Denne protokol beskriver brugen af plastik chips til kultur og inddeler primære murine neuroner. Disse chips er hovedmeningen, brugervenlig og kompatibel med høj opløsning, lever, og fluorescens billeddannelse. Denne protokol beskriver, hvordan plade rotte hippocampus neuroner i disse chips og udføre fluidic isolering, axotomy og immunfarvning.
Microfabricated metoder til at inddeler neuroner er blevet afgørende værktøjer for mange neuroforskere. Denne protokol beskriver brugen af et kommercielt tilgængelige formonteret plast chip til compartmentalizing kulturperler primære rotte hippocampus neuroner. Disse plastik chips, indeholdt i fodaftryk af et standard objektglas, er forenelig med høj opløsning, lever, og fluorescens billeddannelse. Denne protokol demonstrerer, hvordan retrograd etiket neuroner via isolerede axoner ved hjælp af en modificeret rabiesvirus kodning en fluorescerende proteiner, oprette isolerede microenvironments i et rum og udføre axotomy og immuncytokemi på chip. Neuroner er kulturperler > 3 uger inden for de plastik chips, illustrerer foreneligheden af disse chips for langsigtet neuronal kulturer.
Traditionelle neuron kultur metoder resulterer i tilfældige udvækst af axoner og dendrites, som forhindrer studiet af neuroner i deres enestående polariserede morfologi. Microfabricated multicompartment enheder er blevet veletableret og godt brugt forskningsværktøjer til neuroforskere i de sidste 10-15 år (udvalgte high-profil publikationer er der refereres til1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). disse enheder inddeler neuroner og levere en metode for at fysisk og kemisk manipulere subcellulært regioner af neuroner, herunder somata, dendritter, axoner og synapser18,19. De giver også flere eksperimentelle paradigmer, som ikke er muligt ved hjælp af tilfældige kulturer, herunder studier af cytoskeletale transport, cytoskeletale proteinsyntesen, skade eller regenerering af axon, og axon til soma signalering. Den grundlæggende konfiguration af 2-rum består af to parallelle mikrofluid kanaler adskilt af en række mindre vinkelret på microgrooves. Primære eller stamcelle-afledt neuroner er belagt i en af mikrofluid kanalerne, bosætte sig og vedhæfte til bunden overfladen af enheden og udvide neurites i løbet af dage. Mange vækst kegler finder vej til microgrooves, som er små nok, at de forhindrer celle organer fra indtastning. Fordi vækst kegler er fysisk begrænset og ikke kan dreje rundt inden for microgrooves, vokser de lige ind i det tilstødende rum (cytoskeletale rum) hvor de er isoleret.
Historisk set har er disse enheder har været støbt ved hjælp af poly(dimethylsiloxane) (PDMS) fra en photolithographically mønstrede master mold og enten lavet in-house i efterforskernes laboratorier eller købt kommercielt. En af de vigtigste ulemper ved hjælp af PDMS er dens hydrophobicity20. PDMS kan gøres hydrofile midlertidigt, men derefter bliver hurtigt hydrofobe inden for timer i en ikke-vandige miljø20. På grund af dette, skal enhederne knyttes til et glas coverslip eller andre passende underlag på tidspunktet for brug. Formonterede plast multicompartment chips er nu kommercielt tilgængelige (f.eks.XonaChips) i sprøjtestøbte plast. Disse chips er lavet permanent hydrofile, forenkle enhed fugtning og tillader før samling af chip med en tynd film af cykliske olefin copolymer (COC) omslutter mikrofluid kanalerne på bunden. Disse chips er fremstillet i en optisk gennemsigtig plast egnet til høj opløsning fluorescens billeddannelse.
Formålet med denne protokol er at demonstrere brugen af formonterede plast mikrofluid chips til flere eksperimentelle paradigmer udføres ved hjælp af murine hippocampus eller kortikale neuroner. Denne protokol beskriver, hvordan retrograd etiket neuroner ved hjælp af en modificeret rabiesvirus i chippen. Axotomy for undersøgelser af axon skade og regenerering er også beskrevet. Endelig viser denne protokol sådan udføre fluorescens immunfarvning med enheden.
Plast multicompartment chips giver en nem-at-bruge mulighed for compartmentalizing neuroner, give langsigtet neuronal kulturer (> 3 uger). Denne protokol detaljer om, hvordan kultur kortikale og hippocampus murine neuroner i disse chips. Oprettelsen af opløselige microenvironments og hvordan retrograd etiket neuroner, udføre axotomy og udføre immuncytokemi blev også drøftet. Vigtigere, disse chips er kompatibel med høj opløsning, fluorescens og levende billedbehandling.
Plast multicompartment chips giver mange af de samme funktioner som de PDMS-baserede opdelte enheder, men har fordele, ulemper og nogle kendetegn. Tabel 1 indeholder en funktion sammenligning af både plast chip og PDMS-baserede enheder. Først og fremmest chips er pre samlet og gjort permanent hydrofile, som letter befugtning, hvilket gør dem nemmere at bruge. Plasten er ikke gas-gennemtrængelige, i modsætning til PDMS, så hvis bobler udgør uventet i kanalerne, de ikke let slippe og skal fjernes. En pre belægning løsning indeholdende hovedsagelig ethanol og nogle andre proprietære agenter eliminerer boble dannelse.
Live imaging af fremskrivninger følgende transduktion af fluorescerende proteiner blev udført inden for chips (figur 4) og der var ingen påviselig autofluorescence af plast. En advarsel er, at fordybelse olier anvendes med chip til høj numerisk blænde mål skal være silikone olie baseret, og ikke mineralsk olie baseret. Mineralsk olie kan forårsage en negativ reaktion med cyklisk olefin copolymer. For brightfield billeddannelse, er det vigtigt at bemærke, at microgrooves i chippen er afrundet i enderne, og der er en gradvis smallere i z-retning af de vigtigste kanaler mod den microgroove barriere forårsager nogle lys brydning i begge ender af den microgrooves under brightfield imaging (figur 3). Fordi chippen er pre-samlet, antistof indtrængen i den micron mellemstore microgrooves kan være ujævn (som med permanent agglomererede PDMS-baserede enheder); kvantitativ analyse efter immunfarvning skal således udføres i kanaler/rum. Immunfarvning af neuronal fremskrivninger i microgrooves kan forbedres ved at oprette en diskenhed forskellen mellem rum til støtte for strømmen af antistoffer og fluorophores i microgrooves.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender tekniske eller redaktionelle bistand fra Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) og Brad Taylor (Xona). Forfatterne anerkender støtte fra Xona Microfluidics, LLC og National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Imaging blev delvist støttet af Confocal og Multiphoton Imaging Core facilitet af NINDS Center Grant P30 NS045892 og NICHD Center Grant (U54 HD079124). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |