Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Plastik-Chips zu Kultur und primäre murine Neuronen in Schubladen. Diese Chips sind vormontiert, benutzerfreundlich und kompatibel mit hoher Auflösung, live und Fluoreszenz-Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt die Platte Ratte hippocampal Neuronen innerhalb dieser Chips und strömungstechnische Isolation, Axotomie und Immunostaining durchführen.
Abstract
Microfabricated Methoden, um Neuronen in Schubladen sind unverzichtbare Werkzeuge für viele Neurowissenschaftler geworden. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines handelsüblichen vormontierten Kunststoff-Chips für Abschottung kultivierten primäre Ratte hippocampal Neuronen. Diese Plastik-Chips enthalten innerhalb der Ausleuchtzone der einen standard Objektträger sind kompatibel mit hoher Auflösung, live und Fluoreszenz-Bildgebung. Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie retrograde Label Neuronen über isolierte Axone mit einer modifizierten Tollwutvirus Codierung eines fluoreszierenden Proteins, isolierte Mikroumgebungen innerhalb einer Abteilung zu erstellen und durchführen Axotomie und Immunocytochemistry auf dem Chip. Neuronen sind für kultiviert > 3 Wochen innerhalb der Plastik-Chips, illustrieren die Vereinbarkeit dieser Chips für langfristige neuronalen Kulturen.
Introduction
Traditionelle Neuron Kultur nähert sich Ergebnis in zufälligen Auswuchs der Axone und Dendriten, die das Studium der Neuronen in ihrer einzigartigen polarisierte Morphologie zu verhindern. Microfabricated multicompartment Geräte sind etablierte und gut Recherche-Tools für Neurowissenschaftler in den letzten 10-15 Jahren geworden (ausgewählte hochrangige Publikationen sind referenzierten1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). diese Geräte Neuronen in Schubladen und bieten eine Methode, um physikalisch und chemisch subzelluläre Regionen von Neuronen, einschließlich Somata, Dendriten und Axone Synapsen18,19manipulieren. Sie bieten auch mehrere experimentelle Paradigmen, die nicht mit zufälligen Kulturen, einschließlich Studien der axonalen Transport, axonalen Proteinsynthese Axon Verletzungen/Regeneration und Axon-Soma-Signalisierung möglich sind. Die Grundkonfiguration des 2-Kammer besteht aus zwei parallelen mikrofluidische Kanäle getrennt durch eine Reihe von kleineren senkrecht Mikrospuren. Primär- oder Stammzellen abgeleitet Neuronen sind in einer der mikrofluidische Kanäle beschichtet, begleichen und befestigen Sie an der Unterseite des Gerätes und Neuriten im Laufe der Tage zu verlängern. Viele Wachstum Zapfen finden ihren Weg in die Mikrospuren, die klein genug sind, dass sie Zellkörper eindringen verhindern. Denn Wachstum Zapfen sind körperlich eingeschränkt und nicht in der Lage, sich innerhalb der Mikrospuren umzudrehen, wachsen sie direkt in das angrenzende Fach (axonale Fach) wo sie isoliert sind.
Historisch, sind diese Geräte haben mit poly(dimethylsiloxane) (PDMS) aus einem fotolithografisch gemusterten master-Form geformt worden und entweder hausgemacht in Ermittler Laboratorien oder kommerziell erworben. Einer der wichtigsten Nachteile der Verwendung von PDMS ist seine Hydrophobie20. PDMS kann vorübergehend hydrophil gemacht werden, aber dann wird schnell hydrophobe innerhalb von Stunden in einem nicht-wässrigen Umgebung20. Aus diesem Grund müssen die Geräte ein Glas Deckglas oder anderen geeigneten Substrat zum Zeitpunkt der Verwendung beizufügen. Vormontierte multicompartment Plastikchips sind jetzt im Handel erhältlich (z.B.XonaChips) in spritzgegossenen Kunststoff. Diese Chips sind permanent hydrophil, Vereinfachung Gerät Benetzung und damit die Vormontage des Chips mit einem dünnen Film von zyklischen Olefin-Copolymer (COC) umschließt die mikrofluidische Kanäle auf der Unterseite gemacht. Diese Chips werden in einem optisch transparenten Kunststoff geeignet für hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung hergestellt.
Dieses Protokoll soll die Verwendung der vormontierten Kunststoff mikrofluidischen Chips für mehrere experimentelle Paradigmen mit murinen hippocampal oder kortikale Neuronen durchgeführt zu demonstrieren. Dieses Protokoll beschreibt die Bezeichnung Neuronen mit einer modifizierten Tollwutvirus im Chip retrograde. Axotomie für Studien der Axon Schädigung und Regeneration werden ebenfalls beschrieben. Zu guter Letzt zeigt dieses Protokoll wie Fluoreszenz Immunostaining mit dem Gerät durchführen.
Protocol
Hinweis: Eine schematische Darstellung der Kunststoff multicompartment Chip zeigt Abb. 1A, B. Der Chip ist die Größe des einen standard Objektträger (75 mm × 25 mm). Die Funktionen des Chips, einschließlich der wichtigsten Kanäle oder Fächer, Brunnen und Mikrospuren sind beschriftet und sind zum Nachschlagen zur Verfügung gestellt. Abbildung 1 ist ein Foto von dem Chip demonstriert die strömungstechnische Isolation der Fächer.
1. Vorbereitung und Beschichtung der Multicompartment Chips
- Platzieren Sie in ein Bio-Sicherheitsschrank den Chip in einer Petrischale oder anderen geeigneten sterilen Behälter.
- Fügen Sie 100 µL Pre-Lösung für die obere linke Brunnen des Chips zu beschichten und lassen Sie ihn durch den Hauptkanal in der angrenzenden gut fließen.
Hinweis: Die Pre-Beschichtung-Lösung wird verwendet, um mikrofluidische Kanäle beseitigen das Potenzial für das Einfangen von Luftblasen im Chip vorab zu beschichten. - Füllen Sie der unteren Links gut mit 100 µL Lösung vorab zu beschichten. Warten Sie 5 min um die Lösung durch die Mikrospuren fließen zu lassen.
- Fügen Sie 100 µL Lösung für die obere bereits recht gut zu beschichten und lassen Sie ihn durch den Hauptkanal in der angrenzenden gut fließen. Füllen Sie die unteren Rechte gut mit 100 µL vor Beschichtung Lösung.
- Die Lösung von jedem Bohrloch abzusaugen. Aspirieren Sie weg von den Hauptkanälen zu vermeiden, entfernen von Flüssigkeit aus den Hauptkanälen (Abbildung 2A). Sofort fügen Sie hinzu, gut 150 µL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die obere linke Ecke. Warten Sie 1,5 min.
Achtung: Aspirieren Sie alle Flüssigkeit aus der geschlossenen Hauptkanäle nicht. - Linken unteren gut 150 µL PBS hinzufügen. Warten Sie 5 min um Flüssigkeiten durch die Mikrospuren fließen zu lassen. Die obere recht gut 150 µL PBS hinzufügen. Fügen Sie 150 µL PBS, recht gut zu senken. Warten Sie 10 Minuten.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1,6 für eine zweite PBS waschen.
- Überprüfen Sie den Chip unter dem Mikroskop Gewebekultur Blasen in den Hauptkanälen. Wenn Bläschen vorhanden sind, führen Sie die folgenden Verfahren. Wenn keine Luftblasen vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 1,9.
- Aspirieren Sie PBS aus den Vertiefungen Pipettieren Tipp abseits der Kanal öffnen (Abb. 2A) Angeln.
- 100 µL der Pre-Beschichtung Lösung in den oberen Brunnen Angeln die Spitze des Pipettieren in der Nähe der Kanal öffnen (Abb. 2 b) zu verzichten. Die Bläschen sollten durch den Kanal in den unteren Brunnen bewegen. Warten Sie 1,5 min.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,3 bis 1,8.
- Aspirieren Sie PBS aus den Vertiefungen Pipettieren Tipp abseits der Kanal öffnen (Abb. 2A) Angeln.
- Die obere linke Brunnen des Chips fügen Sie 100 µL 0,5 mg/mL Poly d-Lysin (PDL hinzu). Warten Sie 1,5 min. Füllung der unteren gut mit 100 µL der PDL links.
- Die oberen recht gut des Chips 100 µL der PDL hinzufügen. Warten Sie mind. 1,5 hinzufügen 100 µL auf dem niedrigeren Recht gut.
- Schließen Sie die Petrischale und platzieren Sie den Chip in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h.
- Wiederholen Sie die PBS waschen Schritte 1,5-1,6 zweimal, um überschüssige PDL zu entfernen.
- Aspirieren der PBS aus dem Gerät.
- Fügen Sie 100 µL Zellkulturmedien sofort oben links gut des Chips hinzu. Warten Sie gut 1,5 min. Add Media links unten. Hinzufügen von Medien zur oberen recht gut. Warten Sie mind. 1,5 hinzufügen 100 µL Medium zum unteren rechten Brunnen des Chips.
- Platzieren Sie den Chip in den Inkubator 37° C, bis bereit zu Platte Zellen.
2. Aussaat Neuronen in der Multicompartment-Chips
- Bereiten Sie Zellsuspension dissoziierten Ratte hippocampal Neuronen nach etablierte Protokolle21,22 , eine Dichte von ~ 12 × 106 Zellen/mL ergeben.
Hinweis: Verwendung der Suspension Zelldichten zwischen 3 und 12 × 106 Zellen/mL ist möglich. Wenn eine geringere Dichte verwendet wird, kann das Volumen der Zellsuspension auf dem Chip hinzugefügt werden (siehe unten) erhöht werden. Das unten beschriebene Verfahren ist anwendbar für murine dissoziierten kortikalen oder hippocampal Neuronen. Optimale Zelldichten für andere Neuron können variieren. - Entfernen Sie die Mehrheit der Medien in jede Vertiefung des Chips, verlassen ca. 5 µL in jede Vertiefung. Aspirieren Sie weg von den Hauptkanälen zu vermeiden, entfernen von Flüssigkeit aus den Hauptkanälen (Abbildung 2A).
Achtung: Aspirieren Sie Flüssigkeit aus der geschlossenen Hauptkanäle nicht. Luftblasen können in den Chip eingeklemmt werden, wenn Flüssigkeit aus den wichtigsten Kanälen abgesaugt wird. - Laden 5 µL Zellsuspension in der oberen recht gut und ein weiterer 5 µL Zellsuspension in der unteren rechten gut (~ 120.000 Zellen insgesamt). Laden Sie die Zellen durch den Verzicht auf in der Nähe des Hauptkanals (Abb. 2 b). Überprüfen Sie unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass die Neuronen im Hauptkanal. Warten Sie 5 Minuten damit die Zellen legen.
Hinweis: Neuronen können in jedem Fach geladen werden. Zwecken der Erklärung der somatische Fach ist der Hauptkanal auf der rechten Seite, aber entweder Fach kann als die somatischen Fach verwendet werden. Nutzung der unteren Zelldichten bis zu 60.000 Zellen pro Chip ist möglich. Bis zu 10 µL der Zelle Aussetzung zu jedem zugesetzt werden gut von den somatischen Fach in Kombination mit einer Zellsuspension mit weniger Zellen als oben beschrieben. - Fügen Sie ca. 150 µL der neuronalen Nährmedien zu jedem der oberen und unteren rechten Brunnen, und fügen Sie dann 150 µL der Medien zu jedem der oberen und unteren Brunnen links. Platzieren Sie den Chip in befeuchtete Fach in einem 5 % CO2 37 ° C Inkubator.
- Führen Sie nach 24 h ein Medienwechsel durch Entfernen von Medien aus dem Brunnen. Sicherstellen Sie, dass der Hauptkanal gefüllt bleibt. Jedes Top gut 150 µL Medien hinzu, und füllen Sie dann die unteren Brunnen.
- Platzieren Sie den Chip zurück in den Inkubator für die gewünschte Anzahl von Tagen.
Hinweis: Kontrollieren die Medien alle paar Tage um sicherzustellen, dass es Reste hellrosa. Ersetzen Sie die Medien gelblich 50 % davon mit neuen Medien. Wenn der Flüssigkeitsstand zu niedrig ist, stellen Sie sicher, dass es ausreichend Feuchtigkeit und geeignete Auffangeinrichtungen Chips um Verdunstung zu verhindern. Minimieren oder sogar zu eliminieren, Medien-Veränderungen ist möglich, mit Auffangeinrichtungen und/oder decken die Schüssel mit dem Chip mit Polytetrafluorethylen (PTFE)-FEP-Film.
3. retrograde Kennzeichnung von Neuronen im Chip
Hinweis: Retrograde Kennzeichnung kann durchgeführt werden mit mehreren Techniken, einschließlich der Verwendung von modifizierten Cholera-Toxin und Tollwut-Virus. Im folgenden sind Anweisungen für die Kennzeichnung von Neuronen G gelöscht Tollwut-mCherry oder -eGFP Virus verwenden. Potentiell infektiösem Material gemäß der lokalen Organisation Richtlinien zu behandeln. Zusatzausbildung sein erforderlich.
- Warme frische neuronalen Nährmedien auf 37 ° C. ~ 400 µL Medien pro Chip zu schätzen.
- Verdünnen Sie 100.000 virale Einheiten der modifizierten Tollwutvirus in insgesamt 50 µL mit Medien entnommen entweder gut des axonalen Kompartiments.
Hinweis: Entsorgen Sie Tipps und Rohre in Kontakt mit den Virus nach dem Protokoll Organisation genehmigt. - Sanft Rohr Pipettieren der restlichen Medien aus den Brunnen der axonalen Fach und Speicher in einer Zentrifuge bei 37 ° C.
- Das axonale Fach 150 µL des frischen warmen Medien und 50 µL verdünnter Virus hinzufügen. 2 h bei 37 ° C Inkubator inkubieren.
- Medien, die Viren zu entfernen und ordnungsgemäß entsorgen.
Hinweis: Luftblasen können auf dem Chip eingeklemmt werden, wenn Flüssigkeit aus den wichtigsten Kanälen abgesaugt wird. - Leicht auch ein Axon 75 µL frische Medien hinzu und lassen Sie es gut mit den anderen Axon fließen.
- Durchströmten aus dem zweiten Axon gut entfernen und entsorgen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.6 und 3.7 einmal.
- Fügen Sie gespeicherte Medien zum axonalen Fach zurück. Fügen Sie ca. 50 µL frische Medien, ggf. ausreichend Volumen und die Zellen in den Inkubator zurückkehren.
Hinweis: Fluoreszierende Protein-Expression von 48 h sichtbar ist und bleibt für bis zu 8 Tage. Neuronen können für bis zu 30 min bei Raumtemperatur in neuronalen Kulturmedien abgebildet werden. Nährmedien auch ausgetauscht werden mit erwärmten CO2-unabhängige überwintern E mit B27 und für mehr abgebildet. Neuronen können auch innerhalb einer gut befeuchtete Klimakammer bei 37 ° C und 5 % CO2abgebildet werden. In diesem Fall ist Befeuchtung entscheidend zur Minimierung der Verdunstungsverluste innerhalb der Chips, die wird noch verschärft durch Heizung und Neuron Gesundheit gefährden können.
(4) strömungstechnische Isolation der axonalen Fach innerhalb der Chip
- Entfernen Sie 20 µL vom unteren verließ auch der axonalen Fach und Platz in den oberen rechten Brunnen der somatischen Fach. Warten Sie 2 min für Strömung innerhalb jedes Kanals zu equilibrate.
- Das axonale Fach entnehmen Sie 50 µL Medien. Dieses Medium 0,3 µL 1 mM Alexa Fluor 488 Hydrazid hinzufügen, mischen über pipettieren und wieder zurück auf das axonale Fach. Der Chip ist bereit für die Bildgebung.
Hinweis: Andere Verbindungen des Interesses können hinzugefügt werden. Hinzufügen einen Fluoreszenzfarbstoff mit einem ähnlichen Molekulargewicht als Verbindung von Interesse wird empfohlen, um die strömungstechnische Isolation im Laufe der Zeit zu überwachen.
5. Durchführung von Axotomie im Chip
- Entfernen Sie Medien aus dem axonalen Fach halten den Pipettieren Tipp vom Eingang von dem Hauptkanal (Abbildung 2A) und speichern Sie es in ein Zentrifugenröhrchen.
- Aspirieren der axonalen Fachs komplett, platzieren die Aspiration Pipettieren entweder Eingang von dem Hauptkanal des axonalen Kompartiments (Abb. 2 b). Weiterhin streben für 1-2 min. sorgen dafür, dass die Lösung aus dem Fach vollständig entfernt wird.
Hinweis: Der Unterdruck zum Absaugen muss mindestens 18 Zoll-Hg für die Axotomie Prozedur ordnungsgemäß funktioniert. - Ersetzen der axonalen Fachs mit den gespeicherten Medien und bestätigen, dass die Axone durchtrennt werden, indem Sie den Chip unter dem Mikroskop betrachten.
Hinweis: Wenn Luftblasen in der axonalen Fach bilden, wenn die Medien ersetzen, wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.2. - Den Chip in den Inkubator zurück.
(6) Fluoreszenz Immunostaining im Chip
- Bereiten Sie 4 % Formaldehyd Fixierung Lösung mit PBS-Puffer (4 % Formaldehyd, 1 µM MgCl2, 0,1 µm CaCl2, 120 mM Saccharose)
- Die meisten Medien in den Vertiefungen des Chips zu entfernen (Innenfächer nicht trocken).
- Fügen Sie 100 µL der Fixierung Lösung sofort die oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer hinzu.
- Fügen Sie nach 1 min. 100 µL Fixierung Lösung die unteren Brunnen hinzu. Fix für 30 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die meisten der Lösung aus den Brunnen des Chips (Innenfächer nicht trocken). Fügen Sie sofort 150 µL PBS zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer. Warten Sie 2 Minuten für die PBS in den unteren Brunnen fließen.
- Wiederholen Sie Schritt 6.5 zweimal.
- Entfernen Sie die meisten des öffentlich-rechtlichen Rundfunks aus dem Brunnen des Chips. Fügen Sie sofort 150 µL PBS mit 0,25 % TritonX-100 zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer. 15 min. warten.
- Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit aus den Brunnen des Chips und jeder der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer sofort fügen Sie 150 µL blocking-Lösung (10 % normalem Ziegenserum in PBS hinzu). 15 min. warten.
Hinweis: Effektive Blockierung Lösungen sollte speziell für die sekundäre Antikörper, z. B.für einen Esel Anti-Schafe Sekundärantikörper, Esel Serum in die blockierende Lösung verwenden. - Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit aus den Brunnen des Chips zu und sofort fügen Sie 100 µL Primärantikörper (oder Antikörper hinzu) in 1 % normalem Ziegenserum in PBS zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer. Zurücklegen Sie, um Verdunstung zu minimieren und für 1 h bei Raumtemperatur oder 4 ° C über Nacht warten.
- Entfernen Sie die meisten der Lösung aus den Brunnen des Chips (Innenfächer nicht trocken). Fügen Sie sofort 150 µL PBS zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer. Warten Sie 5 Minuten für die PBS in den unteren Brunnen fließen.
- Wiederholen Sie Schritt 6.10 zweimal.
- Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit aus den Brunnen des Chips zu und sofort fügen Sie 100 µL der Sekundärantikörper (oder Antikörper hinzu) mit PBS-Puffer jeweils der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer. Zurücklegen Sie, um Verdunstung zu minimieren und für 1 h bei Raumtemperatur warten.
Hinweis: Finden Sie den Anweisungen des Herstellers zur empfohlenen Verdünnung der Sekundärantikörper. - Wiederholen Sie die Schritte 6.10-6.11.
- Wenn innerhalb eines Tages Immunostaining imaging, halten Sie den Chip mit PBS gefüllt. Wenn länger als 1 Tag vor der Bildbearbeitung Chip gespeichert werden, wickeln Sie die Schale mit dem Chip in Paraffin Film um Verdunstung zu verhindern und bei 4 ° C bis zu Bild speichern.
- Für eine längere Laufzeit Lagerung der Proben können Montage Medien (z. B.Fluoromount-G) verwendet werden.
- Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit aus den Brunnen des Chips. Verwenden Sie eine 1 mL Einweg Plastik pipettieren, 2 Tropfen Montage Medien zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer hinzuzufügen.
- Kippen Sie den Chip, um den Fluss der Montage Medien durch die Kanäle zu fördern. Tropfen Sie nach 5 min 2 auf die unteren Brunnen. Warten Sie, bis 1 h vor Bildgebung.
Hinweis: Nach der Verwendung von Montage-Medien werden nicht für andere Ziele neu Sonde möglich.
Representative Results
Nach ca. 5-7 Tagen der Neuron-Wachstum innerhalb der Chip wird axonale Wachstum deutlich. Die Chips sind kompatibel mit Phasenkontrast-Bildgebung wie in Abbildung 3, die neuronale Wachstum an 24 Tagen zeigt. Die Chips sind auch kompatibel mit Fluoreszenz-imaging (Abbildung 4, Abb. 5, Abbildung 6und Abbildung 7). Drei Tage nach der Tollwut-Virus-Infektion über das axonale Fach wurden mCherry-positiven Neuronen mit Axone erstreckt sich in der axonalen Fach auf dem Chip (Abbildung 4) abgebildet. Um die Fähigkeit, strömungstechnisch zu isolieren, die Fächer zu demonstrieren, wurde das axonale Fach ein niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoff (Alexa Fluor 488 Hydrazid) hinzugefügt. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit PDMS-basierte Kammer17 und die Eignung des Kunststoff-Chips für Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Imaging zu demonstrieren.
Zur Veranschaulichung neuronale Wachstum mit der Plastik-Chips und PDMS Geräte wir kultivierten Neuronen auf beiden Plattformen und neuronale Wachstum im Laufe der Zeit überwacht. Abbildung 5 zeigt neuronale Wachstum von 3 bis 22 Tage in Kultur; Diese Ergebnisse sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Neuronale Wachstum gleicht sich innerhalb der beiden Plattformen bis zu 15 Tage in Kultur, aber bei längeren Kultur im Alter (> 21 Tage) isolierte Axone im Kunststoff Chip erscheinen gesünder mit weniger Sicke (Abb. 5A). Weitere Axone innerhalb der axonalen Fächer visualisieren wir Immunostained für β-Tubulin III das axonale Wachstum im Kunststoff zeigt chips auf 22 Tage in Kultur (Abb. 5 b).
Axon Schädigung und Regeneration Studien sind häufig mit mikrofluidischen unterteilte Geräten. Um die Eignung dieser Studien zeigen mit den Chips, retrograde beschriftet Neuronen wurden abgebildet vor und 24 h nach Axotomie (Abbildung 6). Eine Retraktion Glühbirne und regenerierenden Axon sind beide offensichtlich folgenden Axotomie. Diese Ergebnisse sind gleichbedeutend mit veröffentlichten Daten mit PDMS-basierte Geräte14,17.
Immunocytochemistry ist ein gebräuchliches Verfahren durchgeführt in Mehrkammer-Geräte, Protein Lokalisierung zu visualisieren. Nach 24 Tagen in Kultur, Neuronen innerhalb der Chips wurden fixiert und gefärbt für exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Marker, vGlut1 und vGat, bzw. (Abbildung 7). Retrograde beschrifteten mCherry Neuronen wurden auch abgebildet (Abb. 7). Bildgebung erfolgte mittels rotierende Festplatten konfokale mit einem 60 × Silikon Öl eintauchen Ziel, Nachweis der Fähigkeit, hochauflösende Bildgebung durchführen. Wichtig ist, zeigten sich dendritische Dornen innerhalb einer vergrößerten Region zeigen, dass die Neuronen innerhalb der Chips kultiviert wurden Reifen Synapsen bilden.
Abbildung 1 : Eine vormontierte, Kunststoff Zweikammer-Mikrofluidik-Chip für Abschottung Neuronen. (A) schematische Darstellung der multicompartment Chip zeigt die Standorte der oberen und unteren Brunnen. (B) einen erweiterten schematische Darstellung der Chip zeigt die wichtigsten Kanäle (oder Fächer) und Mikrospuren, die die Abteile zu verbinden. Die wichtigsten Kanäle sind ca. 1,5 mm × 7 × 0.060 mm (W × L × H). Die Breite und Höhe der Mikrospuren sind ca. 0,01 mm × 0,005 mm, beziehungsweise. Die Länge der die Mikrospuren variiert je nach Konfiguration, 0,15 mm bis 0,9 mm. (C) A Foto von einer repräsentativen multicompartment Chip mit Lebensmittelfarbe färben in jedem Hauptkanal oder Fach Nachweis der Fähigkeit, strömungstechnisch Jeder Kanal zu isolieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Pipettieren Techniken erforderlich, wenn multicompartment Plastikchips verwenden. (A) beim Hinzufügen und Absaugen von Medien für Waschungen, sollte der Pipettieren Tipp entfernt vom Eingang des Hauptkanals angewinkelt werden, wie gezeigt. (B) Wenn Neuronen laden oder ausführen Axotomie, Pipettieren Tipp sollte schräg in Richtung zum Eingang von dem Hauptkanal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Eine Phase Kontrast Schliffbild zeigt typische neuronale Wachstum innerhalb der Chip an 24 Tagen in der Kultur. Embryonale hippocampale Neuronen wurden in das rechts somatischen Fach ausgesät. Axon Wachstum spiegelt sich in der axonalen Fach ab ca. 5-7 Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Retrograde beschriftete Neuronen express mCherry fluoreszierendes Protein und Axone in ein strömungstechnisch isoliert axonalen Fach zu verlängern. (A) eine zusammengeführte Fluoreszenz Schliffbild zeigt live retrograde beschriftete Neuronen infiziert über eine modifizierte mCherry-Tollwut-Virus kurz auf das axonale Fach angewendet. Neuronen wurden abgebildeten 3 Tage nach der Infektion auf 21 Tage in Kultur. Erstellen einer isolierten Mikroumgebung innerhalb der axonalen Fach wird durch Anwendung eines niedermolekularen Farbstoffes, Alexa Fluor 488 Hydrazid demonstriert. (B) eine zusammengeführte Bild (A) einschließlich Kontrast (DIC) eine differenzielle Interferenzbild um Mikrospuren Region des Chips zu visualisieren. Bilder mit Laserscanning confocal Mikroskop mit einem 30 × / 1.05 N.A Silikonöl erworben wurden (Ne = 1.406) Objektiv. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Side-by-Side-Vergleich der neuronale Wachstum innerhalb multicompartment PDMS-Geräte und Plastik-Chips. (A) Phase Kontrast Mikrographen beider Plattformen an 3, 7, 15 und 22 Tage in Kultur genommen. An der Unterseite ist eine höhere Vergrößerung Region genommen von den Bildern auf 22 Tage enthalten axonale Wachstum in diesem Alter in beiden Plattformen zu veranschaulichen. Axone im Chip sind mehr kontinuierlich und in diesem Alter gesünder als in der PDMS-Gerät angezeigt. (B) ein Invert Immunfluoreszenz Schliffbild des β-Tubulin III gebeizt Axone innerhalb der axonalen Fach PDMS Geräte-und Kunststoff-Chip auf 22 Tage in Kultur. Bilder wurden mit einem drehenden Festplatte konfokale imaging System mit einem 20 x / 0,45 erworben Objektivlinse N.A. Alle Maßstabsleisten sind 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Axotomie und Regeneration der hippocampal Neuronen innerhalb der Kunststoff multicompartment Chip. (Oben) Neuronen wurden retrograde mit einem modifizierten mCherry-Tollwut-Virus gekennzeichnet und dann vor Axotomie 24 Tage in Kultur abgebildet. Bilder wurden pseudocolored mit der "Fire" Farbtabelle nachschlagen. (Unten) Die gleichen Neuron abgebildet im oberen Fensterbereich wurde abgebildeten 24 h Post-Axotomie. Weiße gestrichelte Linien zeigen die Kanten der Mikrorille Barriere. Axotomie ereignete sich an der Position der linken gestrichelten Linie. Die weiße Pfeilspitze zeigt eine Retraktion Glühbirne. Der weiße Pfeil zeigt eine regenerierende Axon. Bilder wurden mit einem Spinning Disk konfokale imaging System mit einem 20 × / 0,45 N.A Objektiv erworben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Synapsen bilden sich zwischen hippocampal Neuronen innerhalb multicompartment Plastikchips kultiviert. Immunostaining war an 24 Tagen in der Kultur durchgeführt und innerhalb der somatischen Fach mit einem 60 × Silikon Öl eintauchen Objektiv abgebildet. Neuronen zum Ausdruck bringen (A) der erregenden Synapse-Marker, vGlut1 (grün) und (B) des hemmenden Synapse Markers, vGAT (blau). (C) Retrograde mit der Bezeichnung mCherry, die Neuronen (rot) über geänderte Tollwut-Virus auf der axonalen Fach angewendet infiziert waren. (D) eine zusammengeführte Fluoreszenz Schliffbild von vGlut1, vGat und mCherry. (E) die vergrößerte Region (d) mit einem weißen Kasten angegeben zeigt dendritische Dornen, die Websites, die synaptischen Input von anderen Neuronen erhalten. Bilder wurden mit einem Spinning Disk konfokale imaging System mit einem 60 × / 1.3 N.A Silikon-Öl erworben (Ne = 1.406) Objektiv. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Multicompartment Plastikchips | PDMS multicompartment Geräte |
| isolieren die Axone | isolieren die Axone |
| Mikroumgebungen zu etablieren | Mikroumgebungen zu etablieren |
| Axotomize Neuronen | Axotomize Neuronen |
| optisch transparent | optisch transparent |
| kompatibel mit hochauflösende Bildgebung | kompatibel mit hochauflösende Bildgebung |
| kompatibel mit Fluoreszenz-Mikroskopie | kompatibel mit Fluoreszenz-Mikroskopie |
| komplett montiert | Montage auf Substrat erforderlich |
| gesunden Axone > 21 Tage | gesunden Axone > 14 Tage |
| hydrophile Kultivierung Oberfläche | hydrophobe |
| Gas undurchlässige | gasdurchlässig |
| abgerundete Mikrospuren und Kanäle | gerade Mikrospuren |
| weniger Vorbereitungsschritte | Deckel kann abgenommen werden zum Färben innerhalb Mikrospuren |
| nicht kompatibel mit Laser-ablation | Aufnahme von kleinen Molekülen und organische Lösungsmittel |
| nicht kompatibel mit Mineralöl-basierten eintauchen Öle (auf Basis von Silikon Öle sind gut) |
Tabelle 1: Kunststoff und PDMS multicompartment Plattformen für die Kultivierung von Neuronen im Vergleich.
Discussion
Multicompartment Plastikchips bieten eine einfach zu bedienende Option für Abschottung Neuronen, Bereitstellung von langfristigen neuronalen Kulturen (> 3 Wochen). Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie die kortikale und hippocampale murine Neuronen innerhalb dieser Chips Kultur. Die Schaffung von löslichen Mikroumgebungen und Gewusst wie: retrograde Label Neuronen, Axotomie, und durchzuführen Immunocytochemistry wurden ebenfalls erörtert. Wichtig ist, diese Chips sind kompatibel mit hoher Auflösung, Fluoreszenz und live Imaging.
Multicompartment Plastikchips bieten viele der gleichen Funktionen wie die PDMS-basierte unterteilte Geräte jedoch haben Vorteile, Nachteile und einige Unterscheidungsmerkmale. Tabelle 1 bietet einen Featurevergleich der Kunststoff-Chip und PDMS-basierten Geräten. Zuallererst sind die Chips vormontiert und machte permanent hydrophil, was erleichtert Benetzung, so dass sie einfacher zu bedienen. Der Kunststoff ist nicht gasdurchlässig, im Gegensatz zu PDMS, so bilden sich Bläschen unerwartet in den Kanälen, sie nicht ohne weiteres entkommen können und entfernt werden müssen. Ein Pre Beschichtungslösung, enthält hauptsächlich Ethanol und einige andere proprietären Agenten verhindert Blasenbildung.
Live-Darstellung der Projektionen, die folgenden Transduktion von fluoreszierenden Proteinen innerhalb der Chips (Abbildung 4) ausgeführt wurde und gab es keine nachweisbaren Autofluoreszenz des Kunststoffs. Ein Nachteil ist, dass Immersion Öle mit dem Chip für hoher numerischer Apertur Ziele Silikonöl basieren und nicht Mineralöl basiert sein müssen. Mineralöl kann dazu führen, dass eine negative Reaktion mit der zyklischen Olefin-Copolymer. Für Hellfeld Bildgebung, ist es wichtig zu beachten, dass Mikrospuren im Chip an den Enden abgerundet sind und es gibt eine allmähliche Verjüngung der Z-Richtung von der Hauptkanäle in Richtung die Mikrorille Barriere verursacht einige Lichtbrechung an beiden Enden der Mikrospuren im Hellfeld imaging (Abbildung 3). Da der Chip bereits vormontiert ist, Antikörper Eindringen in die Mikron mittelständische Mikrospuren uneben sein kann (wie bei dauerhaft verklebt PDMS-basierte Geräte); Quantitative Analyse nach Immunostaining sollte somit in den Kanälen/Fächern durchgeführt werden. Immunostaining neuronalen Projektionen innerhalb der Mikrospuren kann verbessert werden, indem man eine Volumendifferenz zwischen den Fächern zugunsten den Fluss von Antikörpern und Fluorophore in der Mikrospuren.
Disclosures
A.M.T. ist Erfinder des mikrofluidischen Kammer/Chips (US 7419822 B2) und ist Mitglied des Xona Microfluidics, LLC. V.P. ist Angestellter des Xona Microfluidics, LLC. J.h. ist Mitglied des Xona Microfluidics, LLC. T.n. erklärt keinen finanziellen Interessenkonflikt. Open-Access-Veröffentlichung dieses Artikels wird gesponsort von Xona Microfluidics.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen technischen oder redaktionellen Betreuung von Taylor willst (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) und Brad Taylor (Xona). Die Autoren erkennen Unterstützung Xona Microfluidics, LLC und dem National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Bildgebung wurde teilweise durch die Confocal und Multiphoton Imaging Core Facility der NINDS Center Grant P30 NS045892 und NICHD Center Grant (U54 HD079124) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
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