Summary
שיטה זו של הפרדה trypanosome הדם תלויה שלהם תשלום משטח שלילי פחות מאשר בתרבית של תאי דם. דם נגוע להציב, שטופלו על עמודת מחליף אניון. שיטה זו, הכי מתאים אבחון של מחלת השינה, מספקת טפילים מטוהרים לחקירות חיסוניות, ביולוגיים, ביוכימיים, פרמצבטיקה וביולוגיה מולקולרית.
Abstract
שיטה זו מאפשרת ההפרדה של trypanosomes, טפילים אחראי על בעלי חיים ועל האדם מחלת השינה (כובע), של דם נגוע. השיטה הטובה ביותר לאבחנה של השלב הראשון הכובע, יתר על כן שיטה זו טיהור טפיל היתרים סרולוגית ומחקר חקירות.
כובע נגרמת על ידי זבובים ששודרו Trypanosoma brucei gambiense , ט rhodesiense ב. Trypanosomes קשורים הם הסוכנים סיבתי של trypanosomiasis בעלי חיים. Trypanosome זיהוי חיוני עבור כובע אבחון, טיפול ומעקב. בטכניקה המתוארת כאן הטכניקה זיהוי הטפיל רגיש ביותר, המותאמים לתנאי שדה לאבחון של gambiense נולד ב- ט' הכובע, יכול להסתיים בתוך שעה אחת. הדם הוא שכבות על גבי עמודת מחליף אניון (DEAE תאית) בעבר מותאם pH 8, מאגר • תנאי נוסף. תאי הדם טעונים מאוד שלילית הם הספוחה אל העמודה ואילו trypanosomes טעונים שלילית פחות עוברים. Trypanosomes שנאספו מגורען על ידי צנטריפוגה, שנצפה על ידי מיקרוסקופ. יתר על כן, טפילים מוכנות ללא נזק תאי תוך שמירה על infectivity שלהם.
Trypanosomes מטוהרים נדרשים לבדיקת אימונולוגי; הם משמשים trypanolysis וזמינותו, תקן הזהב בסרולוגיה כובע. טפילים מוכתם מנוצלים ב המבחן התלכדות כרטיס (CATT) עבור השדה סרולוגיה. אנטיגנים של trypanosomes מטוהרים, כגון גליקופרוטאין השטח משתנה, exoantigens, משמשים גם immunoassays שונים. ההליך המתואר כאן מיועד trypanosomes אפריקה; כתוצאה מכך, כרומטוגרפיה תנאים צריך להיות מותאם לכל זן trypanosome, באופן כללי יותר, הדם של כל מיני יונקים המארח.
מרתק פתוגנים אלו בקלות מטוהרים וזמין לשימוש בהביוכימי, מולקולרית ותא ביולוגיה ללימודי כולל תרבות משותפת עם התאים המארחים לחקור קשרי גומלין מארח-טפיל ברמה של קולטני ממברנה איתות, ג'ין ביטוי; סמים בדיקות חוץ גופית בתוך; חקירה של ג'ין מחיקה, מוטציה או ביטוי על תהליכי חילוף החומרים, cytoskeletal להן והישרדות טפיל.
Introduction
השיטה המובאת המתוארים כאן מאפשר ההפרדה של trypanosomes, טפילים אחראי על בעלי חיים ועל האדם מחלת השינה (כובע), מהדם. השיטה הטובה ביותר לאבחנה של השלב הראשון הכובע, יתר על כן שיטה זו טיהור טפיל היתרי החקירה סרולוגית ומחקר חזקים.
כובע נגרמת על ידי זבובים ששודרו Trypanosoma brucei gambiense ו- rhodesiense נולד ב- טי1. אלה טפילים protozoan הכפל extracellularly למחזור הדם, הלימפה, וכן נוזלים interstitial בשלב הראשון של המחלה (שלב hemolymphatic). השלב השני (שלב meningoencephalitic) מתחיל כאשר טפילים לחצות את מחסום הדם מוח; סימנים נוירולוגיים, כולל הפרעת שינה, אשר נתן את השם "מחלת השינה" למחלה זו, אופייניים זה שלב2. קשורים trypanosomes (evansi ט congolense ט, ט vivax, brucei נולד ב- ט) הסוכנים סיבתי של חיה אפריקאית trypanosomosis (AAT)3.
ארגון הבריאות העולמי (WHO) שמטרתו לחסל את הכובע כבעיה בריאות הציבור על ידי 2020 להפסיק שידור על-ידי 20304. המבוא האחרונות של בדיקות אבחון מהירה כולל אבחון משופר סרולוגית1,4,5. פותחו מספר בדיקות אבחון מולקולרי אך תפקידם בתוכנית האבחון השדה טרם בוטלה הוקמה5. הם משמשים לזיהוי תת המינים של brucei קבוצה של trypanosomiasis טיפוסיות הנגרמת על ידי טפילים אחראי בבעלי חיים trypanosomosis6.
זיהוי הטפיל חיוני עבור אבחון, טיפול ומעקב, סרולוגיה יכול לתת תוצאות שליליות כוזב חיובי ו- false למרבה הצער1. בהתבוננות ישירה microscopical protists hemoflagellate אלה קשה במקרים הכובע הנגרמות על-ידי gambiense נולד ב- ט', (יותר מ- 95% מהמקרים) כמו parasitemias נמוכה גם הכלל, ואילו כובע נגרם על-ידי rhodesiense נולד ב- ט', גדול מספר טפילים נמצאים לעתים קרובות הדם. טכניקות ריכוז שונות היו בשימוש, כגון ירידה עבה, צינור קפילרי צנטריפוגה (CTC), אבל ההפרדה של טפילי הדם לפי עמודה של אניון-מחליף (DEAE תאית) ואחריו צנטריפוגה, התבוננות מיקרוסקופית גלולה, היא השיטה הכי רגיש (בסביבות 50 טפילים/מ"ל של דם יכולה להתגלות)1,7. כתוצאה מכך, הטיהור של trypanosomes בשיטה זו אניון-מחליפי (DEAE תאית) הוא הטוב ביותר, נכון להיום, שיטת הפניה עבור להמחיש ובידוד טפילי הדם לאבחון את הכובע. בתנאי שדה, עמודה מיני DEAE תאית שימש בהצלחה והנחה מספר שיפורים יש תצפית microscopical7,8.
שיטת ההפרדה trypanosome מדם, המתוארים להלן, תלוי תשלום משטח טפיל, פחות שלילית יותר בתרבית של תאי דם9. מעניין, שיטה זו פותחה לפני 50 שנה, בשנת 1968 על ידי ד ר שילה לנהאם, ונותרה תקן הזהב זיהוי, הכנת trypanosomes למחזור הדם. זה מהיר, לשחזור עבור salivarian trypanosomes ממגוון רחב של יונקים, המתיר את האבחנה של שני בעלי חיים ועל האדם trypanosomiasis10.
כדי להשיג טפילים חי, מטוהרים, דם נגוע נוסף על גבי עמודת מחליף אניון. תנאים כרומטוגרפיה (בעיקר ה-pH, כוח יונית של מאגרי/מדיה) צריך להיות מותאם לכל מין trypanosome, באופן כללי יותר, כל שילוב של בתרבית של תאי דם, trypanosomes10. • תנאי מאגר מכוון בדיוק pH 8 trypanosomes ביותר אפריקאי10. שיטה זו מיטיבה את הריכוז של טפילים נמצאו בדם של חולים, כי parasitemias יכול להיות נמוך מדי יזוהו על-ידי התבוננות מיקרוסקופית לבד, והוא גם מאפשר חקירות מעבדה. עבודה עם trypanosomes טרי מבודד, על דם של חיות נגועות, באמצעות טכניקה זו, היא יותר רלוונטי לחקירה שונים מאשר מחקרים עם טפילים תרבותי בתנאים axenic במעבדה לתקופה בלתי מוגבלת.
קשרי גומלין מארח-טפיל נלמדים בצורה הטובה ביותר עם הטפיל מדביק המארח הטבעי שלו, לכן, ט musculi, טפיל מאתר טבעי, אשר הוא נציג של trypanosomes חוץ-תאית, יש יתרונות רבים כמו זיהום מאתר כרוך חיות מעבדה קטנה לא דורשת תנאי רמת (BSL) בטיחות חומרים מסוכנים. ט musculi לא הורג עכברים immunocompetent, בניגוד מינים רבים אחרים Trypanosoma , כולל האדם פתוגנים. ט musculi לא יחוסלו בעכברים תא T-מקופח, parasitemias ניתן להגדיל אצל עכברים נגועים על ידי שינוי צריכת מוצרי מזון, חומרי מזון11. הטפיל הזה שמחליש את התגובה החיסונית זיהומים שיתוף עם אחרים פתוגנים12. ט musculi של עכברים נגועים הבדלים נספח תרבותי musculi ט, לדוגמה, הביטוי של קולטני ממברנה Fc אבוד בתרבויות axenic ט musculi , לעומת טפילים מכל עכברים נגועים13 , 14. גורמים מופרש Excreted (ESF) הם גם איכותית באופן כמותי פחות בא לידי ביטוי בתרבויות axenic trypanosome ו שונים בין זנים שבודדו אזורים אנדמיים15. ESF הם אנטיגנים הראשון להיות מוצגת בפני המערכת החיסונית המארח, אז יש תפקיד חשוב במארח הראשונית התגובה החיסונית16.
אצל בעלי חיים נגועים השפעול לחקירות מעבדה, פרוטוקול זה מקלה על ניסויים מספר רב יותר של טפילים, צמצום מספר עכברים הנדרש במיוחד כאשר באמצעות בעלי חיים immunosuppressed. Glycoproteins משטח variant (VSGs) הנמצאים בשימוש במבחן התלכדות כרטיס עבור Trypanosomiasis (CATT) בעת ההקרנה ההמונית וגופם מטוהר עדיין מן trypanosomes אשר מופצים בחולדות. שני מהירה בדיקות אבחון (קלטות עטופה בנפרד) זמינים כעת לשימוש בשטח, עדיין משתמשים מקור דגם זיהומיות של יליד VSGs, לא במבחנה תרבותי trypanosomes1,4, 5. ההתקדמות במחקר של trypanosome אימונולוגיה, ביולוגיה יש שניתנו לשיירה מאז אלה טפילים תאית מטוהר DEAE ניתן להשיג בקלות בכמויות גדולות ממחשבים מארחים טבעי או השפעול נגוע, ובחודש מסוים, מכרסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
חקירות תאמו ההנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (NIH פרסום מס 85±23, תוקן 1996). פרוטוקולים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית שלנו.
1. בעלי חיים
- לשמור על עכברים שוויצרי (של-1) נשים בגילאי 8-10 שבועות, g 20-25, בחיה דיור מתקן חמישה עשר ימים לפני כל ניסוי. בית אותם בתיבות מאוורר שנשמרים מוגן, טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס), לחות (50%) שלט חדר, עם 12 שעות הפעלה/כיבוי מחזור אור.
- מעניק חיות חינם גישה מזון ומים. מזעור כאב, סבל ומצוקה ולספק העשרה של הסביבה.
- לשימוש למגורים, עם קירות ברור הכלובים, העשרה עם מקלות עץ, קרטון מנהרות. בעדינות לצייר חיה לתוך מנהרה להעביר אותה מן הכלוב על כף היד.
- לבצע פיקוח יומי כדי להעריך סימנים של השתטחות, בידוד חברתי, פגיעת גוף, שערה הסתור או חוסר הטיפוח.
- שוקלים כל בעל חיים פעם אחת בשבוע. ביצוע הבדיקות הרגילות על-ידי וטרינר.
- נגד טפילים טבעי, לאסוף את הדם על פסגת ההר של parasitemia ועל טפילים גרימת מוות בעלי חיים, לאסוף דם יום לפני מותו המשוער.
הערה: כל ניסויים עם מדבקים מבוצעים בחדרים ייעודי, על פי הנחיות האוניברסיטה אישרה.
2. מאגרים, ההכנות מדיה
- שוקלים את כל החומר ולהוסיף מים מזוקקים על המאגרים הבאים:
- להכין תמיסת מלח מרוכזת באגירה פוספט (2x):
נה2HPO4 (נטול מים) (MW 141.96 ג'י) 10.14 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g
NaCl (MW 58.44 ג'י) 2.55 g
מזוקקים H2O ל- 1 ליטר - הכן באגירה פוספט תמיסת מלח-גלוקוז:
נה2HPO4 (נטול מים) (MW 141.96 ג'י) 5.39 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 ג'י) 0.31 g
NaCl (MW 58.44 ג'י) 1.70 g
גלוקוז (MW 180 גרם) 10 גרם
מזוקקים H2O ל- 1 ליטר - להכין 1 מ' ח'2PO4.
- להכין מאגר • תנאי: תוספת באגירה פוספט תמיסת גלוקוז עם
פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), פנול אדום (5 µg/mL).
- להכין תמיסת מלח מרוכזת באגירה פוספט (2x):
3. הכנת DEAE-תאית
- תוכנית בסביבות 5 שעות להכנת DEAE-תאית.
- לשטוף 100 גר' DEAE-תאית עם מים מזוקקים בבקבוקון עם צוואר צר ולאפשר ליישב, ולאחר מכן למחוק חלקיקים. חזור על שוטף עד תגובת שיקוע ברור.
- להוסיף 3 L מרוכז 2 x Phosphate-Buffered מלח ומערבבים.
- להתאים את ה-pH ל 8.0 עם 1 מ' ח'2PO4 ולמחוק את תגובת שיקוע.
- לשטוף פעמיים עם מים מזוקקים ולהשאיר להתיישב.
- רוחצים את אפשר כדי ליישב פעמיים עם 3 ליטר Phosphate-Buffered תמיסת מלח-גלוקוז ולמחוק את supernatants.
- למדוד את עוצמת הקול של תאית, להוסיף אמצעי שווה של Phosphate-Buffered מי מלח-גלוקוז, להפיץ לתוך בקבוקי פלסטיק ולאחסן ב-20 ° C.
4. טפילים
- לאסוף זנים trypanosome באזורים אנדמיים של האדם ושל בעלי החיים trypanosomiasis. שמור טפילים קפוא חנקן נוזלי.
הערה: Trypanosoma musculi הוא פתוגניים שאינם בני אדם והוא trypanosome חוץ-תאית השתמשו להחליף בבטחה trypanosomes פתוגניים שונים שמוכר. - במקרה של חקירות מעבדה הדורשים פתוגנים אנושי, להתמודד עם ניסויים עם טיפול ייעודי הביולוגי המתאים בטיחות ותנאים רמה (BSL) אמצעי זהירות; BSL2 gambiense נולד ב- ט ו BSL3 עבור rhodesiense נולד ב- טי. בתנאי שדה, נוצר מנהג מיקרוביולוגית: לאבטח דגימה, pipetting מכני, טיהור תכופים של משטחים, ועיקור פסולת.
5. העכבר זיהום
- במהירות להפשיר טפילים באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
- להתבונן טיפה של דם נגוע המופשרים עם מיקרוסקופ. להעריך את הכדאיות טפיל על ידי מדידת אחוז תאי טופסי17.
- להזריק טפילים intraperitoneally לתוך עכברים (0.5 מ"ל לכל העכבר). בכל יום, לאחר הפגיעה, לאסוף 20 µL של זנב דם על ידי מחט דקירה ולצפות תחת מיקרוסקופ. הערכת parasitemia על פי Lumsden והרברט18 על ידי ספירת טפילים במספר שדות מיקרוסקופ, או באמצעות שימוש של haemocytometer.
- Parasitemia מגיעה לסף מסוים המוגדר עבור כל זן, לאסוף את הדם (1 מ"ל/עכבר) במאגר • תנאי (5 מ ל/עכבר) המכיל הפרין (10 U/mL).
הערה: העבודה המקורי של הרומן של לנהאם ו גודפרי דיווח שהכוח יוניים אופטימלית של פוספט buffered גלוקוז מלוחים עבור מספר מינים מארח/טפיל פתרון מניות pH 8.0.
6. טפיל ההפרדה
הערה: כל ניסויים מנקודה זו ואילך חייב להיעשות בשכונה תרביות רקמה לבש כפפות. חדר טמפרטורה ולחות במעבדות השתמשו היו 22 ° C ו- 45% בהתאמה. בתנאי שדה, טפיל ההפרדה בהצלחה בוצעה ב 34 מעלות צלזיוס.
- הכנס מזרק 10 מ"ל תמיכה אנכי ולהוסיף מעגלי לחתוך קודם לכן, פיסת נייר סינון, צמר זכוכית או ספוג תאית.
- שופכים את התאית DEAE לתוך המזרק עד רמת 8 מ ל מתמלאת, ולאחר מכן לשטוף עם 25 מ"ל • תנאי המאגר.
- בזהירות להוסיף 2 מ"ל של דם מדולל בחלק העליון של העמודה ולאחר מכן להוסיף • תנאי בינוני. באופן קבוע להוסיף מאגר • תנאי על-פי המעבר של trypanosomes.
- לאסוף טיפות קולחים העמודות בשפופרת צנטרפוגה ולבדוק באופן קבוע הנוכחות של טפילים עם מיקרוסקופ.
- כאשר טפילים כבר לא זוהו ב למסקנות עמודה, centrifuge את הצינור (1,800 x g, 10 דקות, ב 4 ° C במעבדה, בטמפרטורת הסביבה בתנאי שדה).
- הסר את תגובת שיקוע, להשעות הטפילים ב 1 מ"ל של המדיום הרלוונטי הנדרש לשלב החקירה הבא.
- לספור טפילים עם hemocytometer ו לדלל אותם בינוני המתאים במידת הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trypanosomes מטוהרים היו בשימוש בבדיקות התרופות. טפילים מועברים לתוך בארות תרבות המכיל דילולים טורי תרופות ספציפיות, או לבד או מעורב19. תצפיות מיקרוסקופיות, הערכת תנועתיות מהווה סמן של הכדאיות, יכול להתבצע כאשר רק כמה דוגס נבדקות, בעוד AlamarBlue תא הכדאיות וזמינותו היא שיטה מצוינת עבור מבחני תנועתיות גדול במהלך סמים הקרנה20. ההשפעה של pentamidine, תרופה הפניה המשמשת בטיפול הכובע, מוצג באיור1.
מקרופאגים שימושיים מאוד בתרבויות כתאי מזין. הם מאפשרים, במבחנה, החניכה ופיתוח של trypanosome תרבויות21. אנחנו דיווחו כי המספרים של מקרופאגים לחלופין מופעל הוגדלה ביונקים נגועה trypanosome שבו הם לטובת גידול הטפיל22. הפעלה חלופיות מקרופאג מספקת L-ornithine, שהוא חיוני לצמיחה טפיל. במבחנה מקרופאג-טפיל שיתוף תרבויות הראו כי trypanosomes זירוז מקרופאג הפעלה חלופיות באמצעות גורמים המופרש. Trypanosomes חוץ-תאית להפריש קינזין הכובל מקרופאג מנוז איגוד קולטנים גרימת ביטוי arginase מתן העדפה טפיל בידול וכפל23,24 ( ייצור L-ornithine איור 2). מנוז מעכב קינזין מחייבים, אינדוקציה arginase, עכברים חשוכת-קולטן מנוז להבהיר את היעד של קינזין ב מקרופאגים (איור 3).
כיוון הגנום trypanosome רבים יש עכשיו כבר וסודרו מוערת, היינו יכולים לנצל אלה סדרות נתונים גדולות. לאחר מכן, אנחנו כבר מסוגל לבצע גנטיקה ואחורה על טפילים אלו. באמצעות נתונים אלו, טהור הדם טופס trypanosomes השתמשו כדי לאפיין ולנתח מבנים חשובים כמו כיס השוטוניים (FP) ו שלה שלד התא המשויך. FP הוא האתר היחידי של אנדו ואת אקסוציטוזה ב trypanosomes והוא גם איפה glycoproteins פני השטח משתנה בילנאומיים מן המערכת endomembrane25. הקולר השוטוניים כיס (FPC) הוא טבעתי בצורת מבנה שאליו מחובר את שוטון בנקודת יציאתו FP, אבל עד לאחרונה מעט היה ידוע על מרכיבי החלבון של FPC. אנחנו זיהו חלבון העיקריים של FPC, BILBO1 טרה-בתים, ולא הראו שזה חיוני להישרדות טפיל בדמות בתרבית חרקים זבובים והן למחזור הדם טופס26. נוקאאוט של BILBO1 טרה-בתיםעל ידי RNAi מונע היווצרות FP, ומעכב את להן של רבים אחרים חשובים cytoskeletal מבנים, ביצוע של FPC ואת המטרות חשוב FP להתערבות כל trypanosomes פתוגניים. חיטוט טפיל מטוהרים או בתרבית תאים עם נוגדנים BILBO1 טרה-בתיםמציין כי הדם טופס, טופס procyclic (חרק), זה יוצר מבנה דמוי טבעת העוקפות את שוטון. כזה תיוג, בטופס למחזור הדם, מוצג באיור4.
Trypanosomes טופס מזוכך למחזור הדם אפשרו אפיון רבים הביוכימי וחילוף מוזרויות יוצא דופן, כולל מטבוליזם של גלוקוז, אשר מתרחש פראוקסיזום דמוי organelles הנקרא glycosomes (ראה איור 5). זה היה מקובלים שפירובט הזה הוא הסוף-המוצר העיקרי מופרש מן מטבוליזם הגלוקוז על ידי trypanosomes הדם, עם כמעט אין הפקה של succinate, אצטט בפנים מיטוכונדריון. לעומת זאת, trypanosomes procyclic להמיר תראונין אצטט ו גלוקוז לתוך27,succinate, אצטט28. ניתן להעריך חילוף החומרים האנרגיה של trypanosomatids על ידי עיבוד למקורות פחמן זמינים. שילוב הפוך גנטיקה וניתוחים metabolomic אישרה הפקת ב מיטוכונדריון הדם trypanosomes אצטט גלוקוז-derived פירובט, תראונין, כמו גם ייצור של succinate בין גלוקוז19,20 (איור 5). למשל, 1H-NMR ניתוח של מוצרי קצה מופרש על ידי הדם טופס trypanosomes מודגרות ב- PBS המכילה גלוקוז 4 מ מ, חשף כי הגלוקוז בעיקר מומר פירובט (85.1% מהמוצרים סוף excreted), עם הפקה משנית של אלנין (9.2%), אצטט (4.9%) ל- succinate (0.8%)29. המסלולים הללו, שהן קלים מבחינת מטבולית שטף לעומת פירובט ייצור גלוקוז, חיוניים לצמיחה של הטפיל. מסלול הפקה succinate יכול להיחשב ובכך כמטרה פוטנציאלית טובה לפיתוח תרופות חדשות trypanocidal.
איור 1 : במבחנה ההשפעה של pentamidine על ט brucei נולד ב-. דילולים של pentamidine נוספו 2 x 10 טפילים5 כדי לקבוע ריכוז מעכבות את הצמיחה טפיל ב-50% (IC50). עקומות מנה-אפקט ב 24 שעות של תרבות. קווי שגיאה לייצג את שגיאת התקן של הממוצע בין 5 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אינדוקציה בתיווך trypanosome arginase. קינזין שפורסמו על ידי trypanosomes נקשר לקולטנים לקטין C-type המוביל אינדוקציה arginase. התוצאה בייצור מוגבר של L-ornithine, polyamines, חיוני לצמיחה טפיל ובידול, וב -L-ארגנין התרוקנות, וכתוצאה מכך ייצור נמוך של לא ציטוטוקסיות מאת מקרופאג NOS II. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Macrophage arginase פעילות. פעילות arginase של מקרופאגים בקרת עכברים, מנוז קולטן מדהימה (KO) עכברים תרבותי במבחנה בינוני למשך 48 שעות, עם או בלי קינזין או מנוז. קווי שגיאה לייצג את שגיאת התקן של הממוצע בין 5 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : טרה-בתים BILBO1 תיוג של טופס למחזור הדם Trypanosoma brucei brucei תא Immunofluorescence (א) מצב רוח מחזור הדם, תרבות טופס, 427 תא 90-13 יש כבר נחקר עם נוגדנים חד שבטיים anti-BILBO1 ואחריו נוגדן אנטי עכבר מתויג FITC, visualized באמצעות אור אולטרה סגול, (טרה-בתים BILBO1 הם האותות טבעתי ירוק) ה-DNA מחייב לצבוע דאפי (סימנים כחולים) א (B) מיזוג של תמונות חדות דאפי, anti-BILBO1, שלב של סולם א בר שווה 10 מיקרומטר. אנטי-BILBO1 עכבר monoclonal היה 1:10 מדולל ב PBS ו (נוגדנים משניים של עכבר אנטי IgM FITC) היה בטחונות מדולל. התמונות צולמו על מיקרוסקופ מצויד במצלמה דיגיטלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : ייצוג סכמטי של גלוקוז, תראונין חילוף החומרים למחזור הדם טופס trypanosomes. מופרש מוצרים של מטבוליזם הגלוקוז, תראונין מאוכסנים. החצים הכחולים עבה מצביעים על צעדים אנזימטי של מטבוליזם הגלוקוז שמוביל פירובט הייצור, אשר הוא הסוף-המוצר העיקרי מופרש מן גליקוליזה. החצים השחורים מייצגים להתעלם קטין משעולים חילוף החומרים של גלוקוז, תראונין השפלה, המהווה מרכיב חיוני לצמיחה של הטפיל. התרומה של אנזימים המצוין אומתה השפעול: ACH, thioesterase אצטיל קואנזים a (EC 3.1.2.1); ASCT, אצטט: succinate CoA-טרנספראז (EC 2.8.3.18); AKCT, 2-אמינו-3-ketobutyrate קואנזים A ליגאז (EC 2.3.1.29); PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase (EC 4.1.1.49); PDH, פירובט דהידרוגנאז מורכבים (EC 1.2.4.1); TDH, תראונין 3-דהידרוגנאז (EC 1.1.1.103). קיצורים: AcCoA, אצטיל קואנזים a; AOB, oxobutyrate אמינו; DHAP, דהידרוקסיאצטון פוספט; G3P, גליצראלדהיד 3-פוספט; מל, בנויים; OA, oxaloacetate; עידוד, phosphoenolpyruvate; PYR, פירובט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypanosomes מטוהרים מייצגים אמצעי רב עוצמה ללמוד אימונולוגיה, ביוכימיה, הסלולר וביולוגיה מולקולרית. מרחבים פתוחים של נתונים ותוצאות הושגו מן trypanosomes, אשר סייעה ואז לקבל מידע אחרים התאים האיקריוטים30. Trypanosomes הם גם הנושא של מחקר חשוב ומעניין כי הם פיתחו מנגנונים רבים זה מאפשר להם לשרוד ולצמוח בתוך שתי סביבות שונות: וקטור זבובים, המארח בתרבית של23, 31. דווח על טכניקות שונות כדי לבודד trypanosomes, סקירה על גישות מיקרופלואידיקה באחרונה שפורסמו32. לפיכך, אמצעי בידוד טפיל עמיד הדירים חיוני.
DEAE תאית הכנה היא צעד הכרחי ב פרוטוקול הכנה זה טפיל. כביסה תנאים חייבים להתבצע בזהירות כדי לחסל את החלקיקים, equilibrate השרף, ו חייב להיות מותאם בדיוק ה-pH (pH 8.0 הוא מתאים רוב המינים trypanosome). כל השלבים צריך להיות מותאם לשפר את הטפיל טיהור של תשואות תוך שמירה על המאפיינים הכדאיות וסלולר טפיל. חשוב לציין, טפיל הכדאיות ואת infectivity תוחזקו לאחר טיהור דרך העמודה DEAE-תאית. עם זאת, זנים מסוימים שבירות יותר מאשר לאחרים, יכול להיות פחות זיהומיות לאחר טיהור33. לכן, ההשפעה של תנאי ההפרדה על הממברנה pellicular רכיבים, מטבוליזם טפיל, איתות, פונקציות חומצת גרעין, וכן בעלי חיים infectivity, יש לפנות לבדיקה, ההפרדה תנאים חייבים להיות מותאמים בהתאם.
המגבלות טכניקה זו הם כי הליך זה חייב להיות מותאם לכל מין trypanosome שורה נתונה, ויש גם זמן רב. יתר על כן, תאית DEAE עכשיו הוא יקר. מבחני ראשוניות נחוצים למטב את ההפרדה התנאים, בייחוד בתקשורת, אשר ייתכן pH מדויקות וכישורים יוניים בדרגות שונות. צעדים עמודה מראש, כולל הבחירה נוגד קרישה, צנטריפוגה מוקדמת כדי להסיר את הרוב המכריע של אריתרוציטים, שימוש באפי את המעיל, פירוק כדוריות דם אדומות, נבחרו על פי ניסוי. שינויים מדויקים על פרמטר יחיד (מאגרים, טמפרטורה לאורך כל הפרוטוקול, צנטריפוגה פרמטרים) עלולה להגדיל באופן משמעותי את המספר, מידת טיהור ואת הכדאיות של טפילים שהושג33. פיתוח פרמטרים חדשים ההפרדה על פי טפיל המינים בתרבית של תאי הדם להפרידם, ייתכן שיהיה צורך. התאמות בפרוטוקול לנהאם, של גודפרי הראשונית אפשרה הטיהור של משומר ביולוגית, antigenically ט cruzi מן הדם34. שרפים חדש יכול להיות גם נבדק, בשימוש עם תנאים מתאימים עבור מינים שונים35.
התפקיד של מופרש/מופרש גורמים (ES) על ידי trypanosomatids באחרונה מודגשת16. ES מכילים מולקולות מעורב פתולוגיה immunomodulation, כגון קינזין, אשר כולו בין trypanosomes24. הכנה ES תוזנה מטוהרים דורש טיפול מסוים כדי למנוע זיהום על-ידי רכיבי מדיה • תנאי וטפילים lysed.
יעיל נגד לישמניה, טפיל קשורים, חיסון מבוסס-ES כבר קיים והוא זמין (CaniLeish Virbac)36. האגודה של מולקולות שנשמרת משחק תפקידים חיוניים ב הישרדות טפיל וצמיחה עשוי לייצג את הבסיס לקבלת חיסון בעתיד נגד trypanosomes, הן לבני אדם ולבעלי חיים, בגישה אחת-בריאות. טיהור של אפריקה trypanosomes מדם לפי עמודות DEAE-תאית, עם שיפורים, נשאר תקן הזהב עבור זיהוי trypanosome מארחים טבעי עם parasitemias נמוכה באזורים אנדמיים, את הצורך טפילים במספרים גדולים עבור חקירות ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לכל חברי UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD אוניברסיטת דה בורדו. מחקר זה נתמך על ידי מימון פנימי של האוניברסיטה של בורדו ויוצקים תמיכה את ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, ומן האגודה le développement de la en רשרש parasitologie et médecine tropicale, דה שירות coopération et d'action התרבות דה l'Ambassade דה פראנס א' בנגי (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
