Summary
Bu iletişim kuralı kültür ve birincil fare nöronlar bölümlendirirse için plastik fiş kullanımını açıklar. Preassembled, Kullanıcı dostu ve yüksek çözünürlüklü ile uyumlu bu fişleri, canlı ve floresan görüntüleme. Bu iletişim kuralı, sıçan hipokampal nöronlar içinde bu fişleri plaka ve sıvı yalıtım, axotomy ve immunostaining gerçekleştirmek açıklar.
Abstract
Nöronlar bölümlendirirse Microfabricated yöntemleri temel araçları için birçok nörologlar haline gelmiştir. Bu iletişim kuralı kültürlü birincil fare hipokampal nöronlar ayrı için piyasada bulunan bir ön montajı plastik çip kullanımını açıklar. Bu plastik fiş, bir standart mikroskop slayt ayak izi içinde bulunan yüksek çözünürlüklü ile uyumludur, canlı ve floresan görüntüleme. Bu iletişim kuralı etiket nöronların izole aksonlar floresan bir protein kodlama değiştirilmiş kuduz virüsü kullanarak üzerinden retrograd, bir bölme içinde izole microenvironments oluşturmak ve axotomy ve immunocytochemistry gerçekleştirmek gösterilmiştir üstünde-küçük parça. Nöronlar için kültürlü > 3 hafta içinde bu fişleri uzun vadeli nöronal kültürler için uyumluluk gösteren plastik fiş.
Introduction
Geleneksel nöron kültürü rasgele akıbet sonucu akson ve nöronların kendi benzersiz polarize morfoloji incelenmesi önlemek dendrites yaklaşıyor. Microfabricated multicompartment aygıtları iyi kurulmuş ve kullanılmış araştırma araçları (seçili yüksek-profilli başvurulan1,2,3 yayınlardır son 10-15 yılda nörologlar için olmuştur , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). bu cihazlar nöronlar bölümlendirirse ve fiziksel ve kimyasal olarak nöronların, somata, dendrites, akson ve sinapslarda18,19da dahil olmak üzere hücre altı bölgeleri yönetmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca aksonal transport, aksonal protein sentezi, akson yaralanma/yenilenme ve akson soma sinyalizasyon çalışmaları da dahil olmak üzere rasgele kültürler kullanarak mümkün olmayan birden çok deneysel paradigmalar sağlarlar. Temel 2 bölmeli yapılandırma daha küçük dik microgrooves bir dizi tarafından ayrılmış iki paralel mikrosıvısal kanal oluşur. Birincil veya kök hücre kaynaklı nöronlar bir mikrosıvısal kanal kaplama, yerleşmek ve cihazın alt yüzeyine takın ve neurites gün boyunca uzatmak. Birçok büyüme koniler hücre organları girmesini önlemek küçük microgrooves içine kendi yolunu bulmak. Büyüme koniler fiziksel olarak sınırlı ve microgrooves içinde geri dönmek mümkün olduğundan, onlar nerede izole olduklarını düz bitişik bölmesine (aksonal bölme) büyür.
Tarihsel olarak, bu cihazlar poly(dimethylsiloxane) (PDMS) photolithographically desenli bir ana kalıp kullanarak kalıp ve müfettişler laboratuvarlarda şirket içinde yapılan veya ticari olarak satın. PDMS kullanmanın ana dezavantajları biridir onun hydrophobicity20. PDMS geçici olarak hidrofilik yapılabilir, ancak daha sonra hızlı bir şekilde bir sulu olmayan çevre20saat içinde hidrofobik olur. Bu nedenle, belgili tanımlık aygıt bir cam coverslip veya uygun diğer substrat kullanım anda bağlanması gerekir. Ön montajı plastik multicompartment fiş enjeksiyon kalıplı plastik ticari olarak kullanılabilir (Örneğin, XonaChips) oldular. Bu fişleri kalıcı olarak hidrofilik, aygıt ıslatma ve alt mikrosıvısal kanallarda kapsayan çip döngüsel olefin kopolimer (COC) ince bir film ile ön derleme izin basitleştirme yapılır. Bu fişleri bir optik şeffaf plastik yüksek çözünürlüklü floresans görüntüleme için uygun cihazlarında.
Bu iletişim kuralının amacı fare hipokampal veya kortikal nöronlar kullanılarak yapılan birden çok deneysel paradigmalar için ön montajı plastik mikrosıvısal çip kullanımını göstermektir. Bu iletişim kuralı değiştirilmiş kuduz virüsü çip içinde kullanarak etiket nöronlar retrograd açıklar. Axotomy akson hasarı ve yenilenme çalışmaları için de açıklanmıştır. Son olarak, bu protokolü nasıl belgili tanımlık aygıt ile floresan immunostaining gerçekleştirileceğini gösterir.
Protocol
Not: Bir şematik plastik multicompartment Chip Şekil 1A, Bgösterilir. Çip bir standart mikroskop slayt (75 mm × 25 mm) boyutudur. Çip ana kanallar veya bölmeleri, kuyu ve microgrooves de dahil olmak üzere, özellikleri etiketlenir ve ilerisi için sağlanır. Şekil 1 c ise bölmeleri sıvı yalıtım gösteren çip fotoğrafı vardır.
1. hazırlık ve kaplama Multicompartment fiş
- Bir biyo-güvenlik kabini çip Petri kabına veya diğer uygun Steril konteyner yerleştirin.
- Çözüm iyi çipin sol üst için ön kaplama 100 µL ekleyin ve bu ana kanalı ile de bitişik içine akmaya.
Not: Ön kaplama çözüm için çip içinde hava kabarcıkları yakalama olasılığını ortadan kaldırmak için mikrosıvısal kanalları önceden kat için kullanılır. - Dolgu alt çözüm önceden kaplama de 100 µL ile yaptı. Çözüm microgrooves akışı için izin vermek için 5 dakika bekleyin.
- Üst çözüm değil de önceden kaplama 100 µL ekleyin ve bu ana kanalı ile de bitişik içine akmaya. Alt sağ iyi çözüm önceden kaplama 100 µL ile doldurun.
- Her şey çözümden Aspire edin. Sıvı ana kanaldan (Şekil 2A) kaldırma önlemek için ana kanallar uzak Aspire edin. Hemen fosfat tamponlu tuz (PBS) 150 µL sol üst için de ekleyin. 1.5 dakika bekleyin.
Dikkat: kapalı ana kanallardan tüm sıvı Aspire değil. - 150 µL PBS sol alt de ekleyin. Sıvı microgrooves akış izin vermek için 5 dakika bekleyin. 150 µL PBS üst değil de ekleyin. Hemen de düşürmek için 150 µL PBS ekleyin. 10 dakika bekleyin.
- 1.5-1.6 için ikinci bir PBS yıkama yineleyin.
- Ana kanal kabarcıkları için doku kültürü mikroskopla çip kontrol edin. Kabarcıklar varsa, aşağıdaki yordamları gerçekleştirin. Hava kabarcığı yok varsa, 1.9 adıma atlayın.
- PBS damlalıklı ucu (Şekil 2A) açılış kanal uzak olta balıkçılığı kuyulardan Aspire edin.
- Çözüm üst kuyuya (Şekil 2B) açılış Kanal yakınındaki damlalıklı ucu olta balıkçılığı kaplama öncesi 100 µL dağıtmak. Baloncuklar kanalı ile alt kuyuya taşımak gerekir. 1.5 dakika bekleyin.
- 1.3-1.8 adımları yineleyin.
- PBS damlalıklı ucu (Şekil 2A) açılış kanal uzak olta balıkçılığı kuyulardan Aspire edin.
- 0,5 mg/mL poli d-lizin (PDL) 100 µL iyi çipin sol üst ekleyin. 1,5 dk. alt PDL 100 µL ile de yaptı dolgu bekleyin.
- PDL 100 µL çip üst doğru şey için ekleyin. 1,5 dk. eklemek 100 µL alt değil de bekleyin.
- Petri kabına kapatın ve 1 h için bir kuluçka-37 ° C'de çip yer.
- PBS yıkama adımları iki kez aşırı PDL kaldırmak için 1,5-1,6 yineleyin.
- PBS aygıttan Aspire edin.
- Hemen o çipin sol üst hücre kültür ortamının 100 µL ekleyin. 1,5 dk. sol alt medyaya Ekle de bekleyin. Medya değil de üst ekleyin. 1,5 dk. eklemek 100 µL orta çip alt sağ kuyusu için bekleyin.
- Çip hazır plaka hücrelere kadar 37 ° C kuluçka makinesine koyun.
2. tohum nöronlar Multicompartment fiş içine
- Hücre süspansiyon Disosiye sıçan hipokampal nöronların göre kurulan iletişim kuralları21,22 ~ 12 × 106 hücre/mL yoğunluğu vermeye hazırlanın.
Not: Hücre süspansiyon yoğunlukları arasında 3 ve 12 × 106 hücre/mL kullanımı mümkündür. Düşük yoğunluk kullandıysanız, belgili tanımlık küçük parça için eklenecek hücre süspansiyon hacmi (aşağıya bakın) artırılabilir. Aşağıda açıklanan yordamı fare Disosiye kortikal veya hipokampal nöronlar için geçerlidir. Optimum hücre yoğunluğu diğer nöron tipleri için farklı olabilir. - Her şey yaklaşık 5 µL her kuyuda bırakarak çipin içinde medya çoğunluğu kaldırmak. Sıvı ana kanaldan (Şekil 2A) kaldırma önlemek için ana kanallar uzak Aspire edin.
Dikkat: kapalı ana kanallardan sıvı Aspire değil. Eğer ana kanaldan sıvı Aspire hava kabarcıkları yongasında tuzak haline. - Hücre süspansiyon üst 5 µL değil de yük ve başka bir 5 µL hücre süspansiyon alt sağ iyi (~ 120.000 hücreleri toplam). Hücrelerin ana kanal (Şekil 2B) yakın dağıtımı yükleyin. Mikroskopla nöronlar ana kanal emin olmak için kontrol edin. Hücreleri eklemek izin vermek 5 dakika bekleyin.
Not: Her iki yuvası içine nöronlar yüklenebilir. Açıklama amacıyla, somatik yuvasının sağ tarafında ana kanaldır ancak her iki bölme somatik yerde kullanılabilir. Fiş başına 60.000 hücre aşağı alt hücre yoğunluğu kullanımı mümkündür. Hücre 10 µL kadar süspansiyon her için eklenebilir de, yukarıda açıklanan daha az sayıda hücre ile bir hücre süspansiyon ile birlikte somatik kompartımanda. - Yaklaşık 150 eklemek µL nöronal Kültür medya her alt ve üst sağ wells ve medya 150 µL her alt ve üst için ekleyin wells için yorum yaptı. Çip bir % 5 CO2 37 ° C kuluçka oksijen tepsisine yerleştirin.
- 24 saat sonra kuyulardan medya kaldırarak bir medya değişiklik yapmak. Ana kanal dolu kalır emin olun. En iyi her şey için 150 µL medya ekleyin ve sonra alt kuyu doldurun.
- Çip, istenen sayıda gün boyunca da kuluçka makinesine koyun.
Not: medya iki günde emin olmak için izlemek kalır hafif pembe. Ortam sarımsı ise % 50 ile taze ortamı değiştirin. Sıvı düzeyi düşük ise, yeterli nem ve buharlaşma önlemek için fiş uygun İkincil çevreleme olduğundan emin olun. Simge durumuna küçültmeden veya hatta ortadan kaldırarak, medya değişikliklerini yeri İkincil çevreleme kullanarak ve/veya politetrafloroetilin (PTFE) çip içeren yemek kapsayan-FEP film.
3. retrograd çip içinde nöronların etiketleme
Not: Retrograd etiketleme değiştirilmiş Kolera toksin ve kuduz virüsü kullanarak dahil birden fazla teknik kullanarak gerçekleştirilebilir. Aşağıda nöronlar etiketleme için talimatlar G-silindi kuduz-mCherry veya - eGFP virüs kullanıyorsunuz. Yerel kuruluşun esaslarına göre potansiyel olarak bulaşıcı malzemeler ele. Ek eğitim-ebilmek var olmak gerekli.
- Sıcak taze nöronal Kültür medya ile 37 ° c ~ 400 µL medya çip başına tahmin ediyoruz.
- Değiştirilmiş kuduz virüsü 50 toplam 100.000 viral birimleri seyreltik birinden alınan medya kullanarak µL de, aksonlar bölme.
Not: Dispose ipuçları ve tüpler kuruluş tarafından onaylanan protokolüne göre virüs ile temas halinde. - Yavaşça damlalıklı 37 ° C'de aksonal yuvası ve bir santrifüj deposunda kuyulardan kalan medya tüp
- Taze sıcak ortam 150 µL ve seyreltilmiş virüs 50 µL aksonal bölüme ekleyin. 2 h 37 ° C kuluçka için kuluçkaya.
- Virüs içeren medyayı çıkarın ve bunu uygun şekilde atın.
Not: Eğer ana kanaldan sıvı Aspire hava kabarcıkları yongasında tuzak haline. - Yavaşça taze medya 75 µL eklemek için bir akson hem ve diğer axon de akışı sağlar.
- Akış yoluyla ikinci axon de kaldırın ve uygun şekilde atın.
- 3,6 ve 3,7 bir kez adımları yineleyin.
- Eklemek saklı medya aksonal bölüme geri. Yaklaşık 50 µL taze medya, gerekirse, yeterli ses korumak ve hücreleri için kuluçka dönmek ekleyin.
Not: Floresan protein ifade 48 h tarafından görülebilir ve 8 gün devam ederse. Nöronlar için nöronal Kültür medya oda sıcaklığında 30 dakikaya kadar yansıması. Kültür medya ayrıca değiştirilebilir ile ısıtılan CO2-bağımsız hazırda E B27 ile ve yansıma için artık bu. Nöronlar da iyi oksijen çevre odası 37 ° C ve % 5 CO2içinde yansıma. Bu durumda, nemlendirme hangi Isıtma tarafından şiddetlenir ve nöron sağlık olumsuz etkileyebilir fişleri içinde buharlaşma kayıpları en aza indirmek için önemlidir.
4. sıvı yalıtım aksonal bölmenin içinde belgili tanımlık küçük parça
- Kaldırmak 20 µL alt üzerinden de aksonal bölme ve yer somatik bölmenin üst sağ kuyuya yaptı. Akışı içinde equilibrate için her kanal için 2 dakika bekleyin.
- Medya 50 µL aksonal yuvası kaldırın. 1 mM Alexa Fluor 488 hydrazide 0.3 µL bu ortamına Ekle, damlalıklı yolu ile karıştırın ve aksonal bölüme geri dönün. Çip görüntüleme için hazırdır.
Not: Diğer bileşikler ilgi eklenebilir. Benzer bir molekül ağırlığı ile floresan bir boya faiz bileşik ekleyerek zaman içinde sıvı yalıtım izlemek için önerilir.
5. içinde belgili tanımlık küçük parça Axotomy gerçekleştirme
- Damlalıklı ipucu ana kanal (Şekil 2A) giriş uzak tutmak aksonal yuvası medya kaldırmak ve bir santrifüj tüpü saklayın.
- Aksonal bölme tamamen, her iki giriş aksonal yuvası (Şekil 2B) ana kanal yakınındaki aspirasyon damlalıklı yerleştirerek Aspire edin. 1-2 dk. yapmak için çözüm yuvası tamamen çıkarıldığından emin aspirasyon devam.
Not: Düzgün çalışması axotomy yordamı için en az 18 inç-Hg vakum basıncı aspirasyon için olması gerekir. - Aksonal yuvası ile saklı ortamı değiştirin ve akson yanında seyir vasıl belgili tanımlık küçük parça mikroskop altında kopmuş onaylayın.
Not: medya değiştirirken aksonal kompartımanda kabarcıklar oluşturmak, 5.1-5.2 yineleyin. - Çip için kuluçka dönün.
6. floresan Immunostaining çipi içinde
- PBS (%4 formaldehit, 1 µM MgCl2, 0,1 µm CaCl2, 120 mM sükroz) içinde %4 formaldehit fiksasyon çözelti hazırlama
- Çoğu medya çip wells kaldırmak (iç bölmeleri kuru değil).
- Hemen 100 µL fiksasyon çözüm aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyuları için ekleyin.
- 1 dakika sonra 100 µL fiksasyon çözümün alt kuyu ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dk için düzeltme.
- En-in belgili tanımlık eriyik çip kuyulardan kaldırmak (iç bölmeleri kuru değil). Hemen PBS 150 µL her aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyu ekleyin. Alt kuyu akmaya PBS için 2 dakika bekleyin.
- Adım 6.5 iki kez tekrarlayın.
- PBS çoğunu çip kuyulardan kaldırın. Hemen PBS 150 µL % 0.25 ile eklemek TritonX-100 her aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyu. İçin 15 dakika bekleyin.
- Sıvı çoğu çip kuyulardan kaldırmak ve hemen engelleme çözüm (% 10 normal keçi serum içinde PBS) 150 µL aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyu için ekleyin. İçin 15 dakika bekleyin.
Not: Etkili engelleme çözümleri ikincil antikor, Örneğin, bir eşek Anti-koyun ikincil antikor için kesin, eşek serum engelleme çözümde kullanmak. - Sıvı çoğu çip kuyulardan kaldırın ve hemen birincil antikor (veya antikorlar) 100 µL PBS içinde % 1 normal keçi serumda her aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyu ekleyin. Buharlaşma en aza indirmek ve 1 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C gece beklemek için kapak.
- En-in belgili tanımlık eriyik çip kuyulardan kaldırmak (iç bölmeleri kuru değil). Hemen PBS 150 µL her aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyu ekleyin. Alt kuyu akmaya PBS için 5 dakika bekleyin.
- Adım 6,10 iki kez tekrarlayın.
- Sıvı çoğu çip kuyulardan kaldırın ve hemen ikincil antikor (veya antikorlar) 100 µL PBS içinde her aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyu ekleyin. Buharlaşma en aza indirmek ve oda sıcaklığında 1 h beklemek için kapak.
Not: ikincil antikorlar önerilen seyreltme için üreticinin yönergelerine başvurun. - 6.10-6.11 adımları yineleyin.
- İmmunostaining 1 gün içinde görüntüleme, PBS ile doldurulur CHIP tutmak. Eğer küçük parça-ecek var olmak stok görüntüleme önceki 1 gün daha uzun, buharlaşma önlemek ve görüntü için hazır kadar 4 ° C'de depolamak için parafin film yongasında içeren çanak wrap.
- Örnekleri daha uzun süreli depolama için montaj medya (Örneğin, Fluoromount-G) kullanılabilir.
- Sıvı çoğu çip kuyulardan kaldırın. 1 mL tek kullanımlık plastik damlalıklı medya her aksonlar ve somatik bölmeleri üst kuyu montaj 2 damla eklemek için kullanın.
- Kanallardan montaj medya akışını teşvik etmek için chip yatırın. 5 dakika sonra alt kuyu 2 damla ekleyin. Görüntüleme önce 1 saat bekleyin.
Not: montaj medya kullandıktan sonra bu diğer hedefler için yeniden soruşturma mümkün değil.
Representative Results
Nöron büyüme içinde belgili tanımlık küçük parça yaklaşık 5-7 gün sonra aksonal büyüme belirgindir. Fişleri faz kontrast görüntüleme 24 gün, nöronal büyüme gösteren Şekil 3' te gösterdiği olarak uyumludur. Fişleri de floresan düşsel (Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6ve Şekil 7) ile uyumludur. Üç gün sonra kuduz virüs hastalık yolu ile aksonal yuvanın mCherry pozitif nöronlar aksonal yuvası içine uzanan aksonlar ile yongasında (Şekil 4) görüntüsü. Fluidically bölmeleri yalıtmak için yeteneğini göstermek için bir düşük moleküler ağırlıklı floresan boya (Alexa Fluor 488 hydrazide) aksonal bölmenin eklendi. Bu sonuçlar PDMS tabanlı odası17 ' ye benzer olan ve faz kontrast ve floresan görüntüleme için plastik çip uygunluğu gösteren.
Nöronal büyüme plastik fiş ve PDMS cihazlar ile göstermek için her iki platforma nöronlarda kültürlü ve zaman içinde nöronal büyüme izlenmektedir. Şekil 5 22 gün 3 nöronal büyüme kültüründe gösterir; Bu sonuçlar 3 bağımsız deneyler temsilcisi vardır. Nöronal büyüme içinde iki platform karşılaştırılabilir ilâ 15 gün kültür, ancak daha uzun kültür yaş (> 21 gün) plastik çip içinde izole aksonlar daha az boncuk (Şekil 5A) ile sağlıklı görünür. Daha fazla aksonlar aksonal bölmeleri içinde görselleştirmek için biz immunostained plastik içinde sağlıklı aksonal büyüme gösteren β-tübülin III için cips, Kültür (Şekil 5B) 22 gün.
Akson hasarı ve yenilenme çalışmaları bölümlere mikrosıvısal aygıtlarını kullanarak yaygındır. Bu çalışmalar uygunluğu göstermek için fişleri, retrograd nöronlar etiketli kullanarak yansıma önce ve 24 saat sonra axotomy (Şekil 6). Geri çekme ampul ve akson Yenileyici her iki belirgin aşağıdaki axotomy vardır. Bu sonuçlar PDMS tabanlı cihazlar14,17kullanarak yayımlanmış veri için eşdeğerdir.
Immunocytochemistry protein yerelleştirme görselleştirmek için çok bölmesi cihazlar içinde gerçekleştirilen ortak bir tekniktir. Kültür 24 gün sonra nöronlar fişleri içinde sabit ve eksitatör ve inhibitör sinaptik işaretleri, vGlut1 ve vGat, için sırasıyla lekeli (Şekil 7). Retrograd etiketli mCherry nöronlar da görüntülü (Şekil 7C) idi. Görüntüleme yüksek çözünürlüklü görüntüleme yeteneğini gösteren bir 60 × silikon yağı daldırma amacı ile iplik disk confocal kullanarak gerçekleştirildi. Önemlisi, dendritik dikenleri içinde fiş kültürlü nöronlar olgun sinapslarda şekillendirme gösteren büyütülmüş bir bölge içinde belirgin idi.
Resim 1 : Nöronlar ayrı bir ön montajı, plastik iki bölmeli mikrosıvısal çip. (A) alt ve üst kuyuları yerlerini gösteren multicompartment çip şematik gösterimi. (B) ana kanallar (veya bölmeler) gösterilen çip genişlemiş şematik ve bölmeleri iletişime microgrooves. Ana kanallar yaklaşık 1,5 mm × 7 × 0.060 mm (W × L × H) vardır. Genişliği ve yüksekliği microgrooves yaklaşık 0,01 mm × 0.005 mm, sırasıyla vardır. Yapılandırmaya bağlı olarak 0.9 mm. (C) A fotoğraf gıda her ana kanal veya yeteneği fluidically gösteren bölmesi boya boyama içeren bir temsilcisi multicompartment Chip 0.15 mm microgrooves uzunluğu değişir Her kanal yalıtmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Pipetting teknikleri plastik multicompartment fiş kullanırken gerekli. (A) zaman ekleme ve medya yıkamak için alıyorum, damlalıklı ipucu ana kanal giriş uzak gösterildiği gibi açılı. (B) ne zaman nöronlar yükleme veya axotomy yapmak, damlalıklı uç-meli var olmak ana kanal giriş doğru açılı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : 24 gün vasıl belgili tanımlık küçük parça içinde tipik nöronal büyüme kültüründe gösterilen bir faz kontrast test. Embriyonik hipokampal nöronlar şu somatik bölmesine numaralı seribaşı. Axon büyüme aksonal yuvası başında 5-7 gün içinde görünür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Retrograd etiketli nöronlar hızlı mCherry floresan protein ve akson fluidically izole bir aksonal yuvası içine uzatmak. (A) canlı retrograd etiketli nöronlar kısaca aksonal bölmenin uygulanan değiştirilmiş mCherry kuduz virüsü ile enfekte gösterilen bir birleştirilmiş floresans test. Nöronlar kültür 21 gün, görüntülü 3 gün sonrası enfeksiyon vardı. Aksonal bölmenin içinde izole bir microenvironment oluşturma bir düşük moleküler ağırlıklı boya, Alexa Fluor 488 hydrazide uygulama tarafından gösterilmiştir. (B) bir birleştirilen görüntüyü (A) microgrooves bölge çipin görselleştirmek için bir fark girişim kontrast (DIC) görüntü de dahil olmak üzere. Görüntüleri confocal mikroskop 30 × / 1,05 N.A. silikon yağı kullanarak tarama Lazer ile elde (ne 1.406 =) objektif lens. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Nöronal büyüme multicompartment PDMS aygıtlar ve plastik fiş içinde yan yana karşılaştırma. (A) faz kontrast Filmler 3, 7, 15 ve 22 gün kültür içinde alınan her iki platformlar. Alt kısmında daha yüksek büyütme bölgesine gelen görüntüleri 22 gün alınan her iki platforma içinde bu yaşta aksonal büyüme göstermek için bulunur. Akson çip içinde daha sürekli ve bu yaşta PDMS cihazda daha sağlıklı görünür. (B) bir ters çevir'i ayirt test β-tübülin III kültür 22 gün, akson PDMS aygıt ve plastik çip aksonal bölmesinin içinde lekeli. Görüntüleri bir 20 x / 0,45 kullanarak bir iplik disk confocal görüntüleme sistemi ile elde N.A. objektif lens. Tüm ölçek çubukları 100 µm. çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Axotomy ve rejenerasyon hipokampal nöronların plastik multicompartment çip içinde. (Üst) Nöronlar değiştirilmiş mCherry kuduz virüsü kullanarak etiketli ve axotomy kültür 24 gün önce görüntüsü retrograd idi. Görüntüleri 'Ateş' renk arama tablosu kullanarak pseudocolored. (Alt) Üst paneldeki görüntüsü aynı nöron görüntülü 24 h post-axotomy oldu. Beyaz kesik çizgiler microgroove bariyer kenarlarını göster. Axotomy sol kesikli çizgi konumda oluştu. Beyaz ok başı retraksiyonu ampul gösterir. Beyaz ok yenileyici bir akson gösterir. Görüntüleri bir 20 × / 0.45 N.A. objektif lens kullanarak bir iplik disk confocal görüntüleme sistemi ile elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Synapses içinde plastik multicompartment fiş kültürlü hipokampal nöronlar arasında form. Immunostaining 24 gün kültür içinde gerçekleştirilen ve 60 × silikon yağı daldırma lens ile somatik bölme içinde yansıma. Nöronların inhibitör synapse marker, vGAT (mavi) (A) eksitatör synapse marker, vGlut1 (yeşil) ve (B) hızlı. (C) retrograd nöronlar (kırmızı) aksonal bölmenin uygulanan değiştirilmiş kuduz virüsü ile enfekte mCherry etiketli. (D) vGlut1, vGat ve mCherry bir birleştirilmiş floresans test. (E) ile beyaz bir kutu gösterilir (D) büyütülmüş bölgede dendritik omurgalar, sinaptik giriş diğer neurons almak siteleri gösterir. Görüntüleri bir 60 × / 1.3 N.A. silikon yağı kullanarak bir iplik disk confocal görüntüleme sistemi ile elde (ne 1.406 =) objektif lens. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Plastik multicompartment fiş | PDMS multicompartment aygıtları |
| akson izole | akson izole |
| microenvironments kurmak | microenvironments kurmak |
| axotomize nöronlar | axotomize nöronlar |
| Optik şeffaf | Optik şeffaf |
| yüksek kararlılık düşsel ile uyumlu | yüksek kararlılık düşsel ile uyumlu |
| floresans mikroskobu ile uyumlu | floresans mikroskobu ile uyumlu |
| tamamen monte | montaj için gerekli substrat |
| sağlıklı aksonlar > 21 gün | sağlıklı aksonlar > 14 gün |
| Hidrofilik kodlamayla yüzey | hidrofobik |
| gaz geçirmez | gaz geçirgen |
| yuvarlak microgrooves ve kanalları | düz microgrooves |
| daha az hazırlık adımları | üst microgrooves içinde boyama için çıkarılabilir |
| Lazer ablasyon ile uyumlu değil | küçük moleküller ve organik çözücüler emilimini |
| mineral yağ bazlı daldırma yağlar (silikon tabanlı yağlar iyi) ile uyumlu değil |
Tablo 1: Plastik ve nöronlar kültür için PDMS multicompartment platformlar karşılaştırılması.
Discussion
Plastik multicompartment fiş sağlamak için uzun vadeli nöronal kültürler veren nöronlar, ayrı bir kullanımı kolay seçenek (> 3 hafta). Bu protokolü nasıl kortikal ve hipokampal fare nöronlar içinde bu fişleri kültür ayrıntılı. Çözünür microenvironments oluşturulması ve etiket nöronlar retrograd, axotomy gerçekleştirmek ve immunocytochemistry gerçekleştirmek nasıl da ele alındı. Önemlisi, bu fişleri ile uyumlu yüksek çözünürlüklü, floresan ve canlı görüntüleme.
Plastik multicompartment fiş PDMS tabanlı bölümlere aygıtları olarak aynı işlevlerin çoğunu sunar, fakat avantajları, dezavantajları ve bazı ayırt edici özellikleri vardır. Tablo 1 plastik çip ve PDMS tabanlı aygıtların bir özellik karşılaştırması sunmaktadır. Her şeyden önce çipler önceden monte ve kalıcı olarak hidrofilik yapılan hangi ıslatma, onları daha kolay kullanılır hale kolaylaştırır. Eğer kabarcıklar beklenmedik bir şekilde içinde kanalların, kolayca kaçış yok ve onlar kaldırılmalıdır plastik gaz geçirgen PDMS, değil. Esas olarak etanol ve diğer bazı özel maddeler içeren bir ön kaplama çözüm kabarcık oluşumu ortadan kaldırır.
Aşağıdaki iletim flüoresan proteinlerin yongaları (Şekil 4) içinde yapılan projeksiyonlar görüntüleme yaşamak ve plastik tespit yok autofluorescence oldu. Bir ihtar küçük parça ile yüksek sayısal diyafram amaçları için kullanılan daldırma yağlar silikon yağı bazlı ve değil mineral yağ bazlı olması gerektiğidir. Mineral yağ ile döngüsel olefin kopolimer ters bir tepki neden olabilir. Aydınlık alan görüntüleme için çip microgrooves uçları yuvarlanır ve iki ucundaki ışık bazı kırılma neden microgroove bariyer doğru ana kanal z yönünü bir kademeli sivrilen olduğunu unutmamak önemlidir microgrooves (Şekil 3) görüntüleme aydınlık alan sırasında. Çip ön montajı olduğundan, antikor penetrasyon mikron büyüklüğünde microgrooves içine düzensiz olabilir (kalıcı olarak bağlanmış PDMS tabanlı aygıtlar gibi); Böylece, kantitatif analiz immunostaining takip kanalları/bölmeleri içinde gerçekleştirilmelidir. Nöronal projeksiyonları microgrooves içinde Immunostaining microgrooves içine antikorlar akışının yardım için bölmeleri ve fluorophores arasında bir birim fark oluşturarak geliştirilebilir.
Disclosures
A.M.T. mikrosıvısal odası/çip (bize 7419822 B2) bir mucidi ve Xona havacilik, LLC bir üyesidir. V.P. Xona havacilik, LLC bir çalışandır. JH Xona havacilik, LLC bir üyesidir. T.N. hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirir. Açık erişim yayın Bu makalenin Xona Havacilik tarafından desteklenmektedir.
Acknowledgments
Yazarlar Taylor Wilt (Xona), teknik veya Editör yardımdan Smita Paranjape (UNC Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) ve Brad Taylor (Xona) kabul edersiniz. Yazarlar Xona havacilik, LLC ve Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (R42 MH097377) destek kabul etmiş oluyorsunuz. Görüntüleme kısmen Confocal ve Multiphoton Imaging Core tesis, NINDS merkezi Grant P30 NS045892 ve NICHD merkezi Grant (U54 HD079124) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington's Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell Reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
- Yang, Y., et al. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61 (6), 880-894 (2009).
- Sutton, M. A., Taylor, A. M., Ito, H. T., Pham, A., Schuman, E. M. Postsynaptic decoding of neural activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission to local protein synthesis. Neuron. 55 (4), 648-661 (2007).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nature Cell Biology. 11 (8), 1024-1030 (2009).
- Sharma, N., et al. Long-distance control of synapse assembly by target-derived NGF. Neuron. 67 (3), 422-434 (2010).
- Harrington, A. W., et al. Recruitment of actin modifiers to TrkA endosomes governs retrograde NGF signaling and survival. Cell. 146 (3), 421-434 (2011).
- Zhang, Y., et al. Assembly and maintenance of nodes of ranvier rely on distinct sources of proteins and targeting mechanisms. Neuron. 73 (1), 92-107 (2012).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Tran, H. T., et al. Alpha-synuclein immunotherapy blocks uptake and templated propagation of misfolded alpha-synuclein and neurodegeneration. Cell Reports. 7 (6), 2054-2065 (2014).
- Calafate, S., et al. Synaptic Contacts Enhance Cell-to-Cell Tau Pathology Propagation. Cell Reports. 11 (8), 1176-1183 (2015).
- Cosker, K. E., Fenstermacher, S. J., Pazyra-Murphy, M. F., Elliott, H. L., Segal, R. A. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 19 (5), 690-696 (2016).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes? Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , Second edition, MIT Press. (1998).
