Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van plastic fiches om cultuur en grendelen primaire lymfkliertest neuronen. Deze chips zijn voorgemonteerd, gebruiksvriendelijke en compatibel met hoge resolutie, levend, en fluorescentie beeldvorming. Dit protocol wordt beschreven hoe plaat rat hippocampal neuronen binnen deze chips en uitvoeren van fluidic isolatie, axotomy en immunokleuring.
Abstract
Microfabricated methoden te grendelen neuronen zijn essentiële instrumenten geworden voor vele neurowetenschappers. Dit protocol beschrijft het gebruik van een commercieel beschikbare vooraf geassembleerde kunststof chip voor compartimentering gekweekte primaire rat hippocampal neuronen. Deze plastic chips, deel uitmaakt van de voetafdruk van een standaard microscoopglaasje, compatibel zijn met hoge resolutie, levend, en fluorescentie beeldvorming. Dit protocol laat zien hoe retrograde label neuronen via geïsoleerde axonen met behulp van een gemodificeerde rabiësvirus codering een fluorescente proteïne, geïsoleerde microenvironments binnen één compartiment maken en uitvoeren van axotomy en immunocytochemie op de chip. Neuronen worden gekweekt voor > 3 weken binnen de plastic chips, ter illustratie van de verenigbaarheid van deze chips voor lange termijn neuronale culturen.
Introduction
Traditionele neuron cultuur benaderingen leiden tot willekeurige uitgroei van axonen en dendrites, waardoor de studie van neuronen in hun unieke gepolariseerde morfologie. Microfabricated multicompartment apparaten zijn gevestigde en goed gebruikt onderzoekstools voor neurowetenschappers geworden in de afgelopen 10-15 jaar (geselecteerde spraakmakende publicaties zijn waarnaar wordt verwezen1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). deze apparaten gecompartimenteerd neuronen en bieden een methode om te fysisch en chemisch manipuleren subcellular regio's van neuronen, met inbegrip van waarin, dendrites, axonen en synapsen18,19. Zij bieden ook meerdere experimentele paradigma's die niet mogelijk met behulp van willekeurige culturen, met inbegrip van studies van axonale vervoer, axonale eiwitsynthese axon blessure/regeneratie en axon-naar-soma signalering. De basisconfiguratie van de 2-vaks bestaat uit twee parallelle microfluidic kanalen gescheiden door een aantal kleinere loodrecht microgrooves. Primair of afgeleid van stamcellen neuronen zijn verguld in één van de microfluidic kanalen, regelen en hechten aan de onderkant van het apparaat en neurites in de loop van dagen uitbreiden. Veel groei kegels vinden hun weg naar de microgrooves, die klein genoeg zijn dat ze voorkomen cel organen invoeren dat. Omdat de groei kegels zijn fysiek beperkt en niet in staat om te draaien binnen de microgrooves, groeien ze rechtstreeks in het aangrenzende compartiment (axonale compartiment) waar ze geïsoleerd zijn.
Historisch, zijn deze apparaten hebben is gevormd met behulp van poly(dimethylsiloxane) (PDMS) van een photolithographically patroon meester mal en gemaakt van in-house in onderzoekers laboratoria of commercieel gekocht. Een van de belangrijkste nadelen van het gebruik van PDMS is haar hydrophobicity20. PDMS tijdelijk hydrofiele kan plaatsvinden, maar dan snel wordt hydrofobe binnen uur in een niet-waterig milieu20. Vanwege dit, moeten de apparaten worden aangesloten op een glas dekglaasje aan of andere geschikt substraat op het moment van gebruik. Vooraf geassembleerde kunststof multicompartment chips zijn nu commercieel beschikbaar (bijvoorbeeldXonaChips) in spuitgegoten kunststof. Deze chips zijn gemaakt permanent hydrofiele, vereenvoudiging van de apparaat bevochtiging en waardoor de pre-assemblage van de chip met een dunne film van cyclische olefine copolymeer (COC) bijvoeging van de microfluidic kanalen op de bodem. Deze chips zijn vervaardigd in een optisch doorzichtig plastic geschikt voor hoge-resolutie fluorescentie imaging.
Het doel van dit protocol is het gebruik van de chips van vooraf geassembleerde kunststof microfluidic voor meerdere experimentele paradigma's uitgevoerd met behulp van lymfkliertest hippocampal of corticale neuronen te demonstreren. Dit protocol wordt beschreven hoe retrograde label neuronen met behulp van een gemodificeerde rabiësvirus binnen de chip. Axotomy voor studies van axon blessure en regeneratie worden ook beschreven. Tot slot, dit protocol laat zien hoe fluorescentie immunokleuring uitvoeren met het apparaat.
Protocol
Opmerking: Een schematische voorstelling van de plastic multicompartment chip wordt weergegeven in figuur 1A, B. De chip is de grootte van een standaard microscoopglaasje (75 mm × 25 mm). De functies van de chip, met inbegrip van de belangrijkste kanalen of compartimenten, putten en microgrooves worden aangeduid en zijn beschikbaar voor toekomstig gebruik. Figuur 1 c is een foto van de chip aan het fluidic isolement van de compartimenten te tonen.
1. voorbereiding en Coating van de Multicompartment Chips
- In een kast van bioveiligheid, de chip in een petrischaal of andere geschikte steriele container te plaatsen.
- Voeg 100 µL vooraf coating oplossing voor de linksboven putje van de chip en laat het stromen via het belangrijkste kanaal naar de aangrenzende goed.
Opmerking: De pre coating oplossing wordt gebruikt voor vooraf jas de microfluidic kanalen te elimineren van het potentieel voor het overlappen van luchtbellen binnen de chip. - Vul de onderste links goed met 100 µL vooraf coating oplossing. Wacht 5 min zodat de oplossing voor de stroom door de microgrooves.
- Voeg 100 µL vooraf coating oplossing voor de bovenste rechts goed en laat het stromen via het belangrijkste kanaal naar de aangrenzende goed. Vul de lagere juiste put met 100 µL vooraf coating oplossing.
- De oplossing van elk putje gecombineerd. Gecombineerd uit de buurt van de belangrijkste kanalen om te voorkomen dat het verwijderen van vloeistof uit de belangrijkste kanalen (figuur 2A). Aan de linker bovenhoek toevoegen onmiddellijk goed 150 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). 1.5 min wachten.
Let op: Niet alle vloeistof uit de bijgevoegde belangrijkste kanalen gecombineerd. - Voeg 150 µL PBS ook naar linksonder. Wacht 5 min zodat vloeistoffen te stromen via de microgrooves. Voeg 150 µL PBS recht ook naar de rechterbovenhoek. Voeg 150 µL PBS tot lagere recht goed. Wacht 10 minuten.
- Herhaal stap 1.5-1.6 voor een tweede PBS wassen.
- Check de chip onder een Microscoop weefselkweek voor de bubbels in de belangrijkste kanalen. Als bubbels aanwezig zijn, moet u de volgende procedures uitvoert. Als geen luchtbellen aanwezig zijn, gaat u naar stap 1.9.
- Gecombineerd PBS de putjes hengelen het uiteinde van de pipet uit de buurt van het kanaal openen (figuur 2A).
- Breng 100 µL van vooraf coating oplossing in de bovenste goed, hengelen het uiteinde van de pipet in de buurt van het kanaal openen (figuur 2B). De bubbels moeten verplaatsen via het kanaal naar de lagere put. 1.5 min wachten.
- Herhaal stap 1.3-1.8.
- Gecombineerd PBS de putjes hengelen het uiteinde van de pipet uit de buurt van het kanaal openen (figuur 2A).
- Voeg 100 µL van 0, 5 mg/mL poly d-lysine (PDL) aan de linksboven putje van de chip. 1,5 min. opvulling de onderste links goed met 100 µL van PDL wachten.
- Voeg 100 µL voor PDL naar de bovenste rechts waterput van de chip. Wachten 1,5 min. Voeg 100 µL naar de lagere juiste waterput.
- Sluit de petrischaal en plaatsen van de chip in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Herhaaldestappen PBS wassen 1.5-1.6 tweemaal te verwijderen overtollige PDL.
- Gecombineerd de PBS van het apparaat.
- Onmiddellijk vergroten met 100 µL van cel voedingsbodems de linksboven putje van de chip. Wacht nou 1,5 min. toevoegen media naar linksonder. Media toevoegen aan de bovenste rechts goed. Wachten 1,5 min. Voeg 100 µL middellange tot de lagere rechter waterput van de chip.
- Plaats de chip in de 37° C incubator totdat u naar cellen van de plaat.
2. het zaaien van neuronen in de Multicompartment Chips
- Bereiden celsuspensie van gedissocieerde rat hippocampal neuronen volgens de vastgestelde protocollen21,22 tot en met een dichtheid van ~ 12 × 106 cellen/mL opleveren.
Opmerking: Gebruik van cel schorsing dichtheid tussen 3 en 12 × 10-6 cellen/mL is mogelijk. Als een lagere dichtheid wordt gebruikt, kan het volume van de celsuspensie worden toegevoegd aan de chip worden verhoogd (zie hieronder). De hieronder beschreven procedure is van toepassing voor lymfkliertest gedissocieerde corticale of hippocampal neuronen. Optimale cel dichtheden voor andersoortige neuron kunnen variëren. - Verwijder de meerderheid van de media in elk putje van de chip, waardoor ongeveer 5 µL in elk putje. Gecombineerd uit de buurt van de belangrijkste kanalen om te voorkomen dat het verwijderen van vloeistof uit de belangrijkste kanalen (figuur 2A).
Let op: Niet gecombineerd vloeistof uit de bijgevoegde belangrijkste kanalen. Luchtbellen kunnen worden gevangen in de chip als vloeistof is aanzuiging van de belangrijkste kanalen. - 5 µL celsuspensie in de bovenste rechts goed laden en een andere 5 µL celsuspensie in de lagere juiste put (~ 120.000 cellen totaal). Laad de cellen door verstrekking van dicht bij de belangrijkste kanaal (figuur 2B). Kijk onder een microscoop om ervoor te zorgen de neuronen in het belangrijkste kanaal. Wacht 5 minuten om de cellen te koppelen.
Opmerking: Kunnen de neuronen in beide compartiment worden geladen. Behoeve van de uitleg, de somatische compartiment is het belangrijkste kanaal aan de rechterkant, maar beide compartiment kan worden gebruikt als de somatische compartiment. Gebruik van lagere dichtheden van de cel tot 60.000 cellen per spaander is mogelijk. Tot 10 µL van cel schorsing kan worden toegevoegd aan elk goed voor de somatische compartment in combinatie met een celsuspensie met minder cellen dan hierboven beschreven. - Toevoegen van ongeveer 150 µL van neuronale voedingsbodems aan elk van de bovenste en onderste rechts wells, en dan 150 µL van media toevoegen aan elk van de bovenste en de onderste links van putten. Plaats de chip in bevochtigde lade in een 5% CO2 37 ° C incubator.
- Voer na 24u, een verandering van de media door het verwijderen van media uit de putten. Zorg ervoor dat het belangrijkste kanaal gevuld blijft. Voeg 150 µL van media aan elk putje top, en vul vervolgens de onderkant putten.
- Plaats de chip terug in de incubator voor het gewenste aantal dagen.
Opmerking: Toezicht op de media om de paar dagen om ervoor te zorgen het blijft licht roze. Als de media geelachtig is, vervangen door 50% van het verse media. Het vloeistofniveau is laag, Controleer of er voldoende vochtigheid en passende secundaire inperking van de chips ter voorkoming van verdamping. Minimaliseren of zelfs te elimineren, media wijzigingen is mogelijk met behulp van secundaire insluiting en/of die betrekking hebben op de schotel met de chip met polytetrafluorethyleen (PTFE)-FEP film.
3. retrograde Labeling van neuronen binnen de Chip
Opmerking: Retrograde labeling kan worden uitgevoerd met behulp van meerdere technieken, waaronder het gebruik van gemodificeerde cholera-toxine en rabiës-virus. Hieronder zijn de instructies voor het labelen van neuronen gebruikend G-deleted rabiës-mCherry of -eGFP virus. Omgaan met mogelijk besmettelijke materialen volgens de richtlijnen van de lokale organisatie. Aanvullende opleiding kan worden verlangd.
- Warme verse neuronale voedingsbodems tot 37 ° C. ~ 400 µL van media per spaander te schatten.
- Verdun 100.000 virale eenheden van gemodificeerde rabiësvirus in een totaal van 50 µL gebruik van media die zijn ontleend aan een goed van de axonale compartiment.
Opmerking: Afzet van tips en buizen in contact met het virus volgens de organisatie goedgekeurde protocol. - Zachtjes Pipetteer de resterende media uit de putten van de axonale compartiment en winkel in een centrifuge buis bij 37 ° C.
- Voeg 150 µL van verse warme media en de 50 µL van verdunde virus tot het axonale compartiment. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C incubator.
- Media met virus verwijderen en verwijdering van het goed.
Opmerking: Luchtbellen kunnen worden gevangen in de chip als vloeistof is aanzuiging van de belangrijkste kanalen. - Zachtjes 75 µL van verse media toevoegen aan een axon goed en laat ze goed naar de andere axon vloeien.
- Verwijder doorstroming uit de tweede axon goed en gooi goed.
- Herhaal stap 3.6 en 3.7 eens.
- Voeg opgeslagen media Terug naar de axonale compartiment. Ongeveer 50 µL verse media toevoegen, indien nodig, te handhaven voldoende volume en de cellen terug te keren naar de incubator.
Opmerking: TL eiwit expressie is zichtbaar door 48 h en tot 8 dagen of langer aanhoudt. Neuronen kunnen voor maximaal 30 minuten bij kamertemperatuur in neuronale voedingsbodems worden beeld. Voedingsbodems kan ook worden vervangen door verwarmde CO2-zelfstandige slaapstand E met B27 en beeld voor meer. Neuronen kunnen ook worden beeld binnen een goed bevochtigde milieu kamer bij 37 ° C en 5% CO2. In dit geval is bevochtiging van cruciaal belang voor het minimaliseren van de verdampingsemissie verliezen binnen de chips, die wordt verergerd door verwarming en neuron gezondheid in gevaar kan brengen.
4. fluidic isolatie van de axonale compartiment binnen de Chip
- Verwijderen van 20 µL van de onderste links goed van de axonale compartiment en de plaats in de hogere juiste put van de somatische afdeling. 2 min. voor stroom binnen elk kanaal equilibreer wachten.
- Verwijder 50 µL van media uit de axonale compartiment. 0,3 µL van 1 mM Alexa Fluor 488 hydrazide toevoegen aan deze media, meng via Pipetteer en terugkeren naar het axonale compartiment. De chip is klaar voor de beeldvorming.
Opmerking: Andere verbindingen van belang kunnen worden toegevoegd. Een fluorescente kleurstof met een soortgelijke moleculair gewicht als de compound van belang toe te voegen wordt aanbevolen om te controleren fluidic isolatie na verloop van tijd.
5. het uitvoeren van Axotomy binnen de Chip
- Media verwijderen uit het axonale compartiment houden het uiteinde van de pipet uit de buurt van de ingang van het belangrijkste kanaal (figuur 2A) en bewaar het in een centrifugebuis.
- Gecombineerd het axonale compartiment volledig, plaatsen de aspiratie Pipetteer in de buurt van een ingang van het belangrijkste kanaal van de axonale compartiment (figuur 2B). Blijven streven voor 1-2 min. ervoor te zorgen dat de oplossing volledig uit het compartiment is verwijderd.
Opmerking: De vacuüm druk voor aspiratie moet ten minste 18 inch-Hg voor de procedure van de axotomy goed te laten werken. - Vervang de axonale compartiment met de opgeslagen media en bevestigen dat de axonen zijn doorgesneden door te kijken naar de chip onder een microscoop.
Opmerking: Als de bubbels in het axonale compartiment vormen bij het vervangen van de media, herhaalt u stap 5.1-5.2. - De chip terugkomen in de incubator.
6. fluorescentie immunokleuring binnen de Chip
- Bereiden van 4% formaldehyde fixatie oplossing in PBS (4% formaldehyde, 1 µM MgCl20.1 µm CaCl2, 120 mM sacharose)
- De meeste van de media in de putten van de chip te verwijderen (niet droog interieur compartimenten).
- Onmiddellijk 100 µL van fixatie oplossing toevoegen aan de bovenste putjes van de compartimenten axonale en somatische.
- Na 1 minuut, voeg 100 µL van fixatie oplossing aan de onderkant putjes. Fix voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Allermeest naar de oplossing van de putten van de chip te verwijderen (niet droog interieur compartimenten). Voeg onmiddellijk 150 µL van PBS toe aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische afdelingen. Wacht 2 min voor de PBS te stromen in de onderste putten.
- Herhaal stap 6.5 tweemaal.
- Allermeest naar de PBS verwijdert uit de putten van de chip. Onmiddellijk vergroten met 150 µL van PBS met 0,25% TritonX-100 aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische afdelingen. Wacht 15 min.
- Allermeest naar de vloeistof uit de putten van de chip verwijderen en onmiddellijk 150 µL van blokkerende oplossing (10% normale geit serum in PBS) toe te voegen aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische afdelingen. Wacht 15 min.
Opmerking: Effectieve blokkeren oplossingen moet specifiek zijn voor het secundaire antilichaam, bijvoorbeeldvoor een ezel anti-schapen secundair antilichaam, ezel serum in de blokkerende oplossing gebruiken. - De meeste van de vloeistof uit de putten van de chip verwijderen en onmiddellijk 100 µL van primair antilichaam (of antilichamen) in 1% normale geit serum in PBS toevoegen aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische afdelingen. Dekken om te minimaliseren van verdamping en wacht gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C's nachts.
- Allermeest naar de oplossing van de putten van de chip te verwijderen (niet droog interieur compartimenten). Voeg onmiddellijk 150 µL van PBS toe aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische afdelingen. Wacht 5 minuten voor de PBS te stromen in de onderste putten.
- Herhaal stap 6.10 tweemaal.
- De meeste van de vloeistof uit de putten van de chip verwijderen en onmiddellijk 100 µL van secundair antilichaam (of antilichamen) in PBS toevoegen aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische afdelingen. Dekken om te minimaliseren van verdamping en wacht gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor de Aanbevolen verdunning van secundaire antilichamen. - Herhaal stap 6.10-6.11.
- Als imaging binnen 1 dag van immunokleuring, houden de chip gevuld met PBS. Als de chip zal langer dan 1 dag vóór de beeldvorming worden opgeslagen, wikkel de schotel met de chip in paraffine film ter voorkoming van verdamping en bewaren bij 4 ° C tot klaar voor de afbeelding.
- Voor de langere termijn opslag van de monsters, kan montage media (bijvoorbeeldFluoromount-G) worden gebruikt.
- Allermeest naar de vloeistof uit de putten van de chip te verwijderen. Gebruik een wegwerp plastic pipet 1 mL 2 druppels montage media aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische afdelingen toevoegen.
- Kantel de chip ter bevordering van de stroom van de montage media via de kanalen. Voeg 2 druppels aan de onderkant putjes na 5 min. Wacht 1 h voor imaging.
Opmerking: Na het gebruik van montage media het zal niet mogelijk opnieuw sonde voor andere doelen.
Representative Results
Na ongeveer 5-7 dagen van neuron groei binnen de chip blijkt axonale groei. De chips zijn compatibel met fase contrast beeldvorming zoals aangetoond in Figuur 3, waaruit blijkt van neuronale groei op 24 dagen. De chips zijn ook compatibel met fluorescentie imaging (Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6en 7 van de figuur). Drie dagen na de rabiës virusbesmetting via de axonale compartiment, waren mCherry-positieve neuronen met een uitbreiding in het axonale compartiment axons beeld in de chip (Figuur 4). Om aan te tonen de mogelijkheid om fluidically isoleren van de compartimenten, een laag molecuulgewicht fluorescente kleurstof (Alexa Fluor 488 hydrazide) toevoegde aan de axonale compartiment. Deze resultaten zijn vergelijkbaar met de PDMS gebaseerde kamer17 en aantonen van de geschiktheid van de plastic chip voor fase contrast en fluorescentie beeldbewerking.
Om te illustreren neuronale groei met de plastic fiches en PDMS apparaten, we beschaafde neuronen in beide platformen en neuronale groei na verloop van tijd gecontroleerd. Figuur 5 toont neuronale groei van 3 tot 22 dagen in cultuur; deze resultaten zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Neuronale groei is vergelijkbaar binnen de twee platforms tot 15 dagen in cultuur, maar bij langer cultuur leeftijden (> 21 dagen) geïsoleerde axonen binnen de plastic chip weergegeven gezonder met minder beading (figuur 5A). Verder visualiseren axonen binnen de axonale afdelingen, wij immunostained voor β-tubuline III waarin gezonde axonale groei binnen de plastic fiches op 22 days in cultuur (figuur 5B).
Axon blessure en regeneratie studies zijn gemeenschappelijke microfluidic gecompartimenteerd apparaten gebruiken. Om aan te tonen van de geschiktheid van deze studies met behulp van de chips, retrograde label neuronen waren beeld vóór en 24u na axotomy (Figuur 6). Een retractie lamp en regenereren van axon zijn beide duidelijk volgende axotomy. Deze resultaten komen overeen met de gepubliceerde gegevens met behulp van PDMS-gebaseerde apparaten14,17.
Immunocytochemie is een gemeenschappelijke techniek uitgevoerd binnen multi compartiment apparaten te visualiseren van eiwitten lokalisatie. Na 24 dagen in cultuur, neuronen binnen de chips werden vastgesteld en gekleurd voor zowel excitatory en remmende synaptic markers, vGlut1 en vGat, respectievelijk (Figuur 7). Retrograde gelabelde mCherry neuronen waren ook verbeelde (Figuur 7 c). Imaging werd uitgevoerd met behulp van draaiende schijf confocal met een 60 × silicone olie onderdompeling doelstelling, de mogelijkheid om uit te voeren met een hoge resolutie imaging demonstreren. Bovenal waren dendritische spines duidelijk in een vergrote gebied, aan te tonen dat de neuronen binnen de chips gekweekte volwassen synapsen waren vormen.
Figuur 1 : Een voorgemonteerd, kunststof 2-vaks microfluidic-chip voor compartimentering neuronen. (A) schematische weergave van de multicompartment chip toont de locaties van de bovenste en onderste putten. (B) een uitgebreide schematische voorstelling van een chip waarin de belangrijkste kanalen (of compartimenten) en microgrooves die de compartimenten verbinden. De belangrijkste kanalen zijn ongeveer 1,5 mm × 7 × 0.060 mm (W × L × H). De breedte en de hoogte van de microgrooves zijn ongeveer 0,01 mm × 0,005 mm, respectievelijk. De lengte van de microgrooves is afhankelijk van de configuratie, 0,15 mm tot 0.9 mm. (C) A foto van een representatieve multicompartment chip met voedsel kleurstof kleuren in elke belangrijkste kanaal of compartiment aan te tonen de mogelijkheid om te fluidically isoleren van elk kanaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Pipetting technieken die nodig zijn bij het gebruik van kunststof multicompartment chips. (A) wanneer toe te voegen en zuigen media voor wast, het uiteinde van de pipet uit de buurt van de ingang van het belangrijkste kanaal moet worden gedraaid, zoals. (B) wanneer het laden van neuronen of het uitvoeren van axotomy, de Pipetteer tip moet schuin naar de ingang van het belangrijkste kanaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Een fase contrast opname typische neuronale groei binnen de chip op 24 dagen in cultuur tonen. Embryonale hippocampal neuronen werden zaadjes in het recht somatische compartiment. Axon groei is zichtbaar in het begin van de axonale compartiment op 5-7 dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Retrograde gelabelde neuronen express mCherry TL proteïne en axonen uit te breiden naar een fluidically geïsoleerde axonale compartiment. (A) een opname van de samengevoegde fluorescentie tonen live retrograde gelabelde neuronen besmet via een gewijzigde mCherry rabiësvirus kort toegepast op het axonale compartiment. Neuronen waren verbeelde 3 dagen na infectie op 21 days in cultuur. Creëren van een geïsoleerde communicatie binnen het axonale compartiment wordt aangetoond door toepassing van een laag molecuulgewicht kleurstof, Alexa Fluor 488 hydrazide. (B) een samengevoegde afbeelding van (A) met inbegrip van een differentiële interferentie contrast (DIC) afbeelding om te visualiseren van de microgrooves-regio van de chip. Beelden werden verkregen met laser confocal microscoop met behulp van een 30 × / 1.05 N.A. siliconenolie scannen (ne = 1,406) objectief. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Side-by-side vergelijking van neuronale groei binnen multicompartment PDMS apparaten en plastic chips. (A) fase contrast microfoto van beide platformen op 3, 7, 15 en 22 dagen in cultuur genomen. Aan de onderkant is een hogere vergroting regio genomen van de beelden op 22 dagen opgenomen om illustreren axonale groei op deze leeftijd binnen beide platformen. Axonen binnen de chip zijn meer continu en gezonder zijn dan in het PDMS apparaat verschijnen op deze leeftijd. (B) een omkeren immunofluorescentie opname van β-tubuline III gekleurd axonen binnen de axonale compartiment van zowel het PDMS apparaat en de plastic chip op 22 days in cultuur. Beelden werden verkregen met een draaiende schijf confocal imaging systeem met behulp van een 20 x / 0.45 N.A. objectief. Alle schaal bars zijn 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Axotomy en regeneratie van de hippocampal neuronen binnen de kunststof multicompartment chip. (Boven) Neuronen waren retrograde aangeduid met behulp van een gemodificeerde mCherry rabiësvirus en vervolgens beeld voor axotomy op 24 days in cultuur. Beelden waren pseudocolored met behulp van de 'Vuur' kleur look-up tabel. (Onder) Het dezelfde neuron beeld in het bovenste netdeel was verbeelde 24 h post-axotomy. Witte onderbroken lijnen tonen de randen van de microgroove-barrière. Axotomy vond plaats op de locatie van de linker stippellijn. De witte pijlpunt toont een retractie lamp. De witte pijl geeft een verkwikkende axon. Beelden werden verkregen met een draaiende schijf confocal imaging systeem met behulp van een 20 × / 0,45 N.A. objectief. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Vorm tussen hippocampal neuronen binnen kunststof multicompartment chips gekweekte synapses. Immunokleuring werd uitgevoerd op 24 days in cultuur en beeld in de somatische compartiment met behulp van een 60 × silicone olie onderdompeling lens. Neuronen express (A) de markering excitatory SYNAPS, vGlut1 (groen) en (B) de inhiberende synapsen marker, vGAT (blauw). (C) Retrograde label mCherry neuronen (rood) werden besmet via gemodificeerde rabiësvirus toegepast op het axonale compartiment. (D) een samengevoegde fluorescentie opname van vGlut1, vGat en mCherry. (E) het vergrote gebied in (D) aangegeven met een wit vak toont dendritische spines, de sites die synaptic input te ontvangen van andere neuronen. Beelden werden verkregen met een draaiende schijf confocal imaging systeem met behulp van een 60 × / 1.3 N.A. siliconenolie (ne = 1,406) objectief. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Kunststof multicompartment chips | PDMS multicompartment apparaten |
| axonen isoleren | axonen isoleren |
| stand microenvironments | stand microenvironments |
| axotomize neuronen | axotomize neuronen |
| optisch transparant | optisch transparant |
| compatibel met hoge resolutie beeldvorming | compatibel met hoge resolutie beeldvorming |
| compatibel met fluorescentie microscopie | compatibel met fluorescentie microscopie |
| volledig geassembleerd | montage op ondergrond vereist |
| gezonde axonen > 21 dagen | gezonde axonen > 14 dagen |
| hydrofiele kweken oppervlak | hydrofoob |
| gas ondoordringbare | gas permeabele |
| afgeronde microgrooves en kanalen | rechte microgrooves |
| minder voorbereiding stappen | Top is afneembaar voor vlekken binnen microgrooves |
| niet compatibel met laser ablatie | absorptie van kleine molecules & organische oplosmiddelen |
| niet compatibel met minerale olie gebaseerde onderdompeling oliën (oliën op basis van siliconen zijn prima) |
Tabel 1: Vergelijking van plastic en PDMS multicompartment platforms voor het kweken van neuronen.
Discussion
Kunststof multicompartment chips hebben een easy-to-use-optie voor compartimentering van neuronen, die op lange termijn neuronale culturen (> 3 weken). Dit protocol detailleert hoe cultuur corticale en hippocampal lymfkliertest neuronen binnen deze chips. De oprichting van oplosbare microenvironments en hoe retrograde label neuronen, het uitvoeren van axotomy, en het uitvoeren van immunocytochemie werden ook besproken. Belangrijk is dat deze chips zijn compatibel met hoge resolutie, fluorescentie, en levende imaging.
Kunststof multicompartment chips bieden veel van de dezelfde functies als de PDMS gebaseerde gecompartimenteerd apparaten, maar hebben voordelen, nadelen en enkele onderscheidende kenmerken. Tabel 1 bevat een functievergelijking van zowel plastic chip en PDMS-gebaseerde apparaten. Eerst en vooral, zijn de chips voorgemonteerd en permanent hydrofiele, die vergemakkelijkt bevochtiging, waardoor ze makkelijker te gebruiken. Het plastic is niet gas permeabele, in tegenstelling tot PDMS, dus als bubbels onverwacht binnen de kanalen vormen, ze niet gemakkelijk ontsnappen doen en moeten worden verwijderd. Een oplossing van de pre coating met voornamelijk ethanol en sommige andere merkgebonden agentia elimineert luchtbel vorming.
Live beeldvorming van projecties volgende transductie van fluorescente proteïnen werd uitgevoerd binnen de chips (Figuur 4) en er was geen detecteerbare autofluorescence van de plastic. Een valkuil is dat onderdompeling oliën die worden gebruikt met de chip voor hoge numerieke diafragma doelstellingen siliconenolie gebaseerde, en geen minerale olie gebaseerd moeten zijn. Minerale olie kan leiden tot een negatieve reactie met de cyclische olefine copolymeer. Voor helderveld beeldvorming, is het belangrijk op te merken dat de microgrooves in de chip aan de uiteinden zijn afgerond en er is een geleidelijke stiftschroeven van de z-richting van de belangrijkste kanalen naar de barrière van de microgroove veroorzaken sommige lichtbreking aan elk uiteinde van de microgrooves tijdens helderveld imaging (Figuur 3). Omdat de chip voorgemonteerd is, antilichaam penetratie in de micron en middelgrote microgrooves mogelijk ongelijke (zoals bij permanent gekleefde PDMS-gebaseerde apparaten); kwantitatieve analyse na immunokleuring moet dus worden uitgevoerd in de kanalen/compartimenten. Immunokleuring van neuronale projecties binnen de microgrooves kan worden verbeterd door het creëren van een volumeverschil tussen de compartimenten om de stroom van antilichamen en fluorophores in de microgrooves.
Disclosures
A.M.T. is een uitvinder van de microfluidic kamer/chip (ons 7419822 B2) en deel uitmaakt van Xona Microfluidics, LLC. V.P. is een medewerker van Xona Microfluidics, LLC. J.H. is een lid van Xona Microfluidics, LLC. T.N. verklaart geen concurrerende financiële belangen. Openaccess publicatie van dit artikel is gesponsord door Xona Microfluidics.
Acknowledgments
De auteurs erkennen technische of redactionele hulp van Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) en Brad Taylor (Xona). De auteurs erkennen steun van Xona Microfluidics, LLC en het National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Imaging werd gedeeltelijk ondersteund door de Confocal en Multiphoton Imaging Core faciliteit van NINDS Center Grant P30 NS045892 NICHD Center Grant (U54 HD079124). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington's Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell Reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
- Yang, Y., et al. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61 (6), 880-894 (2009).
- Sutton, M. A., Taylor, A. M., Ito, H. T., Pham, A., Schuman, E. M. Postsynaptic decoding of neural activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission to local protein synthesis. Neuron. 55 (4), 648-661 (2007).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nature Cell Biology. 11 (8), 1024-1030 (2009).
- Sharma, N., et al. Long-distance control of synapse assembly by target-derived NGF. Neuron. 67 (3), 422-434 (2010).
- Harrington, A. W., et al. Recruitment of actin modifiers to TrkA endosomes governs retrograde NGF signaling and survival. Cell. 146 (3), 421-434 (2011).
- Zhang, Y., et al. Assembly and maintenance of nodes of ranvier rely on distinct sources of proteins and targeting mechanisms. Neuron. 73 (1), 92-107 (2012).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Tran, H. T., et al. Alpha-synuclein immunotherapy blocks uptake and templated propagation of misfolded alpha-synuclein and neurodegeneration. Cell Reports. 7 (6), 2054-2065 (2014).
- Calafate, S., et al. Synaptic Contacts Enhance Cell-to-Cell Tau Pathology Propagation. Cell Reports. 11 (8), 1176-1183 (2015).
- Cosker, K. E., Fenstermacher, S. J., Pazyra-Murphy, M. F., Elliott, H. L., Segal, R. A. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 19 (5), 690-696 (2016).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes? Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , Second edition, MIT Press. (1998).
