该协议描述了使用塑料芯片培养和分割主要小鼠神经元。这些芯片是预装的, 用户友好的, 并与高分辨率, 活的和荧光成像兼容。该方案描述了如何在这些芯片内对大鼠海马神经元进行平板治疗, 并进行流控分离、轴切和免疫染色。
微制造的神经元分割方法已成为许多神经科学家必不可少的工具。该协议描述了使用一个商业上可用的预组装塑料芯片, 以分割培养的原代大鼠海马神经元。这些塑料芯片包含在标准显微镜幻灯片的占地面积内, 与高分辨率、实时成像和荧光成像兼容。该协议演示了如何通过使用修改后的狂犬病毒编码荧光蛋白的孤立轴突逆行标签神经元, 在一个隔间内创建孤立的微环境, 并在芯片上进行轴切和免疫细胞化学。神经元在塑料芯片内培养 gt;3 周, 说明了这些芯片对长期神经元培养的兼容性。
传统的神经元培养方法会导致轴突和树突的随机生长, 从而阻止神经元在其独特的极化形态中的研究。在过去10-15 中, 微制造的多隔间装置已成为神经科学家公认和使用良好的研究工具 (选定的高调出版物参考1,2,3,4 个,5,6,7.,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17). 这些装置将神经元分割开来, 并提供了一种物理和化学方法来操作神经元的亚细胞区域, 包括 somata、树突、轴突和突触 18, 19.它们还提供了多种实验范式, 不可能使用随机培养, 包括轴突转运、轴突蛋白合成、轴突损伤再生和轴向-soma 信号的研究。基本的2室配置由两个平行的微流体通道组成, 由一系列较小的垂直微沟槽隔开。原代或干细胞衍生神经元被镀成微流控通道之一, 沉淀并附着在设备的底面上, 并在几天内延伸神经元。许多生长锥进入微沟槽, 微沟槽足够小, 可以阻止细胞体进入。由于生长锥受到物理限制, 无法在微沟槽内掉头, 它们直接生长到相邻的隔间 (轴突隔间), 在那里它们被隔离。
从历史上看, 这些器件是使用多 (二甲基硅氧烷) (pdms) 从光刻图案的主模具中成型的, 或者是在调查人员实验室内部制造的, 或者是商业购买的。使用 pdms 的主要缺点之一是它的疏水性20。pdms 可以暂时进行亲水性, 但在非水环境中, pdms 会在数小时内迅速变得疏水20。因此, 设备在使用时必须连接到玻璃覆盖件或其他合适的基板上。预组装的塑料多隔间芯片现已在注塑塑料中上市 (例如, XonaChips)。这些芯片是永久亲水的, 简化了设备的润湿性, 并允许芯片的预组装与薄膜的循环烯烃共聚物 (coc) 包围底部的微流体通道。这些芯片是在适用于高分辨率荧光成像的光学透明塑料中制造的。
该方案的目的是演示使用预先组装的塑料微流体芯片的多个实验范式进行使用小鼠海马或皮质神经元。该协议描述了如何在芯片内使用改良的狂犬病毒逆行标记神经元。还介绍了轴突损伤和再生研究的轴突切开术。最后, 该协议演示了如何与该器件一起进行荧光免疫染色。
塑料多隔间芯片为神经元的分割提供了一个易于使用的选择, 提供了长期的神经元培养 (和 gt;3 周)。该协议详细介绍了如何在这些芯片内培养皮质和海马小鼠神经元。还讨论了可溶性微环境的产生以及如何逆行标记神经元, 进行轴切, 并执行免疫细胞化学。重要的是, 这些芯片与高分辨率、荧光和实时成像兼容。
塑料多隔间芯片提供了许多与基于 pdms 的分区化器件相同的功能, 但具有优点、缺点和一些显著的特点。表 1提供了塑料芯片和基于 pdms 的设备的功能比较。首先, 芯片是预先组装和永久亲水性, 这有利于润湿, 使他们更容易使用。塑料不是气体渗透性, 不像 pdms, 所以如果气泡意外地形成在渠道内, 他们不容易逃逸, 必须被删除。一种预涂液, 主要含有乙醇和其他一些专有药物, 可消除气泡的形成。
在芯片内对荧光蛋白转导后的投影进行实时成像 (图 4), 且没有检测到的塑料自体荧光。需要注意的是, 与芯片一起用于高数值孔径目标的浸油必须是硅油为基础的, 而不是以矿物油为基础的。矿物油可引起与循环烯烃共聚物的不良反应。对于光场成像, 需要注意的是, 芯片中的微槽在末端是圆形的, 并且主要通道的 z 方向逐渐向微槽屏障倾斜, 导致在在明亮场成像过程中的微凹槽 (图 3)。由于芯片是预组装的, 因此抗体在微米大小的微凹槽中的渗透可能不均匀 (如永久粘合的 pdms 设备);因此, 免疫染色后的定量分析应在通道/隔间进行。通过在隔间之间创建体积差异来帮助抗体和荧光体流入微沟槽, 可以改善微沟槽内神经元投射的免疫染色。
The authors have nothing to disclose.
提交人感谢 taylor wilt (xona)、smita Paranjape (uncn-chapel hill)、joyce ci罗·哈诺夫斯基 (xona) 和 brad taylor (xona) 提供的技术或编辑协助。提交人感谢 xona 微流体有限责任公司和国家心理健康研究所 (r42 mh097377) 的支持。成像部分得到了 ninsd 中心赠款 p30 ns045892 和 nichd 中心赠款 (u54 hd079124) 共聚焦和多光子成像核心设施的部分支持。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |