Этот протокол описывает использование пластиковых фишек, чтобы культура и устроены первичной мышиных нейронов. Эти чипы креплению, удобный и совместим с высоким разрешением, живут и флуоресценции изображений. Этот протокол описывает пластины гиппокампа крысы нейронов в пределах этих чипов и выполнять аэрогидродинамических изоляции, axotomy и иммуноокрашивания.
Microfabricated методы для compartmentalize нейроны стали важными инструментами для многие неврологи. Этот протокол описывает использование коммерчески доступных собранном пластиковых чип для допускаться Нейроны гиппокампа культивировали первичной крыса. Эти пластиковые фишки, содержащихся в след стандартной микроскопа совместимы с высоким разрешением, живут и флуоресценции изображений. Этот протокол демонстрирует ретроградной лейбл нейронов через изолированные аксонов, с использованием модифицированных бешенства вирус кодирования флуоресцентный белок, создавать изолированные микросреды в одном отсеке, и выполнять axotomy и immunocytochemistry на чипе. Нейроны культивировали для > 3 недели в пластиковые фишки, иллюстрирующие совместимость этих чипов для долгосрочного нейрональных культур.
Нейрон традиционной культуры подходов результат в случайных нарост аксонов и дендритов, препятствующие исследования нейронов в их уникальный поляризованные морфологии. Microfabricated многосредовой устройства стали устоявшихся и хорошо использовали исследовательских инструментов для неврологов в последние 10-15 лет (отдельных громких публикаций являются ссылки1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). Эти устройства устроены нейронов и предоставляют метод для физически и химически манипулировать внутриклеточных регионов нейронов, включая somata, дендриты, аксоны и синапсы18,19. Они также предоставляют несколько экспериментальных парадигм, которые не возможно с использованием случайных культур, включая исследования аксональное транспорта, аксональное белкового синтеза, травмы/регенерации аксона и аксон Сома сигнализации. Базовая конфигурация 2-купе состоит из двух параллельных microfluidic каналов, разделенных серии небольших перпендикулярные microgrooves. Первичный или стволовых клеток, полученных нейронов покрыты в один из каналов microfluidic, урегулировать и прикрепить к нижней поверхности устройства и расширить невритов в течение дней. Многие конусы роста найти свой путь в microgrooves, которые достаточно малы, что они препятствуют клеток органов проникновения. Потому что конусы роста физически ограничены и не в состоянии повернуть вокруг внутри microgrooves, они растут прямо в отсеке рядом (аксональное отсека), где они изолированы.
Исторически эти устройства сформировали с помощью анонсированный (PDMS) с photolithographically рисунком мастер формы и сделал доме в лабораториях следователей или приобрели коммерчески. Один из главных недостатков с использованием PDMS является его гидрофобность20. PDMS могут быть сделаны гидрофильные временно, но затем быстро становится гидрофобные в течение часов в неводных среды20. Из-за этого устройства должны быть придает coverslip стекла или другой подходящий субстрат во время использования. Предварительно собранные пластиковые многосредовой фишки в настоящее время коммерчески доступных (например, XonaChips) литого пластика. Эти чипы изготавливаются постоянно гидрофильные, упрощения устройства увлажнения и позволяя Корпусообрабатывающее чип с тонкой пленкой циклических олефинов сополимер (COC) ограждающих microfluidic каналы на дне. Эти чипы изготавливаются в оптически прозрачный пластик, подходит для изображений с высоким разрешением флуоресценции.
Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы продемонстрировать использование предварительно собранные пластиковые microfluidic чипов для нескольких экспериментальных парадигм, с использованием мышиных гиппокампа или корковых нейронов. Этот протокол описывает ретроградной нейронов метки с помощью модифицированных бешенства вирус внутри чипа. Axotomy для исследования аксона травмы и регенерации также описаны. Наконец этот протокол показывает, как выполнить флуоресценции иммуноокрашивания с устройством.
Пластиковые многосредовой микросхемы обеспечивают возможность easy-to-use допускаться нейронов, обеспечивая долгосрочное нейрональных культур (> 3 недели). Этот протокол описывает культура мышиных нейронов коры головного мозга и гиппокампе в пределах этих чипов. Были также обсуждены создание растворимых микросреды и как Ретроградная лейбл нейронов, axotomy, с выполнением иммуноцитохимии. Важно отметить, что эти чипы совместимы с высоким разрешением, флуоресценции и живой изображений.
Пластиковые многосредовой фишки обеспечивают многие из тех же функций как PDMS-устройств на базе разобщенным, но имеют свои преимущества, недостатки и некоторые отличительные черты. Таблица 1 содержит сравнение пластиковых чип и устройств на базе PDMS. Прежде всего чипы являются предварительно собранных и сделал постоянно гидрофильные, которая облегчает смачивания, что делает их легче использовать. Пластик не является газа проницаемыми, в отличие от PDMS, так что если пузыри форма неожиданно в каналы, они не легко бежать и должны быть удалены. Предварительное покрытие раствор, содержащий главным образом этанола и некоторые другие проприетарные агенты исключает формирования пузыря.
Живут изображений прогнозов, выполненных следующие трансдукции флуоресцентных белков внутри микросхемы (Рисунок 4) и там было не обнаружено аутофлюоресценция пластика. Предостережение, что погружение масла, используемые с чип для целей высокая числовая апертура должна быть силиконовое масло на основе, а не минерального масла на основе. Минеральное масло может вызвать негативную реакцию с сополимером циклических олефинов. Для brightfield изображений, важно отметить, что microgrooves в чипе закруглены на концах, и постепенно сужающийся z направлении магистральных каналов к microgroove барьер, вызывая некоторые преломление света на любом конце microgrooves во время brightfield изображений (рис. 3). Потому что чип собранном, антитела проникновения в microgrooves микронных размеров может быть неравномерным (как с постоянно кабального устройств на базе PDMS); Таким образом количественный анализ, после иммуноокрашивания должны выполняться в отсеках каналы. Иммуноокрашивания нейронов прогнозов в microgrooves может быть улучшено путем создания тома разница между отсеками для помощи потока антител и флуорофоров в microgrooves.
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают технические или редакционные помощи от увядания Тейлор (Xona), Paranjape Смита (КООН-Чапел-Хилл), Джойс Ciechanowski (Xona) и Брэд Тейлор (Xona). Авторы признают поддержке микрофлюидика Xona, LLC и Национальный институт психического здоровья (R42 MH097377). Визуализация поддержали частично Confocal и Multiphoton Imaging основного объекта из NINDS центра Грант P30 NS045892 и NICHD центр Грант (U54 HD079124). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |