तेमाल किया जा करने के लिए ।
  3. संक्षेप में संसाधित नमूनों, देंव 3 ' UTR आरएनए मानक और एनटीसी सहित (कदम ३.४ से) और ९६-अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए नमूनों की 2 μL जोड़ने.
  4. ऑप्टिकली स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ पीसीआर प्लेट सील ।
  5. संक्षेप में २०० x g पर थाली केंद्रापसारक हवा बुलबुले को दूर करने के लिए ।
  6. एक वास्तविक समय पीसीआर साधन में थाली प्लेस और निम्नलिखित शर्तों का उपयोग कर प्लेट चक्र: आरटी चरण के 1 चक्र (10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस), पोलीमरेज़ सक्रियकरण चरण के 1 चक्र (2 मिनट के लिए ९५ ° c), प्रवर्धन चरण के ४० चक्र (९५ ° c 10 एस के लिए और ६० ° c 30 s के लिए [इस कदम पर एकल डेटा अधिग्रहण]) ।
  7. एक वास्तविक समय पीसीआर से जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नमूनों में देंव आरएनए की कॉपी संख्या का निर्धारण ।
    1. सेटअप विंडो में, एक प्रतिक्रिया है कि अज्ञात नमूना के रूप में विश्लेषण किया जा रहा है की अच्छी तरह से आवंटित ।
    2. मानक के रूप में धारावाहिक पतला देंव 3 ' UTR आरएनए के अच्छी तरह से निरुपित और प्रत्येक में अच्छी तरह से आरएनए मानक की उम्मीद की प्रतिलिपि संख्या प्रकार (जैसे, अगर 5 x 103 प्रतियां/μL आरएनए मानक समाधान का उपयोग किया जाता है, प्रकार ५,०००). एनटीसी के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से निरुपित ।
    3. विश्लेषण विंडो में, विश्लेषण पर क्लिक करें और यह सुनिश्चित कर लें कि उत्पन्न मानक वक्र का सहसंबंध गुणांक (R2) ०.९८ से बराबर या उससे अधिक है.
    4. सामांयतया, डिफ़ॉल्ट सीटी सेटिंग्स का उपयोग करें (थ्रेशोल्ड: ऑटो, आधार रेखा प्रारंभ चक्र: ऑटो, आधारभूत अंत चक्र: ऑटो) विश्लेषण के लिए ।
      नोट: अज्ञात नमूनों की प्रति संख्या स्वचालित रूप से सीमा चक्र (सीटी) के आधार पर व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं के मूल्यों की गणना कर रहे हैं । प्रत्येक नमूने की गणना की प्रतिलिपि संख्या 10 μL RT-qPCR प्रतिक्रिया प्रति आरएनए प्रतियां के रूप में माना जाता है (उदाहरणके लिए, यदि १२,३४५ एक अज्ञात नमूने में इंगित किया गया है, इसका मतलब है कि देंव आरएनए की १२,३४५ प्रतियां में मौजूद हैं रिएक्शन).

Representative Results

RT-qPCR विश्लेषण द्वारा देंव आरएनए के ठहराव के लिए, ज्ञात प्रतिलिपि संख्या का एक मानक, जो एक ही प्राइमरी सेट द्वारा पता लगाया जा सकता है, एक शर्त है. इस प्रोटोकॉल में, ४६२ न्यूक्लियोटाइड लंबी आरएनए युक्त देंव-2 NGC तनाव के 3 ' UTR अनुक्रम इन विट्रो में किया गया था T7 आरएनए प्रमोटर से जुड़े-देंव-2 3 ' UTR डीएनए टेम्पलेट, जो पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था और शुद्ध (चित्रा 2a और बी) । जब एक सीरियल 10 गुना के कमजोर पड़ने मानक देंव आरएनए (5 x 109 से 5 x 102 प्रतियां एक 10 μL RT-qPCR प्रतिक्रिया) में एक प्रत्यक्ष RT-qPCR विश्लेषण का उपयोग कर 3 ' UTR-विशिष्ट प्राइमरों और एक fluorogenic जांच9के अधीन किया गया था, एक रैखिक एक अच्छा सहसंबंध गुणांक (R2 = ०.९८७२६) के साथ वक्र प्राप्त किया गया था (चित्र 2c) ।

अगला, यह प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख के लिए लागू किया गया था देंव की संस्कृति supernatant में वायरस-संक्रमित कोशिकाओं । देंव-2 (सिंगापुर अलग EDEN2 ३२९५10), जो सी 6/36 मच्छर कोशिकाओं में प्रचारित किया गया था और पट्टिका द्वारा titrated-21 कक्ष11का उपयोग कर परख, प्रश्नपत्र पतला था (8 x 106 से ८० पट्टिका गठन इकाइयों [PFU]/mL) । देंव नमूने तो प्रसंस्करण बफर के एक समान मात्रा के साथ इलाज किया गया deproteinize virions के लिए proteinase K युक्त और एक प्रत्यक्ष आरटी qPCR परख देंव 3 ' UTR आरएनए अनुक्रम को लक्षित करने के अधीन. फिर, एक अच्छा संबंध (आर2 = ०.९९९८१) देंव संक्रामक titer और सीटी के बीच, एक चक्र संख्या है कि जहां फ्लोरोसेंट संकेत पृष्ठभूमि के ऊपर घातीय वृद्धि के साथ उगता है बिंदु माना जाता है, प्राप्त किया गया था (आंकड़ा 3ए) । जब सीटी मूल्यों ज्ञात संक्रामक titers के साथ देंव शेयर की एक धारावाहिक कमजोर पड़ने से उत्पन्न मानक वक्र में साथ बनाया पर प्लॉट किए गए इन विट्रो लिखित 3 ' UTR आरएनए, से प्राप्त भूखंडों के सभी 8 x 106 करने के लिए ८० PFU/एमएल (के बराबर 8 x 103 करने के लिए 8 x 10-2 PFU एक 10 μL rt-qPCR प्रतिक्रिया में) मानक आरएनए के अधीन उन की सीमा के भीतर थे (5 x 109 से 5 x 103 प्रतियां में एक 10 μL rt-qPCR प्रतिक्रिया, चित्र बी), संकेत है कि संक्रामक की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ देंव नमूने titers एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है, इस प्रत्यक्ष आरटी-qPCR का उपयोग कर । समानांतर प्रयोगों में आरटी-qPCR विश्लेषण द्वारा वायरल आरएनए का पता लगाने पर प्रोसेसिंग बफर या proteinase कश्मीर उपचार के प्रभाव की जांच की गई. हालांकि एक लॉग कमजोर पड़ने का इलाज देंव नमूना (8 x 106 से 8 x 102 PFU/एमएल) फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ अकेले पहले आर टी-qPCR (1:1 पंजाबियों के साथ वायरस के नमूने के कमजोर पड़ने और 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस की एक मशीन और 5 मिनट के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस) प्रतिगमन वक्र (चित्रा 3सी, काली लाइन), और मतलब सीटी पंजाब के उपचार द्वारा प्राप्त मूल्यों 2.6-3.2 चक्र देरी जब प्रसंस्करण बफर द्वारा प्राप्त सीटी की तुलना में थे/proteinase K उपचार (चित्रा 3सी, बिंदीदार रेखा) । इसके अतिरिक्त, वायरस के उच्चतम कमजोर पड़ने (8 x 102 PFU/एमएल [8 x 10-1 PFU प्रति 10 μL RT-qPCR प्रतिक्रिया]) इस पंजाब उपचार (आंकड़ा 3सी) के साथ नहीं पाया जा सका । proteinase के अभाव में प्रसंस्करण बफर उपचार (3सी, ग्रे लाइन) के दौरान कश्मीर, एक समान प्रतिगमन उत्पन्न किया गया था; हालांकि, प्रवर्धन में देरी (0.1-0.8 चक्र) अभी भी proteinase कश्मीर युक्त प्रसंस्करण प्रतिक्रिया के सापेक्ष मनाया गया था (चित्रा 3सी, बिंदीदार रेखा) । इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि, स्थितियों के बीच परीक्षण, proteinase K के साथ एक साथ प्रसंस्करण बफर के साथ देंव नमूना के उपचार RT-qPCR परख की संवेदनशीलता में सुधार.

प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख आगे देंव के खिलाफ एंटीवायरल एजेंटों मांय करने के लिए अपनी प्रयोज्यता के लिए मूल्यांकन किया गया । Mycophenolic एसिड (MPA), inosine मोनोफोस्फेट डिहाइड्रोजनेज है कि प्रत्यारोपण में एक immunosuppressant के रूप में प्रयोग किया जाता है की एक nonnucleoside अवरोधक, को बाधित करने के लिए सूचित किया गया है देंव इन विट्रो12,13. हालांकि पिछले अध्ययन एक पारंपरिक पट्टिका परख या एक प्रवाह cytometry परख के लिए वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए देंव संक्रमण पर MPA के निरोधात्मक प्रभाव का प्रदर्शन कार्यरत12,13, वर्तमान अध्ययन में, प्रत्यक्ष आरटी-qPCR था MPA की एंटीवायरल गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया गया । हेला कोशिकाओं है, जो 5 x 104 कोशिकाओं के एक घनत्व में वरीयता प्राप्त किया गया था/अच्छी तरह से एक 24 अच्छी प्लेट 1 दिन में संक्रमण से पहले, देंव-2 के लिए 1 के एक MOI पर संपर्क किया गया 1 ज के लिए और, धोने के बाद, DMEM के साथ कल्चरित/10% FBS की उपस्थिति में 50 – 0.016 μg/एमएल MPA ( या ०.१% dimethyl sulfoxide [DMSO]) । संस्कृति supernatant 3 दिनों के संक्रमण के बाद एकत्र किया गया था और प्रत्यक्ष RT-qPCR देंव 3 ' UTR विशिष्ट प्राइमरों और एक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग परख के अधीन । चित्रा 4 देंव आरएनए प्रतियां (प्रति प्रतिक्रिया) से पता चलता है MPA की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया संक्रमित कोशिकाओं की संस्कृति supernatants में, जो एक इन विट्रो द्वारा निर्धारित थे 3 ' UTR आरएनए मानक. ५० μg/एमएल (१५६ माइक्रोन) के एक उपचार के साथ MPA, DMSO-इलाज नियंत्रण संस्कृति का ९९.८७ ± ०.०२% करने के लिए एक कमी (चित्रा 4) मनाया गया था । महत्वपूर्ण रूप से, चित्रा 4 में दिखाया गया डेटा द्वारा निर्धारित MPA के लिए आईसी५० (५०% निरोधात्मक एकाग्रता) मूल्य ०.७९ माइक्रोन, जो पहले12,13रिपोर्ट मूल्यों के समान है । यह परिणाम, इसलिए, इंगित करता है कि यह प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख देंव संक्रमण पर एंटीवायरल एजेंटों के निरोधात्मक प्रभाव का आकलन करने के लिए एक उपयोगी और विश्वसनीय तरीका है ।

अंत में, अंय आरएनए वायरस के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख के अनुप्रयोगों का परीक्षण किया गया । जब पीले बुखार वायरस (YFV) पहले 17d वैक्सीन तनाव (Flaviviridae), जो बीएचके-21 कोशिकाओं पर वीरो कोशिकाओं और titrated में परिलक्षित किया गया था के एक शेयर, qPCR-YFV-विशिष्ट प्राइमरों और एक पहले 17d जांच14का उपयोग कर प्रत्यक्ष आरटी-fluorogenic के अधीन किया गया था, के रूप में 1 तालिकामें वर्णित है, वायरस titers और सीटी मूल्यों के बीच अच्छा सीधा संबंध के साथ एक मानक वक्र वायरस स्टॉक के एक 10-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ उत्पंन किया जा सकता है (३.२ x 105 ३.२ PFU/एमएल, आंकड़ा 5 ए) । इसी तरह, Chikungunya वायरस (CHIKV, Togaviridae) रॉस तनाव स्टॉक के प्रत्यक्ष आर टी-qPCR विश्लेषण, जो वीरो कोशिकाओं और बीएचके-21 कोशिकाओं पर titrated में परिलक्षित किया गया था, CHIKV-विशिष्ट प्राइमरों और एक fluorogenic जांच15 (तालिका 1) का उपयोग कर, संक्रामक titers (४.४ x 108 से ४.४ x 103 PFU/एमएल) और सीटी मूल्यों (चित्रा 5B) के बीच एक अच्छा प्रतिगमन दिया । यह भी एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का पता लगाने के लिए मामला था (8 एक्स 102 से 8 एक्स 10-2 PFU/एमएल, फिगर 5C) खसरा वायरस (MeV, Paramyxoviridae) कि प्रचारित किया गया था और titrated कोशिकाओं के साथ वीरो, पहले का उपयोग रिपोर्ट प्राइमरों और एक fluorogenic जांच16 (तालिका 1) । ये डेटा विभिंन आरएनए वायरस के मात्रात्मक पता लगाने के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख की अनुकूलन क्षमता प्रदर्शित करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख के कार्यप्रवाह । देंव-संक्रमित कोशिकाओं की संस्कृति supernatant वायरल आरएनए (नमूना प्रसंस्करण कदम) जारी करने के लिए proteinase K युक्त एक प्रसंस्करण बफर के साथ इलाज किया जाता है । संसाधित नमूना तो एक कदम आरटी-पीसीआर रिएजेंट के साथ मिलाया जाता है और वास्तविक समय पीसीआर देंव 3 ' UTR-विशिष्ट प्राइमरों और एक fluorogenic जांच का उपयोग परख के अधीन । वायरल आरएनए के स्तर संबंधित नमूनों में पाया का उपयोग कर एक प्रश्नपत्र पतला मानक द्वारा निर्धारित किया जा सकता इन विट्रो देंव आरएनए प्रतिलिखित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: देंव 3 ' UTR आरएनए द्वारा उत्पन्न एक मानक वक्र. (a) मानक आरएनए युक्त 3 ' UTR of देंव-2 NGC इन विट्रो में एक T7 आरएनए प्रवर्तक अनुक्रम से जुड़े पीसीआर टुकड़ा लिखित था. (ख) शुद्ध देंव 3 ' UTR आरएनए (२५० एनजी) एक 1% agarose जेल (सही लेन) पर visualized था । वाम लेन आरएनए ट्रो के लिए आणविक भार मार्कर से पता चलता है. (ग) देंव 3 ' UTR आरएनए मानक के एक लॉग कमजोर पड़ने proteinase कश्मीर युक्त प्रसंस्करण बफर के साथ इलाज किया गया था और एक एक कदम आरटी-qPCR रिएजेंट और देंव 3 ' UTR-विशिष्ट प्राइमरों और एक fluorogenic जांच सेट का उपयोग कर एक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के अधीन था । मतलब सीटी मूल्यों (n = 3) संबंधित कमजोर पड़ने में प्राप्त की अनुमानित मात्रा के खिलाफ साजिश रची गई 3 ' UTR आरएनए (5 x 109 करने के लिए 5 x 102 आरएनए प्रतियां में एक 10 μL RT-qPCR प्रतिक्रिया). R2 सहसंबंध गुणांक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रत्यक्ष आरटी द्वारा वायरस स्टॉक में देंव आरएनए के ठहराव-qPCR. (क) हाई-titer देंव-2 में उत्पादित शेयर सी 6/36 कोशिकाओं प्रश्नपत्र पतला था 10 गुना (8 x 106 से 8 x 101 PFU/एमएल) के साथ DMEM/10% एक RNase अवरोध करनेवाला और प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख देंव 3 ' UTR-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करने के लिए अधीन युक्त FBS जांच. (ख) सीटी qPCR के RT-लॉग-पतला देंव स्टॉक (हलकों) द्वारा प्राप्त मूल्यों 3 ' UTR आरएनए (त्रिकोण) के एक मानक वक्र पर प्लॉट किए गए इन विट्रो में प्रतिलिखित । 8 x 106 PFU/एमएल स्टॉक का उपयोग एक प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख में 8 एक्स 103 PFU वायरस के 10 μL RT-qPCR प्रतिक्रिया में मेल खाती है । (ग) यह पैनल वायरल आरएनए का पता लगाने पर प्रसंस्करण बफर और proteinase कश्मीर उपचार के प्रभाव को दर्शाता है । देंव पतला स्टॉक (8 x 106 से 8 x 102 PFU/एमएल) proteinase K (सफेद हलकों), प्रसंस्करण बफर अकेले (ग्रे हलकों), या पंजाबियों (काले हलकों) युक्त प्रसंस्करण बफर के एक समान मात्रा के साथ मशीन था और फिर प्रत्यक्ष के अधीन आर टी-qPCR परख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रत्यक्ष RT-qPCR द्वारा MPA के निरोधात्मक प्रभाव का मूल्यांकन. हेला कोशिकाओं 1 के एक MOI में देंव-2 से संक्रमित थे और MPA, देंव की एक पहले से सूचित अवरोधक (या ०.१% DMSO) की बढ़ती सांद्रता की उपस्थिति में संस्कृति । संक्रमण के तीन दिन बाद, संक्रमित कोशिकाओं के कल्चर supernatants एकत्र किए गए और डायरेक्ट आरटी-qPCR परख के अधीन देंव 3 ' UTR-विशिष्ट प्राइमरों/जांच/ वायरल आरएनए की प्रतिलिपि संख्या देंव द्वारा निर्धारित किया गया था 3 ' UTR आरएनए मानक इन विट्रो मेंलिखित. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: अन्य आरएनए वायरस का पता लगाने के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR के आवेदन. (क) YFV के प्रश्नपत्र पतला वायरस स्टॉक्स, (ख) CHIKV, और (ग) MeV पीसीआर प्राइमरों और उनके संबंधित वायरल आरएनए दृश्यों के लिए विशिष्ट fluorogenic जांच का उपयोग कर प्रत्यक्ष आरटी qPCR परख के अधीन थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

उद्देश्य नाम अनुक्रम (5 '-3 ') नोट
T7 प्रमोटर-फ्यूजन देंव-2 3 ' UTR सीडीएनए प्रवर्धन T7-देंव 3 ' UTR Fwd ताा टीएसी GAC टीसीए CTA टैग जीजीसी गाा टीटा गाा GGC एएए अधिनियम AAC ATG एएए इटैलिक, T7 प्रवर्तक; लोअर केस, स्पेसर; बोल् ट, देंव-2 NGC न्यूक्लियोटाइड 10270-10292
देंव 3 ' UTR Rvs आगा एसीसी टीजीटी TGA टीटीसी AAC AGC देंव-2 NGC न्यूक्लियोटाइड 10723-10703
RT-qPCR देंव का विश्लेषण देंव-2 3 ' UTR च AAG GAC टैग AGG TTA झूठ झूठ एसीसी सी संदर्भ 9
देंव-2 3 ' UTR आर GGC GTT CTG TGC CTG गाा TGA टीजी
जांच 2 मांद-2-4 6FAM-AAC AGC अता TTG ACG CTG GGA AAG एसीसी-तमृ
RT-qPCR YFV का विश्लेषण YFV NS5 च गाा सीएजी TGA टीसीए GGA एसीसी सीटीसी TCT संदर्भ 14
YFV NS5 R GGA tgt TTG GTT CAC AGT एएए टीजीटी जी
YFV NS5 जांच 6FAM-CTA CGT गोरखा TGG AGC CCG सीएजी CAA टी-तमृ
RT-qPCR CHIKV का विश्लेषण CHIK E1 F TCG ACG CGC CCT CTT ताा संदर्भ 15
CHIK E1 आर एटीसी गाा TGC एसीसी जीसीए CAC टी
CHIK E1 P 6FAM-एसीसी AGC CTG CAC सीसीए टीटीसी सीटीसी आगा ग-तमृ
RT-qPCR MeV का विश्लेषण MeV N च TGG CAT CTG AAC TCG जीटीए टीसीए सी संदर्भ 16
MeV एन आर टीजीटी CCT सीएजी तग ताट जीसीए TTG CAA
MeV एन पी 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT सीएजी ए-तमृ

तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त Oligonucleotide प्राइमरी और fluorogenic जांच का जुगाड़ ।

घटक शेयर एकाग्रता मात्रा (μL) अंतिम एकाग्रता
PrimeSTAR मैक्स Premix 2x 25 1x
T7-देंव 3 ' UTR Fwd 1 माइक्रोन 10 २०० एनएम
देंव 3 ' UTR Rvs 1 माइक्रोन 10 २०० एनएम
pEU/देंव 3 ' UTR 1 एनजी/μL 1 20 स्नातकोत्तर μL/
Nuclease-मुफ्त H2O 4
कुल ५०

तालिका 2: देंव 3 ' UTR टेम्पलेट डीएनए की तैयारी के लिए एक पीसीआर मिश्रण के घटकों ।

घटक शेयर एकाग्रता मात्रा (μL) अंतिम एकाग्रता
T7 अनुक्रम-जुड़े देंव 3 ' UTR डीएनए टेम्पलेट चर एक्स १०० प्रतिक्रिया प्रति एनजी
एटीपी समाधान ७५ एमएम 2 ७.५ एमएम
CTP समाधान ७५ एमएम 2 ७.५ एमएम
GTP समाधान ७५ एमएम 2 ७.५ एमएम
UTP समाधान ७५ एमएम 2 ७.५ एमएम
प्रतिक्रिया बफर 10x 2 1x
T7 एंजाइम मिक्स 2
रिकॉमबिनेंट RNase अवरोधक ४० यूनिटें μL/ 1 2 यूनिट μL/
Nuclease-मुफ्त H2O 7-x
कुल 20

तालिका 3: synthesizing देंव 3 ' UTR आरएनए मानक के लिए एक IVT मिश्रण के अवयव ।

घटक शेयर एकाग्रता मात्रा (μL) एक RT-qPCR प्रतिक्रिया में अंतिम एकाग्रता
iTaq यूनिवर्सल जांच प्रतिक्रिया मिश्रण 2x ५.०० 1x
iScript नत उल्टो transcriptase 40x ०.२५ १०० प्रतिक्रिया प्रति एनजी
प्राइमरी/ देंव-2 3 ' UTR एफ: 3 माइक्रोन १.०० ३०० एनएम
देंव-2 3 ' UTR आर: 3 माइक्रोन ३०० एनएम
जांच 2 मांद-2-4:2 माइक्रोन २०० एनएम
Nuclease-मुफ्त H2O १.७५
उपयोग ८.००

तालिका 4: देंव आरएनए के रीयल-टाइम RT-qPCR विश्लेषण के लिए मास्टर मिश्रण के घटक. ध्यान दें कि प्रोसेस्ड देंव सैंपल (या मानक आरएनए) के 2 μL को 8-μL मास्टर मिक्स (कुल 10 μL प्रति रिएक्शन) में जोड़ा जाना चाहिए ।

Discussion

आज, फ्लोरोसेंट द्वारा वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के आधार पर वास्तविक समय पीसीआर रोगजनक मानव वायरस के आणविक निदान, अपनी संवेदनशीलता और तेजी से7के कारण के लिए एक सोने का मानक बनता जा रहा है । यह डेंगू बुखार17जैसे तीव्र संक्रामक रोगों के प्रारंभिक चरण में पुष्टि वायरस संक्रमण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, बुनियादी DNEV अनुसंधान, RT-qPCR परख के क्षेत्र में में वायरस प्रतिकृति निगरानी के लिए एक अनिवार्य उपकरण है इन विट्रो संस्कृति, जो देंव की प्रतिकृति जीव विज्ञान की समझ और एंटीवायरल अवरोधकों की खोज करने के लिए नेतृत्व करेंगे । इस अध्ययन में, फ्लोरोसेंट आधारित वास्तविक समय पीसीआर परख एक प्रसंस्करण बफर और एक कदम RT-पीसीआर एजेंट के संयोजन के द्वारा विकसित किया गया था ताकि संक्रमित कोशिकाओं के कल्चरल supernatant में देंव आरएनए को शुद्ध किए बिना rt-qPCR द्वारा quantified किया जा सके वायरल आरएनए जीनोम । जब नियमित परख की तुलना में इस तरह के पट्टिका परख, एलिसा, या पारंपरिक आरटी के रूप में वायरस प्रतिकृतिकरण का पता लगाने के लिए qPCR-आरएनए शुद्धीकरण6,7, आर टी-qPCR परख के एक सरलीकृत प्रोटोकॉल समय की एक महान कमी में परिणाम और देंव आरएनए के लिए आवश्यक कदम । यह भी एक महत्वपूर्ण विशेषता है कि संक्रमण और आनुवंशिक सामग्री की हानि को कम करने में लाभ है । फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक साफ डाकू का उपयोग IVT के सेट अप में आवश्यक है (चरण २.१) और आर टी-qPCR (कदम 4.1 – 4.4) प्रतिक्रियाओं के पार से बचने के लिए कोई amplicon-संबंधित उत्पादों या RNase के संदूषण । यह भी एक सुरक्षा कैबिनेट (कदम ३.३) प्रयोगशाला संक्रमण का खतरा कम करने के लिए अंदर संक्रामक वायरस, सहित संस्कृति supernatant, संभाल करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख का एक और महत्व है कि वायरल आरएनए प्रतियां की एक विस्तृत श्रृंखला कमजोर पड़ने या नमूने की एकाग्रता के बिना एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है । जब एक प्रश्नपत्र पतला देंव 3 ' UTR आरएनए मानक का इस्तेमाल किया गया था, प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल परिमाण के सात आदेशों पर एक रैखिक मानक वक्र का उत्पादन, और कम ठहराव सीमा ५०० आरएनए प्रतियां (चित्रा 2) था । संक्रमित कोशिकाओं के कल्चरल supernatant में देंव का पता लगाने के लिए, 8 x 103 से 8 x 10-2 PFU वायरस एक 10 μL RT-qPCR में देंव 3 ' UTR आरएनए मानक की सीमा के भीतर थे, और कम पता लगाने की सीमा (8 x 10-2 PFU) 11 शामिल करने के लिए गणना की गई थी , ४०० ± ७,०७७ आरएनए प्रतियां (चित्र बी) । के रूप में कई flavivirus अध्ययन में रिपोर्ट18,19,20, वायरल आरएनए के बड़े अनुपात की प्रतियां वायरस संक्रामक titer (यानी, PFU) देंव नमूनों में भी इस अध्ययन में मनाया गया था । इस अनुमान को काफी हद तक दोषपूर्ण की उपस्थिति (यानी, गैर संक्रामक) वायरस या मुक्त वायरल संक्रमित और मृत कोशिकाओं से जारी आरएनए की वजह से माना जाता है । यद्यपि आरएनए के अनुपात की प्रतियां: इस अध्ययन में प्राप्त PFU (१.१ x 105 से १.३ x 105 आरएनए प्रतियां/PFU) पहले दिखाए गए डेटा के साथ असंगत था (अनुपात 1 से 3 लॉग से श्रेणी)21,20, यह हो सकता है वायरस उपभेदों, कोशिकाओं में अंतर के लिए जिंमेदार ठहराया, या संस्कृति शर्तों कार्यरत हैं । विसंगति के लिए एक और संभावना विवरण है कि, के बाद से कोई आरएनए शोधन प्रक्रिया प्रत्यक्ष आर टी में शामिल किया गया था qPCR परख वर्णित इस के साथ साथ, संस्कृति supernatant में अधिक देंव आरएनए के वायरल के नुकसान के बिना वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण से पता लगाया जा सकता है आनुवंशिक सामग्री ।

प्रत्यक्ष RT-qPCR की सादगी बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों में नमूनों की एक बड़ी संख्या को संभालने की क्षमता को बढ़ाता है, इस तरह के रूप में एक ९६-अच्छी तरह से थाली. इसलिए, यह गुण एंटी-देंव दवाओं की खोज के लिए एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग अध्ययन करने के लिए प्रत्यक्ष RT-qPCR परख के भविष्य के आवेदन की सहायता करेगा । दरअसल, इस रिपोर्ट में, एक विरोधी के सत्यापन के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख के आवेदन-देंव अवरोध करनेवाला, MPA, जांच की थी, और परिणाम से पता चला कि MPA के एक आईसी५० मूल्य प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख (चित्रा 4) द्वारा प्राप्त की तुलना में था कि पट्टिका परख12,13का उपयोग कर पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट । यह दर्शाता है कि प्रत्यक्ष आरटी-qPCR उचित एंटीवायरल एजेंटों के निरोधात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी परख है और भविष्य में एक दवा स्क्रीनिंग अध्ययन में अपनाया जा सकता है ।

इस अध्ययन में, अन्य आरएनए वायरस का पता लगाने के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR लागू करने के लिए प्रयास किए गए थे । के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है, जब तीन अंय आरएनए वायरस (YFV, CHIKV, और MeV) के 10 गुना कमजोर पड़ने अलग पीढ़ी में वर्गीकृत (Flaviviridae, Togaviridae, और Paramyxoviridae, क्रमशः) का उपयोग कर जांच की गई पहले से संबंधित वायरल आरएनए दृश्यों के लिए विशिष्ट प्राइमरों और fluorogenic जांच की सूचना दी । संक्रामक titers और सीटी मूल्यों के बीच अच्छा संबंध प्रत्यक्ष RT-qPCR परख द्वारा प्राप्त किए गए थे, और सहसंबंध परिमाण के 4-6 रैखिक आदेश थे । यह पता चलता है कि प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल बस वायरस विशिष्ट प्राइमरों और fluorogenic जांच बदल द्वारा विभिन्न प्रकार आरएनए वायरस के लिए अनुकूल है.

