Det här protokollet beskriver användningen av plast marker till kultur och kategoriserar primära murina nervceller. Dessa marker är förmonterade, användarvänlig och kompatibel med hög upplösning, levande, och fluorescens imaging. Det här protokollet beskriver hur plåt råtta Hippocampus nervceller inom dessa marker och utföra fluidic isolering, axotomy och immunfärgning.
Biochips metoder att kategoriserar nervceller har blivit viktiga verktyg för många neuroforskare. Det här protokollet beskriver användningen av ett kommersiellt tillgängliga förmonterade plast chip för compartmentalizing odlade primära råtta Hippocampus nervceller. Dessa plast marker, som ingår i fotavtryck av ett standard objektglas, är kompatibla med hög upplösning, levande, och fluorescens imaging. Detta protokoll visar hur man retrograd etikett nervceller via isolerade axoner använder en modifierad rabiesvirus kodning en fluorescerande protein, skapa isolerade mikromiljö inom ett fack och utföra axotomy och immuncytokemi på-chip. Nervceller är odlade för > 3 veckor inom plast marker, som illustrerar förenligheten av dessa marker för långsiktiga neuronala kulturer.
Traditionella neuron kultur närmar sig resultatet i slumpmässiga utväxt av axoner och dendriter, som hindrar studiet av nervceller i deras unika polariserade morfologi. Biochips multicompartment enheter har blivit väl etablerade och välanvända forskningsverktyg för neuroforskare under de senaste 10-15 år (utvalda högprofilerade publikationer finns refererade1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). dessa enheter kategoriserar nervceller och tillhandahålla en metod för att fysiskt och kemiskt manipulera subcellulär regioner av nervceller, inklusive somata, dendriter, axoner och synapser18,19. De ger också flera experimentella paradigm som inte är möjligt med hjälp av slumpmässiga kulturer, inklusive studier av axonal transport, axonal proteinsyntes, axon skada/förnyelse och axon-till-soma signalering. Den grundläggande 2-fack-konfigurationen består av två parallella mikroflödessystem kanaler åtskilda av en rad mindre vinkelrätt microgrooves. Primär eller stamceller-derived nervceller är klädd i en mikroflödessystem kanal, kvitta och bifoga till undersidan av enheten och förlänga neuriter under loppet av dagar. Många tillväxt kottar finna sin väg in i microgrooves, som är tillräckligt små för att de förhindrar cell organ kommer in. Eftersom tillväxten kottar är fysiskt begränsad och oförmögen att vända inom microgrooves, växer de rakt in i den angränsande fack (axonal fack) där de är isolerade.
Historiskt har är dessa enheter har varit gjuten med poly(dimethylsiloxane) (PDMS) från en photolithographically mönstrade herre mögel och antingen gjord in-house i utredarnas laboratorier eller köpt kommersiellt. En av de viktigaste nackdelarna med att använda PDMS är dess vattenavvisande egenskaper20. PDMS kan göras hydrofil tillfälligt, men sedan blir snabbt hydrofoba inom timmar i en icke vattenhaltigt miljö20. På grund av detta, måste enheter vara anslutna till ett täckglas eller andra lämpliga substrat vid tidpunkten för användningen. Förmonterade plast multicompartment marker finns nu kommersiellt tillgängliga (t.ex., XonaChips) i formsprutad plast. Dessa chips görs permanent hydrofil, förenkla enhet vätning och låta före montering av chip med en tunn film av cyklisk olefin copolymer (COC) omslutande mikroflödessystem kanalerna på botten. Dessa marker är tillverkade i ett optiskt transparent plast som är lämplig för högupplösta fluorescens imaging.
Syftet med detta protokoll är att demonstrera användningen av förmonterade plast mikroflödessystem marker för flera experimentella paradigm utförs med murin Hippocampus eller kortikala nervceller. Det här protokollet beskriver hur man retrograd etikett nervceller använder en modifierad rabiesvirus inom chip. Axotomy för studier av axon skada och regenerering beskrivs också. Avslutningsvis visar detta protokoll hur man utför fluorescens immunfärgning med enheten.
Plast multicompartment marker ger en lätt-till-använda alternativet för compartmentalizing nervceller, som tillhandahåller långsiktiga neuronala kulturer (> 3 veckor). Detta protokoll Detaljer hur man kultur kortikala och Hippocampus murina nervceller inom dessa marker. Skapandet av lösliga mikromiljö och hur retrograd etikett nervceller, axotomy, och utföra immuncytokemi diskuterades också. Ännu viktigare, dessa marker är kompatibla med högupplösta, fluorescens och levande imaging.
Plast multicompartment marker ger många av samma funktioner som de PDMS-baserade uppdelade enheterna, men har fördelar, nackdelar och vissa utmärkande dragen. Tabell 1 ger en funktionsjämförelse av både plast chip och PDMS-baserade enheter. Först och främst är marker förmonterade och gjort permanent hydrofil, vilket underlättar vätning, vilket gör dem lättare att använda. Plasten är inte gas permeabla, till skillnad från PDMS, så om bubblor bildar oväntat inom kanalerna, de lätt undgår inte och måste tas bort. En före beläggning lösning innehållande främst etanol och några andra egenutvecklade agenter eliminerar bubbla bildandet.
Bor avbildning av projektioner följande transduktion av fluorescerande proteiner utfördes inom marker (figur 4) och det var inga detekterbara autofluorescens av plast. En varning är att nedsänkning oljor används med chip för höga numeriska bländaröppningen mål måste vara silikonolja baserat och inte mineralolja baserat. Mineralolja kan orsaka en biverkning med den cyklisk olefin copolymer. För brightfield imaging, det är viktigt att notera att microgrooves i kretsen är avrundade ändar och det finns en gradvis nedtrappning av z-riktningen av de viktigaste kanalerna gentemot microgroove barriären orsakar vissa ljusbrytning i vardera änden av den microgrooves under brightfield imaging (figur 3). Eftersom chipet är förmonterade, antikropp genomträngningen in i micron stora microgrooves kan vara ojämn (som med permanent bundna PDMS-baserade enheter); kvantitativ analys efter immunfärgning bör således utföras i kanaler/fack. Immunfärgning av neuronala prognoser inom microgrooves kan förbättras genom att skapa en volymskillnad mellan facken att underlätta flödet av antikroppar och fluorophores in microgrooves.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tekniska eller redaktionella stöd från Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) och Brad Taylor (Xona). Författarna erkänner stöd från Xona Microfluidics, LLC och National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Imaging stöddes delvis av de Confocal och Multiphoton Imaging Core Facility av NINDS Center Grant P30 NS045892 och NICHD Center Grant (U54 HD079124). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |