Summary
이 프로토콜 문화 분류 기본 murine 뉴런을 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 이 칩은 소, 사용자 친화적인, 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜에서는 이러한 칩 내 쥐 hippocampal 신경 격판덮개 유체 절연, axotomy 및 immunostaining을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
﹙ 메서드 뉴런 분류를 많은 신경 위한 필수 되고있다. 이 프로토콜에서는 교양된 기본 쥐 hippocampal 신경 compartmentalizing 상용 조립된 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 표준 현미경 슬라이드의 공간 내에 포함 된 이러한 플라스틱 칩은 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜 레이블 뉴런 형광 단백질을 인코딩 수정 된 광견병 바이러스를 사용 하 여 격리 된 축 삭을 통해 역행, 한 구획 내에서 고립 된 microenvironments를 만들고 axotomy 및 immunocytochemistry을 수행 하는 방법을 보여 내장. 신경에 대 한 교양 > 장기 신경 문화에 대 한 이러한 칩의 호환성을 보여주는 플라스틱 칩 내에서 3 주.
Introduction
전통적인 신경 문화 접근의 축 삭과 dendrites, 그들의 독특한 편광된 형태학에 있는 신경 세포의 연구를 방지 하는 임의의 파생물에 결과. ﹙ multicompartment 장치 되 잘 설립 하 고 잘 사용 연구 도구 신경에 대 한 마지막 10-15 년 (선택 된 높은-프로필 간행물은 참조1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17).이 소자는 뉴런을 분류 하 고 물리적 및 화학적 신경 somata, 모 수석, 축 삭, 및 시 냅 스18,19를 포함 하 여의 subcellular 영역을 조작 하는 방법을 제공. 그들은 또한 임의의 culture, axonal 수송, axonal 단백질 합성, 축 삭 상해/재생, 및 축 삭-소마 신호의 연구를 포함 하 여 사용 하 여 가능 하지 않은 여러 실험 패러다임을 제공 합니다. 작은 수직 microgrooves의 시리즈에 의해 구분 된 두 개의 병렬 미세 채널 기본 2 구획 구성에 의하여 이루어져 있다. 미세 채널 중 하나에 기본 또는 줄기 세포 유래 신경 세포는 도금, 정착 및 장치의 아래 표면에 연결 그리고 neurites 일의 과정을 통해 확장. 많은 성장 콘 충분히 작은 그들은 입력에서 셀 시체를 방지 하는 microgrooves에 그들의 방법을 찾아. 성장 콘 물리적으로 제한 하 고는 microgrooves 이내 돌아서 수 없습니다 때문에, 그들은 바로 그들이 고립 된다 인접 한 구획 (axonal 구획)에 성장.
역사적으로,이 장치 poly(dimethylsiloxane) (PDMS)를 사용 하 여 photolithographically 패턴된 마스터 금형에서 성형 하 고는 중 사내 조사 실험실에서 만든 또는 상업적으로 구입. PDMS를 사용 하 여의 주요 단점 중 하나는 그것의 hydrophobicity20입니다. PDMS 만들어질 수 있다 친수성 일시적으로, 하지만 그때 신속 하 게 된다 소수 성 비 수성 환경20시간. 이 때문에, 장치 사용 시 유리 coverslip 또는 다른 적합 한 기판에 첨부 합니다. 조립된 플라스틱 multicompartment 칩은 사출 성형 플라스틱에서 지금 상업적으로 사용 가능한 (예를 들어, XonaChips). 이 칩 장치 일로 고 바닥에 미세 채널을 포함 하는 주기적 올레 핀 코 폴리머 (COC)의 얇은 필름 칩의 선 조립 단순화, 영구적으로 친수성 만들어집니다. 이 칩은 고해상도 형광 영상에 적합 한 광학 투명 플라스틱에 조작.
이 프로토콜의 목적은 murine hippocampal 또는 대뇌 피 질의 신경 세포를 사용 하 여 수행 하는 여러 실험 패러다임에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용 방법을 설명 하는 것입니다. 이 프로토콜 레이블 뉴런 칩 내에서 수정 된 광견병 바이러스를 사용 하 여 역행 하는 방법을 설명 합니다. Axotomy 축 삭 상해 및 재생의 연구에 대 한 설명도 합니다. 마지막으로,이 프로토콜에는 장치와 함께 형광 immunostaining를 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
Protocol
참고: 플라스틱 multicompartment 칩의 회로도 그림 1A, B에 표시 됩니다. 칩은 표준 현미경 슬라이드 (75 × 25 mm)의 크기. 주요 채널 또는 구획, 웰 스, 그리고 microgrooves를 포함 하 여 칩의 기능 표시 됩니다 및 미래 참고를 위해 제공 됩니다. 그림 1C 는 구획의 유체 절연을 시연 하는 칩의 사진입니다.
1. 준비 및 Multicompartment 칩의 코팅
- 생물 안전 캐비닛에 페 트리 접시 또는 다른 적합 한 살 균 컨테이너에 칩을 놓습니다.
- 미리 코팅 솔루션 칩의 왼쪽 위를 100 µ L을 추가 하 고 인접 한 잘에 주요 채널을 통해 흐름을 허용.
참고: 사전 코팅 솔루션 사전 칩 내에서 기포를 트래핑에 대 한 가능성을 제거 하기 위해 미세 채널을 코트에 사용 됩니다. - 미리 코팅 솔루션의 100 µ L로 잘 낮은 왼쪽 채우기. 솔루션은 microgrooves를 통해 흐름을 허용 하도록 5 분 기다립니다.
- 미리 상단에 솔루션을 바로 잘 코팅의 100 µ L을 추가 하 고 인접 한 잘에 주요 채널을 통해 흐름을 허용. 미리 코팅 솔루션의 100 µ L에 더 낮은 오른쪽 잘 채워.
- 각 우물에서 솔루션 발음 주요 채널 (그림 2A)에서 액체를 제거 하지 않으려면 주요 채널에서 발음. 즉시 추가 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 150 µ L 왼쪽 상단을 잘 합니다. 1.5 분을 기다립니다.
주의: 동봉된 주 채널에서 모든 액체를 발음 하지 마십시오. - 왼쪽 아래에 150 µ L PBS를 잘 추가 합니다. 액체는 microgrooves을 통해 흐름을 허용 하도록 5 분 기다립니다. 상단에 바로 잘 150 µ L PBS를 추가 합니다. 바로 잘 낮은 150 µ L PBS를 추가 합니다. 10 분을 기다립니다.
- 두 번째 PBS 세척에 대 한 1.5-1.6 단계를 반복 합니다.
- 메인 채널에 거품에 대 한 조직 배양 현미경 칩을 확인 하십시오. 거품이 존재 하는 경우 아래의 절차를 수행 합니다. 없는 거품 경우 1.9 단계로 건너뜁니다.
- 낚시 채널 열기 (그림 2A)에서 피펫으로 팁 우물에서 PBS 발음
- 미리 코팅 솔루션 위 잘으로 낚시 열기 (그림 2B) 채널 근처 피펫으로의 팁의 100 µ L를 분배. 거품은 낮은 잘에 채널을 통해 이동 해야 합니다. 1.5 분을 기다립니다.
- 1.3-1.8 단계를 반복 합니다.
- 낚시 채널 열기 (그림 2A)에서 피펫으로 팁 우물에서 PBS 발음
- 칩의 왼쪽 위를 신의 0.5 mg/mL 폴 리 d-(PDL) 100 µ L를 추가 합니다. 1.5 분 채우기 낮은 PDL의 100 µ L를 잘 두고 기다립니다.
- 칩의 상단 오른쪽 우물에 PDL의 100 µ L를 추가 합니다. 낮은 오른쪽 잘 1.5 분 추가 100 µ L를 기다립니다.
- 페 트리 접시를 닫고 1 시간에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 칩을 배치 합니다.
- PBS 세척 단계 1.5-1.6 초과 PDL 제거를 두 번 반복 합니다.
- 장치에서 PBS 발음
- 즉시 왼쪽 칩의 위를 세포 배양의 100 µ L를 추가 합니다. 1.5 분 추가 미디어 왼쪽 아래를 잘 기다려. 상단에 바로 잘 미디어를 추가 합니다. 칩의 더 낮은 오른쪽 우물에 1.5 분 추가 100 µ L 매체를 기다립니다.
- 플레이트 셀 준비까지 37 ° C 배양 기에 칩을 놓습니다.
2. Multicompartment 칩으로 뉴런 시드
- ~ 12 × 106 셀/mL의 조밀도 설립된 프로토콜21,22 에 따르면 해리 쥐 hippocampal 신경의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
참고: 3과 12 × 106 셀/mL 사이 셀 서 스 펜 션 밀도의 사용 가능 하다. 낮은 밀도 사용 하는 경우는 칩에 추가 셀 서 스 펜 션의 볼륨 증가 (아래 참조). 아래 설명 된 절차는 murine 천연된 외피 또는 hippocampal 신경에 적용 됩니다. 다른 신경 종류에 대 한 최적의 셀 밀도 달라질 수 있습니다. - 각 잘 각 잘에서 약 5 µ L를 떠나 칩의 미디어의 대부분을 제거 합니다. 주요 채널 (그림 2A)에서 액체를 제거 하지 않으려면 주요 채널에서 발음.
주의: 동봉된 주 채널에서 액체를 발음 하지 마십시오. 공기 거품 액체 주요 채널에서 발음 하는 경우는 칩에 갇혀 될 수 있습니다. - 바로 잘 상단에 세포 현 탁 액의 5 µ L을 로드 하 고 낮은 오른쪽 잘 (총 ~ 120000 셀) 셀 서 스 펜 션의 또 다른 5 µ L. 주요 채널 (그림 2B)에 가까운 분배 하 여 세포를 로드 합니다. 되도록 신경 메인 채널에 현미경으로 확인 합니다. 연결할 셀 수 있도록 5 분 동안 기다립니다.
참고: 뉴런에 어느 부분으로 로드할 수 있습니다. 설명을 위해 체세포 구획, 오른쪽에는 주요 채널 이지만 어느 구획 체세포 구획으로 사용할 수 있습니다. 칩 당 60000 셀 아래로 낮은 세포 밀도의 사용이 가능 하다. 셀의 10 µ L까지 정지는 각각에 추가할 수 있습니다 위에서 설명한 것 보다 더 적은 셀과 셀 서 스 펜 션와 함께에서 체세포 구획의. - 추가 약 150 µ L의 위 및 아래 각 신경 문화 미디어의 웰 스, 오른쪽 및 다음 상위와 하위의 각 미디어의 150 µ L를 추가 왼쪽으로 우물. 5%는 CO2 은 37 ° C 배양 기에서 습도 트레이에 칩을 놓습니다.
- 24 시간 후 미디어 변경 우물에서 미디어를 제거 하 여 수행 합니다. 주요 채널 남아 칠 다는 것을 확인 하십시오. 각 최고 잘 하 미디어의 150 µ L을 추가 하 고 아래 우물을 채우기.
- 원하는 일 수에 대 한 인큐베이터에 칩을 놓습니다.
참고: 모니터는 미디어 그것 다는 것을 확인 하는 일의 모든 몇 남아 빛 핑크. 미디어는 노란, 그것의 50%를 신선한 미디어 바꿉니다. 액체 수준 낮은 경우 적절 한 습도 증발을 방지 하기 위해 칩의 적절 한 보조 포함 있는지 확인 합니다. 최소화, 또는 심지어 제거, 미디어 변화는 가능한 보조 포함을 사용 하 여 및 소계 (PTFE)와 칩을 포함 하는 접시를 덮고-FEP 필름.
3. 역행 칩 내에서 신경의 보입니다
참고: 역행 라벨 수행할 수 있습니다 수정 된 콜레라 독 소 및 광견병 바이러스를 사용 하는 등 여러 기술을 사용 하 여. 아래는 뉴런을 라벨에 대 한 지침 사용 하 여 G 삭제 광견병-mCherry 또는-eGFP 바이러스. 지역 단체의 지침에 따라 잠재적으로 전염 성 물질을 처리 합니다. 추가 교육이 필요할 수 있습니다.
- 37 ° c 따뜻한 신선한 신경 문화 미디어 ~ 400 µ L 칩 당 미디어의 예상.
- 50의 총에서 수정 된 광견병 바이러스의 바이러스 성 100000 단위를 희석 µ L 중 하나에서 가져온 미디어를 사용 하 여 잘 axonal 구획의.
참고: 팁 및 조직 승인 프로토콜에 따라 바이러스 접촉 튜브는 삭제 합니다. - 부드럽게 피펫으로 axonal 구획 및 원심 분리기에서 저장소의 우물에서 나머지 미디어 37 ° c.에 관
- Axonal 구획에 신선한 따뜻한 미디어의 150 µ L와 희석된 바이러스의 50 µ L를 추가 합니다. 2 h 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 바이러스를 포함 하는 미디어를 제거 그것을 제대로 처리 하 고.
참고: 공기 방울 유체 메인 채널에서 발음 하는 경우는 칩에 갇혀 될 수 있습니다. - 부드럽게 잘 한 축 삭에 신선한 미디어의 75 µ L을 추가 하 고 다른 축 삭에 흐름을 잘 수 있도록.
- 두 번째 축 삭에서 흐름을 통해 잘 제거 하 고 제대로 처분.
- 한 번 3.6-3.7 단계를 반복 합니다.
- 추가 axonal 구획에 저장 된 미디어를 다시. 추가 약 50 µ L 신선한 미디어, 필요에 따라 적절 한 볼륨을 유지 하 고 인큐베이터에 있는 셀을 반환 합니다.
참고: 형광 단백질 식 48 h에 의해 표시 되 고 최대 8 일 동안 지속. 신경 세포는 신경 문화 미디어에 실 온에서 30 분까지에 대 한 몇 군데 수 있습니다. 문화 미디어도 따뜻하게 CO2로 바꿀 수 있습니다-독립 최대 절전 B27 전자와 이상에 대 한 군데. 신경도 37 ° C, 5% CO2에서 잘 humidified 환경 챔버 내에서 몇 군데 있습니다. 이 경우에, 습기 이며, 칩 내에서 증발 손실 최소화를 위한 중요 한는 난방에 의해 악화 신경 건강을 손상 시킬 수 있습니다.
4. 유체 절연 칩 내의 Axonal 구획의
- 제거 20 µ L 하단에서 왼쪽 잘 axonal 구획과 장소 체세포 구획의 상단 오른쪽 우물에. Equilibrate를 각 채널 내에서 흐름에 대 일 분 기다립니다.
- Axonal 구획에서 미디어의 50 µ L을 제거 합니다. 이 미디어에 1mm 알 렉 사 Fluor 488 hydrazide의 0.3 µ L을 추가 하 고 피펫으로 통해 믹스 axonal 구획을 다시 돌아갑니다. 칩은 이미징에 대 한 준비.
참고: 다른 화합물의 추가할 수 있습니다. 관심의 화합물으로 서 비슷한 분자량과 형광 염료를 추가 시간이 지남에 유체 절연 모니터링 하려면 것이 좋습니다.
5. Axotomy 칩 내에서 수행
- 주요 채널 (그림 2A)의 입구에서 피펫으로 팁 유지 axonal 구획에서 미디어를 제거 하 고 원심 분리기 튜브에 저장.
- 발음 axonal 구획 완전히, 포부 피펫으로 axonal 구획 (그림 2B)의 주요 채널의 어느 입구 근처에 배치. 1-2 분 솔루션 구획에서 완전히 제거 해야 열망을 계속 합니다.
참고: 포부에 대 한 진공 압력 적어도 18 인치-Hg axotomy 프로시저 제대로 작동 해야 합니다. - 저장된 미디어와 axonal 구획을 장착 하 고 현미경으로 칩을 보면 축 삭 절단 됩니다 확인.
참고: 미디어를 교체할 때 거품 axonal 구획에서 형성, 5.1-5.2 단계 반복 합니다. - 인큐베이터에는 칩을 반환 합니다.
6. 형광 Immunostaining 칩 내에서
- PBS (4% 포름알데히드, 1 µ M MgCl2, 0.1 µ m CaCl2, 120mm 자당)에서 4% 포름알데히드 고정 솔루션 준비
- 칩의 우물에서 미디어의 대부분을 제거 (내부 구획을 건조 하지 마십시오).
- 즉시 axonal 및 체세포 구획의 최고 우물에 고정 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
- 1 분 후 하단 웰 스에 고정 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분에 대 한 수정.
- 칩의 우물에서 솔루션의 대부분을 제거 (내부 구획을 건조 하지 마십시오). 즉시 각 axonal 및 체세포 구획의 최고 우물의 PBS의 150 µ L를 추가 합니다. 아래 우물 흘러 pbs 2 분 기다립니다.
- 6.5 단계를 두 번 반복 합니다.
- 칩의 우물에서 PBS의 대부분을 제거 합니다. 즉시 추가 0.25%와 PBS의 150 µ L axonal 및 체세포 구획의 최고 우물의 각 TritonX-100. 15 분을 기다립니다.
- 칩의 우물에서 액체의 대부분을 제거 하 고 즉시 axonal 및 체세포 구획의 최고 우물의 각 차단 솔루션 (PBS에 10% 정상 염소 혈 청)의 150 µ L를 추가 합니다. 15 분을 기다립니다.
참고: 효과적인 차단 솔루션 2 차 항 체, 예를 들어, 당나귀 안티 양 이차 항 체에 대 한 특정 해야, 당나귀 혈 청을 사용 하 여 차단 솔루션. - 칩의 우물에서 액체의 대부분을 제거 하 고 즉시 axonal 및 체세포 구획의 최고 우물의 각 PBS에서 1% 정상 염소 혈 청에서의 1 차적인 항 체 (항 체) 100 µ L를 추가 합니다. 커버 증발을 최소화 하 고 하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C 1 시간 기다립니다.
- 칩의 우물에서 솔루션의 대부분을 제거 (내부 구획을 건조 하지 마십시오). 즉시 각 axonal 및 체세포 구획의 최고 우물의 PBS의 150 µ L를 추가 합니다. 아래 우물 흘러 pbs 5 분 기다립니다.
- 6.10 단계를 두 번 반복 합니다.
- 칩의 우물에서 액체의 대부분을 제거 하 고 즉시 axonal 및 체세포 구획의 최고 우물의 각 PBS에 이차 항 체 (항 체)의 100 µ L를 추가 합니다. 커버 증발을 최소화 하 고 실 온에서 1 시간까지 기다립니다.
참고: 보조 항 체의 권장된 희석에 대 한 제조업체의 지침을 참조 하십시오. - 6.10-6.11 단계를 반복 합니다.
- Immunostaining의 1 일 이내 이미징 하는 경우 PBS 가득 칩을 유지. 칩 이미징 하기 전에 1 일 이상 저장 될, 파라핀 필름 증발을 방지 하기 위해 이미지 준비까지 4 ° C에서 저장에 칩을 포함 하는 접시를 줄 바꿈됩니다.
- 샘플의 장기적 저장, 설치 미디어 (예를 들어, Fluoromount-G)을 사용할 수 있습니다.
- 칩의 우물에서 액체의 대부분을 제거 합니다. 사용 하 여 1 mL 일회용 플라스틱 피펫으로 axonal 및 체세포 구획의 최고 우물의 각 미디어의 장착의 2 방울을 추가.
- 채널을 통해 설치 미디어의 흐름을 장려 하는 칩을 기울기. 5 분 후 하단 웰 스에 2 방울을 추가 합니다. 이미징 하기 전에 1 시간까지 기다립니다.
참고: 설치 미디어를 사용 하 여 후 그것 됩니다 다시 다른 대상에 대 한 조사 가능.
Representative Results
약 5-7 일 후 칩 내의 신경 성장, axonal 성장 분명 하다. 칩은 그림 3, 24 일에 신경 성장을 보여주는 시연으로 위상 대비 영상와 호환. 칩은 또한 형광 이미징 (그림 4, 그림 5, 그림 6및 그림 7)과 호환. Axonal 구획 통해 광견병 바이러스 감염 후 3 일 mCherry 양성 신경 세포와 축 삭 axonal 구획에 연장 칩 (그림 4)에 몇 군데 있었다. Fluidically 구획을 분리 하는 기능을 설명 하는 낮은 분자량 형광 염료 (알 렉 사 Fluor 488 hydrazide) axonal 구획에 추가 되었습니다. 이러한 결과 PDMS 기반 챔버17 에 비교 하 고 위상 대조와 형광 이미징에 대 한 플라스틱 칩의 적합성을 입증.
을 설명 하기 위해 플라스틱 칩 및 PDMS 장치 신경 성장 우리는 두 플랫폼에서 신경 세포를 배양 하 고 시간이 지남에 신경 성장 모니터링. 그림 5 는 22 일 3에서 신경 성장 문화; 이러한 결과 3 독립적인 실험의 대표입니다. 신경 성장은 두 플랫폼에서 최대 15 일 문화, 하지만 더 이상 문화 나 (> 21 일) 플라스틱 칩 내에서 고립 된 축 삭 표시 덜 구슬 (그림 5A)과 건강. 더 axonal 구획 내에서 축 삭을 시각화 하기 위해 우리 플라스틱 내에서 건강 한 axonal 성장을 보여주는 β-tubulin iii immunostained 칩 문화 (그림 5B)에서 22 일에.
축 삭 상해 및 재생 연구 들 에게만 미세 장치를 사용 하 여 일반적입니다. 이러한 연구의 적합성을 입증 하는 칩, 퇴행 성 신경 표시를 사용 하 여 했다 몇 군데 전과 24 h 후 axotomy (그림 6). 철회 전구 및 축 삭 재생 모두 분명 다음 axotomy 있습니다. 이러한 결과 PDMS 기반 장치14,17를 사용 하 여 게시 된 데이터.
Immunocytochemistry는 단백질 지 방화를 시각화 하기 위해 여러 구획 장치 내에서 수행 하는 일반적인 기술입니다. 24 일 후에 문화, 뉴런 칩 내에서 고정 되었고 각각 모두 흥분 성의 억제 시 냅 스 마커, vGlut1 및 vGat, 스테인드 (그림 7). 퇴행 성 레이블된 mCherry 신경 이미지 (그림 ℃)도 있었다. 이미지는 60 × 실리콘 기름 침수 목적으로, 고해상도 이미지를 수행할 수 있는 능력을 보여주는 confocal 회전 디스크를 사용 하 여 수행 되었다. 중요 한 것은, 모 수석 등뼈 신경 칩 내에서 교양 성숙한 시 냅 스를 형성 했다 시연 확대 지역 내에서 분명 했다.
그림 1 : Compartmentalizing 신경에 대 한 조립, 플라스틱 2 구획 미세 칩. (A) 위와 더 낮은 우물의 위치를 보여주는 multicompartment 칩의 도식 적인 표현입니다. (B) 보여주는 주요 채널 (또는 구획) 칩의 확대 회로도 및 구획을 연결 하는 microgrooves. 주요 채널은 약 1.5 m m × 7 × 0.060 m m (W × L × H). 너비와 높이 microgrooves의은 약 0.01 m m × 0.005 m m, 각각입니다. microgrooves의 길이 따라 구성, 0.9 mm. (C) A 사진 대표 multicompartment 칩을 포함 하는 각 주요 채널 또는 fluidically 수를 보여주는 구획에 염료를 착 색 하는 식품에 0.15 m m 각 채널을 격리 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 플라스틱 multicompartment 칩을 사용 하는 경우 필요한 pipetting 기술. ( A)와 같이 피펫으로 팁 주요 채널의 입구에서 회전할 수 추가 하 고 세척에 대 한 미디어를 발음 때. (B) 때 뉴런을 로드 하거나 수행 하는 axotomy, 피펫으로 팁 해야 메인 채널의 입구 쪽으로 각도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 문화에서 24 일에는 칩 내 전형적인 신경 성장을 보여주는 단계 대조 현미경 사진. 배아 hippocampal 신경 바로 체세포 구획에 시드 했다. 축 삭 성장 5-7 일에서 시작 하 여 axonal 구획에에서 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 역행 레이블이 신경 mCherry 형광 단백질을 표현 하 고 fluidically 절연된 axonal 구획으로 축 삭을 확장. (A) 라이브 역행 레이블이 뉴런 axonal 구획에 간단히 적용 수정된 mCherry 광견병 바이러스를 통해 감염을 보여주는 병합 된 형광 현미경 사진. 신경 군데 3 일 문화에서 21 일에 감염 된 후 했다. Axonal 구획 내에서 고립 된 microenvironment를 만드는 낮은 분자량 염료, 알 렉 사 Fluor 488 hydrazide의 응용 프로그램에 의해 증명 됩니다. (B) (A) 칩의 microgrooves 영역을 시각화 하기 위해 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지를 포함 하 여 병합 된 이미지. 레이저 공초점 현미경 30 × / 1.05 없음 실리콘 오일을 사용 하 여 스캔 이미지 인수 했다 (ne = 1.406) 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : Multicompartment PDMS 장치 및 플라스틱 칩 내 신경 성장의 측면-의해-측면 비교. (A) 단계 대조 현미경 3, 7, 15, 22 일 문화에에서 찍은 두 플랫폼의. 하단에서 22 일에는 이미지에서 가져온 더 높은 확대 지역 두 플랫폼에서이 나이에 axonal 성장을 설명 하기 위해 포함 되어 있습니다. 칩 내의 축 삭 더 연속을 PDMS 장치에 보다 건강이 나이에. (B) 의 β-tubulin III는 반전 면역 형광 현미경 사진 문화에 22 일 PDMS 장치 및 플라스틱 칩의 axonal 구획 내에서 축 삭 스테인드. 이미지 회전 디스크 confocal 이미징 시스템 / 0.45 x 20를 사용 하 여 인수 했다 렌즈 없음. 모든 스케일 바는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : Axotomy 플라스틱 multicompartment 칩 내의 hippocampal 신경의 재생. (맨 위) 수정 된 mCherry 광견병 바이러스를 사용 하 여 표시 하 고 다음 axotomy 문화에서 24 일에 전에 몇 군데 신경 퇴행 성 했다. 이미지는 '불' 컬러 룩 업 테이블을 사용 하 여 pseudocolored 했다. (아래) 같은 신경 상단 패널에 몇 군데 군데 24 h 포스트-axotomy 이었다. 흰색 파선 microgroove 방 벽의 가장자리를 보여줍니다. Axotomy 왼쪽된 파선의 위치에서 발생 했습니다. 흰색 화살표는 철회 전구를 보여줍니다. 흰색 화살표는 재생 축 색을 나타냅니다. 이미지 회전 디스크 confocal 이미징 시스템 20 × / 0.45 없음 대물 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 플라스틱 multicompartment 칩 내에서 교양 hippocampal 신경 사이 양식 synapses. Immunostaining 문화에서 24 일에 수행 되었고 60 × 실리콘 기름 침수 렌즈를 사용 하 여 체세포 구획 내에서 몇 군데. 신경 흥분 성의 냅 표식 (A) , vGlut1 (녹색) 및 (B) 억제 시 냅 스 마커, vGAT (파랑) 표현 한다. (C) 퇴행 성 표시 (빨간색) 뉴런 axonal 구획에 적용 하는 수정 된 광견병 바이러스를 통해 감염 되었다 mCherry. (D)는 병합 된 형광 현미경 사진 vGlut1, vGat, 및 mCherry의. (E) 백색 상자 표시 (d) 확대 지역 모 수석 등뼈, 다른 신경에서 시 냅 시스 입력을 수신 하는 사이트를 보여 줍니다. 이미지 회전 디스크 confocal 이미징 시스템으로 60 × / 1.3 없음 실리콘 오일을 사용 하 여 인수 했다 (ne = 1.406) 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 플라스틱 multicompartment 칩 | PDMS multicompartment 장치 |
| 축 삭을 분리 | 축 삭을 분리 |
| microenvironments 설정 | microenvironments 설정 |
| axotomize 신경 | axotomize 신경 |
| 광학 투명 | 광학 투명 |
| 높은 해상도 이미지와 호환 | 높은 해상도 이미지와 호환 |
| 형광 현미경 검사 법와 호환 | 형광 현미경 검사 법와 호환 |
| 완전 조립 | 필요한 기판 어셈블리 |
| 건강 한 축 삭 > 21 일 | 건강 한 축 삭 > 14 일 |
| 친수성 자란 표면 | 소수 성 |
| 가스 불 침투성 | 가스 투과 |
| 둥근된 microgrooves 및 채널 | 똑바로 microgrooves |
| 적은 준비 단계 | 탑은 microgrooves 내 얼룩에 대 한 이동식 |
| 레이저 절제와 호환 되지 않습니다 | 작은 분자 및 유기 용 매 흡수 |
| 미네랄 오일 기반 침수 오일 (실리콘 기반 오일은 괜 찮 아 요)와 호환 되지 않습니다 |
표 1: 플라스틱 및 신경 세포 배양에 대 한 PDMS multicompartment 플랫폼의 비교.
Discussion
Compartmentalizing 신경, 장기 신경 문화를 제공 하는 사용 하기 쉬운 옵션을 제공 하는 플라스틱 multicompartment 칩 (> 3 주). 이 프로토콜에는 문화 외피 그리고 hippocampal murine 뉴런이 칩 내에서 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 용 해 microenvironments의 생성 및 레이블 뉴런을 역행 하 고, axotomy, 수행 하 고 immunocytochemistry를 수행 하는 방법 또한 토론 되었다. 중요 한 것은, 이러한 칩은 호환 고해상도, 형광, 그리고 라이브 영상.
플라스틱 multicompartment 칩 많은 PDMS 기반 들 에게만 장치, 동일한 기능을 제공 하지만 장점, 단점, 그리고 몇 가지 특징. 표 1 의 플라스틱 칩 및 PDMS 기반 장치 기능 비교를 제공합니다. 맨먼저, 칩은 미리 조립 및 영구적으로 친수성 만든 일로, 그들을 사용 하 여 쉽게 만들기를 용이 하 게 있다. 플라스틱 이므로 하지 가스 투과성, PDMS, 달리 거품 예기치 않게 채널 내에서 형성, 그들은 쉽게 탈출 하지 않는 및 제거 해야 합니다. 주로 에탄올 및 기타 독점 에이전트 포함 된 사전 코팅 솔루션 거품 형성을 제거 합니다.
형광 단백질의 다음 변환 칩 (그림 4) 내에서 수행 하는 계획의 영상 라이브 그리고 플라스틱의 아무 감지 autofluorescence 했다. 경고는 실리콘 오일을 기반으로, 그리고 하지 미네랄 오일 기반 침수 오일을 높은 수 가늠 구멍 목표에 대 한 칩 함께 사용 되어야 합니다. 미네랄 오일 순환 올레 핀 공중 합체와는 부작용을 일으킬 수 있습니다. 대물 영상 끝에서 반올림 되는 칩에 microgrooves의 양쪽 끝에 몇 가지 빛 굴절을 일으키는 microgroove 장벽으로 메인 채널의 z 방향으로의 점진적 나아지고 있다 메모 하는 것이 중요 하다는 (그림 3) 이미징 명시 하는 동안 microgrooves. 미크론 크기의 microgrooves에 항 체 침투의도 수는 칩 조립 때문에 (영구적으로 보 세 PDMS 기반 장치 것과 같이); 따라서, immunostaining 다음 정량 분석 채널/구획에서 수행 되어야 합니다. microgrooves 내의 신경 예측의 Immunostaining는 microgrooves에 항 체의 흐름을 돕기 위해 구획 및 fluorophores 간의 볼륨 차이 생성 하 여 개선할 수 있습니다.
Disclosures
A.M.T. 미세 챔버/칩 (미국 7419822 B2)의 발명자 이다 그리고 Xona 마이크로, LLC의 멤버 이다. 무-Xona 마이크로, LLC의 직원입니다. 재 혁 Xona 마이크로, LLC의 멤버입니다. T.N. 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 이 글의 오픈 액세스 출판 Xona 마이크로 후원 합니다.
Acknowledgments
저자는 Smita Paranjape (UNC-채 플 힐), 조이스 Ciechanowski (Xona)와 브래드 테일러 (Xona) 테일러 윌 트 (Xona), 기술 또는 사설 도움을 인정합니다. 저자 인정 Xona 마이크로, LLC 및 국립 연구소의 정신 건강 (R42 MH097377)에서 지원 합니다. 이미징은 Confocal와 다 이미징 핵심 시설의 NINDS 센터 그랜트 P30 NS045892 NICHD 센터 그랜트 (U54 HD079124)에 의해 부분적으로 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
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