Summary
Denne metode til trypanosome adskillelse fra blod afhænger deres overflade afgift er mindre negative end pattedyr blodlegemer. Inficeret blod er placeret og behandles på en anionbytteren kolonne. Denne metode, den mest passende diagnostiske for afrikanske trypanosomiasis, giver renset parasitter for immunologiske, biologiske, biokemiske, farmaceutiske og molekylærbiologiske undersøgelser.
Abstract
Denne metode giver mulighed for adskillelse af trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyrs og menneskers afrikanske trypanosomiasis (HAT), fra inficeret blod. Dette er den bedste metode til diagnosticering af første etape HAT og desuden denne parasit rensning metode tillader serologiske og forskning undersøgelser.
HAT er forårsaget af tsetsefluen overføres Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense. Relaterede trypanosomes er animalske trypanosomiasis agenser. Registrering af trypanosome er afgørende for HAT diagnose, behandling og opfølgning. Den teknik beskrevet her er den mest følsomme parasit opdagelse teknik, tilpasset feltforhold til diagnosticering af T. b. gambiense HAT og kan afsluttes inden for en time. Blod er lagdelt en anionbytteren kolonne (DEAE cellulose) tidligere justeres til pH 8, og eluering buffer er tilføjet. Meget negativt ladede blodlegemer er adsorberet på kolonnen, mens de mindre negativt ladede trypanosomes passere gennem. Indsamlede trypanosomes er pelleted ved centrifugering og observeret ved mikroskopi. Desuden tilberedes parasitter uden cellulære skader, samtidig med at deres smitteevne.
Renset trypanosomes er nødvendige for immunologisk test; de bruges i trypanolysis assay, guldstandarden i HAT serologi. Farvede parasitter er udnyttet i kortet-agglutinationstest (Karina) for feltet serologi. Antigener fra renset trypanosomes, såsom variant overflade glykoprotein, exoantigens, er også brugt i forskellige immunassays. Proceduren beskrevet her er designet til afrikanske trypanosomes; kromatografi betingelser skal derfor tilpasses til hver trypanosome stamme, og mere generelt til blodet af hver art af vært pattedyr.
Disse fascinerende patogener er let renset og tilgængelig til brug i biokemiske, molekylære og Cellens biologi undersøgelser herunder Co kultur med værtsceller at undersøge vært-parasit relationer på niveauet af membranreceptorer, signalering og gen udtryk; Drug test in vitro; undersøgelsen af genet sletning, mutation eller overekspression på metaboliske processer, cytoskeletal Biogenese og parasit overlevelse.
Introduction
Metoden fremlægges beskrevet her giver mulighed for adskillelse af trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyrs og menneskers afrikanske trypanosomiasis (HAT), fra blodet. Dette er den bedste metode til diagnosticering af første etape HAT og desuden denne parasit rensning metode tillader robust serologiske og forskning undersøgelse.
HAT er forårsaget af tsetsefluen overføres Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense1. Disse protozo parasitter formere extracellularly i blodbanen, lymfeknuder og interstitielle væsker under den første fase af sygdommen (hemolymphatic fase). Den anden fase (meningoencephalitic fase) begynder når parasitter krydse blod-hjerne barrieren; neurologiske tegn, herunder en søvnforstyrrelse, der har givet sit navn "sovesyge" til denne sygdom, er typisk for denne anden fase2. Relaterede trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) er de agenser af animalsk afrikanske trypanosomosis (AAT)3.
Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har til formål at eliminere HAT som et offentligt sundhedsproblem i 2020 og stoppe transmission af 20304. Den nylige indførelse af hurtige diagnose tests har forbedret serologiske diagnosticering1,4,5. Adskillige molekylære diagnostiske tests er blevet udviklet, men deres rolle i feltet diagnostik er endnu ikke blevet etableret5. De bruges til at identificere underarter af brucei gruppe og atypiske trypanosomiasis forårsaget af parasitter ansvarlig for animalske trypanosomosis6.
Påvisning af parasitten er afgørende for diagnose, behandling og opfølgning, som serum kan give falsk positive og desværre falske negative resultater1. Den direkte mikroskopiske observation af disse hemoflagellate protister er vanskeligt i HAT sager, der er forårsaget af T. b. gambiense, (mere end 95% af tilfældene), som lav parasitemias er reglen, for HAT som følge af T. b. rhodesiense, en stor antallet af parasitter er ofte til stede i blodet. Forskellige koncentration teknikker har været brugt som tyk drop og kapillarrør centrifugering (CTC), men adskillelse af parasitter blod af en kolonne af anionbytter (DEAE cellulose) efterfulgt af centrifugering og mikroskopiske observation af den pellet, er den mest følsomme metode (ca. 50 parasitter/mL blod kan detekteres)1,7. Rensning af trypanosomes af denne anion-vekslere (DEAE cellulose) metode er derfor bedst, og til dato er referencemetoden for visualisering og isolere parasitter fra blod til HAT diagnose. I marken, en mini kolonne af DEAE cellulose held har været anvendt og flere forbedringer har fremmet mikroskopiske observation7,8.
Metoden trypanosome adskillelse fra blod, beskrevet nedenfor, afhænger af parasitten overflade afgift, som er mindre negative end pattedyr blodlegemer9. Interessant, denne metode blev udviklet for 50 år siden, i 1968 af Dr. Sheila Lanham, og stadig er guld standard for påvisning og forberedelse af blodbanen trypanosomes. Det er hurtigt og reproducerbare for salivarian trypanosomes fra en bred vifte af pattedyr, tillader diagnosticering af både dyrs og menneskers trypanosomiasis10.
For at opnå levende, renset parasitter, er inficeret blod tilføjet en anionbytteren kolonne. Kromatografi betingelser (hovedsagelig pH-Ioniske styrken af buffere/media) skal tilpasses til hver trypanosome arter, og mere generelt, at hver blanding af pattedyr blodlegemer og trypanosomes10. Eluering buffer er netop indstillet til pH 8 for de fleste afrikanske trypanosomes10. Denne metode favoriserer koncentrationen af parasitter fundet i blodet hos patienter, fordi parasitemias kan være for lav til at blive opdaget af mikroskopiske observation alene, og det giver også mulighed for laboratorieundersøgelser. Arbejde med frisk isoleret trypanosomes og på blodet fra smittede dyr, ved hjælp af denne teknik, er mere relevant for forskellige undersøgelser end undersøgelser med parasitter, der har været kulturperler i axenic betingelser i laboratoriet på ubestemt tid.
Vært-parasit relationer er bedst studeret hos en parasit inficere sin naturlige vært, derfor, T. musculi, en naturlig murine parasit, som er repræsentant for ekstracellulære trypanosomes, har mange fordele som murine infektion omfatter i en lille laboratorium animalsk og gør ikke forlange biohazard niveau (BSL) sikkerhedsforhold. T. musculi dræbe ikke immunkompetente mus, i modsætning til mange andre Trypanosoma arter, herunder menneskelige patogener. T. musculi elimineres ikke i T-celle-berøvet mus og parasitemias kan øges i inficerede mus ved at ændre fødevarer og næringsstoffer indtagelse11. Denne parasit modulerer immunrespons i co-infektioner med andre patogener12. T. musculi fra inficerede mus udviser forskelle fra kulturperler T. musculi, for eksempel udtryk for Fc membranreceptorer er tabt i T. musculi axenic kulturer, i forhold til parasitter renset fra inficerede mus13 , 14. Excreted-udskilles faktorer (ESF) er også kvalitativt og kvantitativt mindre udtrykt i axenic trypanosome kulturer og varierer mellem isolerede i endemiske områder15stammer. ESF er de første antigener til at blive vist på vært immunsystemet og så spiller en vigtig rolle i den oprindelige vært immunrespons16.
I eksperimentelt inficerede dyr for laboratorieundersøgelser letter denne protokol eksperimenter på et større antal parasitter, minimere antallet af mus kræves især når du bruger immunosuppressed dyr. De variant overflade glykoproteiner (VSGs), der anvendes i kortet-agglutinationstest for Trypanosomiasis (Karina) i masse screening er stadig renset fra trypanosomes, som er opformeret i rotter. De to hurtige diagnostiske test (individuelt indpakkede kassetter), er nu tilgængelige til brug i feltet stadig bruger en smitsom model kilde til native VSGs og ikke i vitro kulturperler trypanosomes1,4, 5. avancement i undersøgelsen af trypanosome immunologi og biologi er blevet fremmet, da disse DEAE cellulose renset parasitter kan opnås nemt, i store mængder fra naturligt eller eksperimentelt inficerede værter, og i særdeleshed gnavere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelser i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH publikation nr. 85±23, revideret 1996). Protokoller blev godkendt af vores lokale etiske udvalg.
1. dyr
- Holde Swiss (af-1) hunmus alderen otte til ti uger gamle, 20-25 g, i en dyr bolig facilitet femten dage før hvert forsøg. Hus dem i ventilerede bokse, der er holdt i en beskyttet, temperatur (22 ° C) og fugtighed (50%) kontrolleret rum, med 12 timer tænd/sluk lys cyklus.
- Giv dyrene fri adgang til mad og vand. Minimere smerte, lidelse og nød og give berigelse af miljøet.
- For boliger, bruge clear-walled bure, berigelse med træstave og pap tunneler. Forsigtigt trække et dyr ind i en tunnel til at overføre det fra buret til den hule hånd.
- Udføre daglige overvågning for at vurdere tegn på udmattelse, social isolation, kroppen skade, pjusket hår eller mangel på grooming.
- Veje hvert dyr en gang om ugen. Udføre regelmæssig inspektion af en dyrlæge.
- For naturlige parasitter, indsamle blod på toppen af parasitemia og for parasitter forårsager dyrs død, indsamle blod dagen før formodede død.
Bemærk: Alle eksperimenter med smitstoffer udføres i dedikerede rum, ifølge university godkendt retningslinjer.
2. buffere, medier præparater
- Ud af hvert stof og der tilsættes destilleret vand til de følgende buffere:
- Forberede koncentreret fosfatbufferet saltopløsning (2 x):
Na2HPO4 (vandfri) (MW 141.96 g) 10.14 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0,62 g
NaCl (MW 58.44 g) 2,55 g
Destilleret H2O til 1 L - Forberede fosfatbufferet saltopløsning-Glucose:
Na2HPO4 (vandfri) (MW 141.96 g) 5.39 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g
NaCl (MW 58.44 g) 1,70 g
Glukose (MW 180 g) 10 g
Destilleret H2O til 1 L - Forberede 1 M KH2PO4.
- Forberede eluering Buffer: Supplere fosfatbufferet saltopløsning-Glucose med
Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL), og Phenol rød (5 µg/mL).
- Forberede koncentreret fosfatbufferet saltopløsning (2 x):
3. forberedelse af DEAE-cellulose
- Plan ca 5 timer for DEAE-cellulose forberedelse.
- Vaske 100 g DEAE-cellulose med destilleret vand i en kolbe med en smal hals og give mulighed for at slå sig ned, så kassér fine partikler. Gentag vasker, indtil supernatanten er klart.
- Tilføje 3 L af koncentreret 2 x Phosphate-Buffered saltvand og rør.
- Justere pH til 8,0 med 1 M KH2PO4 og kassér supernatanten.
- Vaskes to gange med destilleret vand og lader til at bilægge.
- Vask og gøre det muligt at nøjes med to gange med for 3 liter Phosphate-Buffered saltvand-glukose og kassér analysere.
- Måle volumen af cellulose og tilføje et lige saa stort volumen af Phosphate-Buffered saltvand-Glucose, distribuere i plastflasker og opbevares ved-20 ° C.
4. parasitter
- Indsamle trypanosome stammer i områder, der er endemiske for menneskers og dyrs trypanosomiasis. Holde parasitter frosset i flydende kvælstof.
Bemærk: Trypanosoma musculi er ikke-patogene for mennesker og er en ekstracellulære trypanosome sikkert erstatte patogene trypanosomes i forskellige laboratorieforsøg. - For så vidt angår laboratorieundersøgelser kræver menneskelige patogener, håndtere eksperimenter med omhu i dedikeret passende biologisk sikkerhed plan (BSL) betingelser og forholdsregler; BSL2 for T. b. gambiense og BSL3 for T. b. rhodesiense. Feltforhold, standard mikrobiologisk praksis er etableret: secure prøvetagning, mekanisk pipettering, hyppige dekontaminering af overflader og Sterilisation af affald.
5. Mouse infektion
- Hurtigt optø parasitter i et vandbad ved 37 ° C.
- Observere en dråbe af optøede inficeret blod med et mikroskop. Vurdere parasit levedygtighed af måling procentdelen af motile former17.
- Injicere parasitter intraperitoneal ind i musene (0,5 mL pr. mus). Hver dag, efter infektionen, indsamle 20 µL af hale blod af nål punktur og observere under et mikroskop. Vurdere parasitemia ifølge Herbert og Lumsden18 ved at tælle parasitter i flere mikroskopfelter eller ved hjælp af en hæmocytometer.
- Når parasitemia når en tærskel, der er defineret for hver stamme, indsamle blod (1 mL/mus) i eluering buffer (5 mL/mus) indeholdende heparin (10 U/mL).
Bemærk: Lanham og Godfrey oprindelige og roman arbejde rapporterede den optimale ionisk styrken af fosfat bufferet saltvand glukose for flere vært/parasit arter af en stamopløsning, pH 8,0.
6. parasit adskillelse
Bemærk: Alle forsøg fra dette punkt og fremefter skal ske i en vævskultur hætte iført handsker. Rumtemperatur og luftfugtighed i laboratorier anvendes blev 22 ° C og 45% henholdsvis. I marken, er parasit adskillelse blevet med held udført på 34 ° C.
- Placere en 10 mL sprøjte i en lodret støtte og tilføje en tidligere cut cirkulære, stykke filtrerpapir, glasuld eller cellulose svamp.
- Hæld DEAE cellulose i sprøjten, indtil 8 mL niveau er nået, og derefter vaskes med 25 mL af eluering buffer.
- Omhyggeligt tilsættes 2 mL fortyndet blod øverst i kolonnen og derefter tilføje eluering medium. Regelmæssigt tilføje eluering buffer ifølge transit af trypanosomes.
- Indsamle spildevand dråber fra kolonner i et centrifugeglas, og kontroller jævnligt til forekomst af parasitter med et mikroskop.
- Når parasitter er ikke længere registreres i kolonne overløbet, centrifugeres tube (1.800 x g, 10 minutter, ved 4 ° C i laboratoriet og ved omgivende temperatur i marken).
- Fjern supernatanten og suspendere parasitter i 1 mL af den relevante medium kræves til det næste undersøgende skridt.
- Tælle parasitter med en hemocytometer og udvande dem i passende medium, hvis nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renset trypanosomes har været anvendt i farmaceutiske prøver. Parasitter der overføres til kultur wells indeholdende serielle fortyndinger af bestemte stoffer, enten alene eller blandet19. Mikroskopiske observationer, evaluere motilitet er en markør for levedygtighed, kan udføres, når kun få dugs er ved at blive testet, mens AlamarBlue celle levedygtighed assay er en fremragende metode for store motilitet assays under stof screening20. Effekten af pentamidine, en reference stof anvendes i HAT terapi, er vist i figur 1.
Makrofager er meget nyttige i kulturer som feeder celler. De tillader, in vitro-, iværksættelsen og udviklingen af trypanosome kulturer21. Vi har rapporteret, at antallet af alternativt aktiveret makrofager er steget i trypanosome-smittede pattedyr som de favoriserer parasit vækst22. Denne alternative makrofag aktivering leverer L-ornithin, som er afgørende for parasitten vækst. In vitro makrofag-parasit Co kulturer har vist, at trypanosomes fremkalde makrofag alternative aktivering via udskilles faktorer. Ekstracellulære trypanosomes udskiller et kinesin, som binder makrofag mannose bindende receptorer inducerende arginase udtryk giver L-ornithin produktion favorisere parasit differentiering og multiplikation23,24 ( Figur 2). Mannose hæmmer kinesin bindende og arginase induktion, og mannose receptor-mangelfuld mus belyse mål for kinesin på makrofager (figur 3).
Da talrige trypanosome genomer er nu blevet sekventeret og kommenteret, har vi kunnet drage fordel af disse store datasæt. Vi har efterfølgende kunnet foretage forward og reverse genetik på disse parasitter. Ved hjælp af disse data, renset blodbanen form trypanosomes har været brugt til at beskrive og analysere vigtige strukturer såsom flagellaternes lomme (FP) og dens tilknyttede cytoskelet. FP er det eneste sted, endo og exocytose i trypanosomes og er også hvor de variable overflade glykoproteiner smugles fra endomembrane system25. Flagellaternes lomme krave (FPC) er en ringformet formet struktur, der er knyttet til fimrehår på punktet, hvor det afslutter FP, men indtil for nylig var lidt kendt om protein bestanddele af FPC. Vi har identificeret en store protein af FPC, TbBILBO1, og har vist, at det er afgørende for parasitten overlevelse både i formen kulturperler insekt tsetsefluen og i blodbanen form26. Knockdown af TbBILBO1 af RNAi forhindrer FP dannelse og hæmmer Biogenese af mange andre vigtige cytoskeletal strukturer, hvilket gør FPC og FP vigtige mål for intervention i alle patogene trypanosomes. Sondering renset eller kulturperler parasit celler med antistoffer mod TbBILBO1 angiver, at det i blodbanen og procyklisk (insekt) form, opretter en ring-formet struktur, der omgår fimrehår. Sådan mærkning, på en formular, blodbanen, er vist i figur 4.
Renset blodbanen form trypanosomes har tilladt karakterisering af mange usædvanlige biokemiske og metaboliske Ejendommeligheder, herunder metabolisme af glukose, som foregår i Peroxisom-lignende organeller kaldet glycosomes (Se figur 5). Det var almindeligt anerkendt, at pyruvat er det store slutproduktet udskilles fra glukose metabolisme af blodbanen trypanosomes, med næsten ingen produktion af succinat og acetat inde i mitokondriet. Derimod konvertere procyklisk trypanosomes Threonin til acetat og glucose i succinat og acetat27,28. Energimetabolisme af trypanosomatids kan vurderes af tilpasning til rådighed carbon kilder. Kombinere omvendt genetik og metabolomic analyser bekræftet produktion i mitochondriet af blodbanen trypanosomes af acetat fra glukose-afledte pyruvat og Threonin og produktion af succinat fra glukose19,20 (Figur 5). For eksempel, afslørede 1H-NMR analyse af slutprodukter udskilles af blodbanen form trypanosomes inkuberes i PBS, som indeholder 4 mM glukose, at glucose omdannes hovedsageligt til pyruvat (85,1% af de udskilte slutprodukter), med mindre produktion af Alanin (9.2%), acetat (4,9%) og succinat (0,8%)29. Disse veje, som er mindre i forhold til metaboliske flux i forhold til pyruvat produktion fra glukose, er afgørende for væksten af parasitten. Succinat produktionsvejen kan således betragtes som et godt potentielle mål for udvikling af nye trypanocidal lægemidler.
Figur 1 : In vitro effekt af pentamidine på T. b. brucei. Fortyndinger af pentamidine blev føjet til 2 x 105 parasitter til bestemmelse af blykoncentrationen hæmme parasit vækst med 50% (IC50). Dosis-effekt kurver på 24 timer af kultur. Fejllinjer udgør standard fejlen af middelværdien fra 5 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Trypanosome-medieret arginase induktion. En kinesin udgivet af trypanosomes binder sig til C-type lektin receptorer fører til arginase induktion. Dette resulterer i øget produktion af L-ornithin og polyaminer, afgørende for parasitten vækst og differentiering, og L-arginin udtynding, hvilket resulterer i lavere produktion af cytotoksiske nej ved makrofag NOS II. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Makrofag arginase aktivitet. Arginase aktivitet i makrofager fra kontrol mus og Mannose receptor knock out (KO) mus kulturperler in vitro- i-mediet i 48 timer, med eller uden kinesin eller mannose. Fejllinjer udgør standard fejlen af middelværdien fra 5 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : TB BILBO1 mærkning af en blodbanen form Trypanosoma brucei brucei celle (A) immunofluorescens mærkning af en blodbanen, kultur form, 427 90-13 celle, der har været aftestede med anti-BILBO1 monoklonalt antistof efterfulgt af et FITC-mærkede anti-mus antistof og visualiseres ved hjælp af ultraviolet lys, (Tb BILBO1 er de grønne ringformede signaler) og DNA bindende farvestof DAPI (blå signaler) (B) A flette DAPI, anti-BILBO1 og fase kontrast billeder af A. skala bar er lig med 10 µm. Anti-BILBO1 musen monoklonale blev fortyndet 1:10 i PBS og sekundær antistof ( anti-mus IgM FITC) blev fortyndet 1: 100. Billeder blev taget på et mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Skematisk fremstilling af glucose og Threonin metabolisme i blodbanen form trypanosomes. Udskilte slutprodukter fra glukose og Threonin stofskifte er boxed. De tykke blå pile angiver enzymatisk trin af glukose metabolisme fører til pyruvat produktion, som er den vigtigste slutprodukt udskilles fra glykolyse. Sorte pile repræsenterer overset mindre stofskifteveje fra glukose og Threonin nedbrydning, som er afgørende for væksten af parasitten. Bidraget fra de angivne enzymer har valideret eksperimentelt: ACH, acetyl-CoA thioesterase (EF 3.1.2.1); ASCT, acetat: succinat CoA-transferase (EF 2.8.3.18); AKCT, 2-amino-3-ketobutyrate coenzym A ligase (EF 2.3.1.29); PEPCK, phosphoenolpyruvat carboxykinase (EF 4.1.1.49); PDH, pyruvat dehydrogenase komplekse (EF 1.2.4.1); TDH, threonin 3-dehydrogenase (EF 1.1.1.103). Forkortelser: AcCoA, acetyl-CoA; AOB, amino oxobutyrate; VIA, dihydroxyacetone fosfat; G3P, glyceraldehyd-3-fosfat; MAL, malate; OA, oxalacetat; PEP, phosphoenolpyruvat; PYR, pyruvat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Renset trypanosomes repræsenterer et stærkt middel til at studere immunologi, biokemi, cellulær og molekylær biologi. Store vidder af data og resultater er opnået ved trypanosomes, som derefter har bidraget til at indhente oplysninger fra andre eukaryote celler30. Trypanosomes er også genstand for vigtigt og interessant forskning, fordi de har udtænkt utallige mekanismer, der tillader dem at overleve og vokse i to meget forskellige miljøer: tsetsefluen vektor og pattedyr vært23, 31. forskellige teknikker til at isolere trypanosomes er blevet rapporteret, og en gennemgang på mikrofluidik-baserede tilgange er for nylig blevet offentliggjort32. En reproducerbar og robust middel til parasit isolation er derfor afgørende.
DEAE cellulose forberedelse er et uundværligt skridt i denne parasit forberedelse protokol. Vask betingelser skal udføres forsigtigt for at fjerne de fine partikler, og Blandingen henstår harpiks, og pH skal justeres præcis (pH 8.0 er velegnet til de fleste trypanosome arter). Alle trin skal justeres for at forbedre parasit rensning og giver samtidig opretholde parasit levedygtighed og trådløse egenskaber. Vigtigere, har parasit levedygtighed og smitteevne været vedligeholdt efter rensning gennem et DEAE-cellulose kolonne. Men, nogle stammer er mere skrøbelige end andre og kan være mindre smitsom efter rensning33. Derfor, virkningen af adskillelse betingelser på pellicular membran komponenter, parasit metabolisme, signalering, nukleinsyre funktioner og animalske smitteevne, vurderes og adskillelse betingelser skal tilpasses i overensstemmelse hermed.
Begrænsninger til denne teknik er at denne procedure skal tilpasses til hver trypanosome arter i en given vært og er også tidskrævende. Desuden er DEAE cellulose nu dyre. Foreløbige analyser er nødvendige for at optimere adskillelse betingelser, navnlig de medier, der kan have varierende ionisk styrker og en præcis pH. Før kolonne trin, herunder antikoagulerende valg, forudgående centrifugering at fjerne fleste erythrocytter, buffy coat brug og erytrocyt lysis, er udvalgt efter hvert forsøg. Nøjagtige ændringer på en enkelt parameter (buffere, temperatur i hele protokollen, centrifugering parametre) kan i høj grad øge antallet, grad af rensning og levedygtighed af parasitter opnået33. Udvikle nye adskillelse parametre parasit arter og blod pattedyrceller skal adskilles, kan være nødvendig. Justeringer af den oprindelige Lanham og Godfreys protokol har tilladt rensning af biologisk og antigent bevarede T. cruzi fra blod34. Nye harpiks kan også testet og bruges med passende betingelser for forskellige arter35.
Den store rolle, udskilles/udskilles faktorer (ES) af trypanosomatids er for nylig blevet understreget16. ES indeholder molekyler involveret i patologi og immunomodulation, såsom kinesin, som er bevaret blandt trypanosomes24. ES forberedelse fra renset parasitter kræver særlig omhu for at undgå kontaminering ved eluering medier komponenter og mængden parasitter.
En effektiv mod Leishmania, en relaterede parasit, ES-baserede vaccine allerede findes og er tilgængelig (CaniLeish Virbac)36. Sammenslutningen af bevarede molekyler spiller væsentlige roller i parasit overlevelse og vækst kunne udgøre grundlaget for en fremtidig vaccine mod trypanosomes, for både mennesker og dyr, i en en-sundhed tilgang. Rensning af afrikanske trypanosomes fra blodet af DEAE-cellulose kolonner med forbedringer, er fortsat guldstandarden til påvisning af trypanosome i naturlige værter med lav parasitemias i endemiske områder og for behovet for parasitter i stort tal for eksperimentelle undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Denne forskning blev støttet af indre finansiering fra universitetet i Bordeaux og støtte fra ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, og fra Association pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale og Service de Coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G.
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R.
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