फिर भी, इस अध्ययन (चित्रा 5) में परीक्षण वायरस के बीच विभिन्न का पता लगाने की संवेदनशीलता. प्रोटोकॉल है कि लक्ष्य वायरस आरएनए का पता लगाने में सुधार कर सकते हैं में से एक संशोधन प्राइमर/जांच दृश्यों का एक नया सेट का उपयोग करने के लिए होना चाहिए । इसके अतिरिक्त, सफल प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के लिए नमूना प्रसंस्करण कदम के दौरान वायरल जीनोम के कुशल रिलीज होने लगा है (कदम 3.1 – 3.4) । इस तरह के एक गैर लिफाफा वायरस के रूप में स्थिर वायरस का मात्रात्मक पता लगाने के लिए विशेष महत्व का होगा । हालांकि एक प्रारंभिक प्रयोग के रूप में, Coxsackievirus B3 (CVB3), एक गैर-ढंक आरएनए वायरस Picornaviridaeसे संबंधित, प्रत्यक्ष RT-qPCR परख पहले वर्णित CVB3-विशिष्ट प्राइमरों और फ्लोरोसेंट जांच22का उपयोग कर के अधीन था, एक एक उच्च titer (1 x 105 PFU/mL) वायरस स्टॉक के साथ भी धनात्मक amplicon संकेत का पता नहीं लगाया जा सका । यह मोटे तौर पर गैर के उच्च शारीरिक अखंडता के लिए जिंमेदार माना जाता है-लिफाफा वायरस । अब तक, आरएनए रिलीज चरण23,24,25 में विभिन्न प्रोटोकॉल को रोजगार जो कई आरएनए वायरस का पता लगाने के लिए न्यूक्लिक एसिड की शुद्धि की आवश्यकता नहीं है कि कुछ आरटी पीसीआर परख विकसित किया गया है, 26. इस प्रकार, एक उच्च तापमान पर एक वायरस के नमूने की एक मशीन के रूप में वैकल्पिक (या अतिरिक्त) उपचार, का उपयोग, संभावित पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है ।

संक्षेप में, इस अध्ययन में विकसित प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल संक्रमित कोशिकाओं के एक संस्कृति supernatant में वायरल आरएनए को बढ़ाता है के लिए एक सरल और तेजी से लेकिन विश्वसनीय तरीका था । इस सादगी की वजह से, प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख एक कम समय है, जो वायरस प्रतिकृति के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए वादा रखती में नमूनों की एक संख्या प्रक्रिया सकता है । इसके अलावा, अंय आरएनए वायरस के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल के आवेदन भी प्रदर्शन किया गया था । इस दृष्टिकोण, इसलिए, कुशलतापूर्वक एक अनुसंधान प्रयोगशाला की स्थापना में आरएनए वायरस संक्रमण की निगरानी के लिए एक उपयोगी उपकरण होना चाहिए और, संभवतः, नैदानिक निदान में.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक सुभाष जी वासुदेवन (ड्यूक-NUS ग्रेजुएट मेडिकल स्कूल, सिंगापुर) के लिए देंव-2 अलग EDEN2 ३२९५ और Shunro Imura (कोबे संगरोध स्टेशन, जापान) YFV पहले 17d वैक्सीन तनाव के लिए धंयवाद । लेखक अपनी सहायता के लिए माइक्रोबायोलॉजी विभाग और संक्रमण नियंत्रण के सदस्यों के भी आभारी हैं । इस काम को MEXT KAKENHI ग्रांट नंबर JP16737900 ने सपोर्ट किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimeSTAR Max DNA Polymerase Takara Bio. Inc R045A Comparable PCR reagent kit can be used.
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
6x Gel Loading Dye New England BioLabs B7024S Comparable gel loading dye can be used.
2-Log DNA Ladder New England BioLabs N3200 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.
Gel Scene Tablet Astec GST-33 Comparable gel imaging system can be used.
illustra GFX PCR Purification Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9034-70 Comparable gel extraction kit can be used.
BioSpectrometer Eppendorf 6135000905 Comparable spectrophotometer can be used.
MEGAscrip T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334
TURBO DNase Thermo Fisher Scientific AM2238 Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio. Inc 2313A 40 units/μL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Comparable RNA purification kit can be used.
CellAmp Direct RNA Prep Kit Takara Bio. Inc 3733Q
Proteinase K Nacalai Tesque 15679-06 >600 units/mL. Comparable reagent can be used.
iTaq Universal Probes One-Step Kit Bio-Rad 1725141
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL Thermo Fisher Scientific 4346907 Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.
StepOnePlus Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific StepOnePlus-01 Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.

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References

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Suzuki, Y., Kotoura, M., Yashima, S., Wu, H., Nakano, T., Sano, K. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58407, doi:10.3791/58407 (2018).

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