이 프로토콜 문화 분류 기본 murine 뉴런을 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 이 칩은 소, 사용자 친화적인, 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜에서는 이러한 칩 내 쥐 hippocampal 신경 격판덮개 유체 절연, axotomy 및 immunostaining을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
﹙ 메서드 뉴런 분류를 많은 신경 위한 필수 되고있다. 이 프로토콜에서는 교양된 기본 쥐 hippocampal 신경 compartmentalizing 상용 조립된 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 표준 현미경 슬라이드의 공간 내에 포함 된 이러한 플라스틱 칩은 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜 레이블 뉴런 형광 단백질을 인코딩 수정 된 광견병 바이러스를 사용 하 여 격리 된 축 삭을 통해 역행, 한 구획 내에서 고립 된 microenvironments를 만들고 axotomy 및 immunocytochemistry을 수행 하는 방법을 보여 내장. 신경에 대 한 교양 > 장기 신경 문화에 대 한 이러한 칩의 호환성을 보여주는 플라스틱 칩 내에서 3 주.
전통적인 신경 문화 접근의 축 삭과 dendrites, 그들의 독특한 편광된 형태학에 있는 신경 세포의 연구를 방지 하는 임의의 파생물에 결과. ﹙ multicompartment 장치 되 잘 설립 하 고 잘 사용 연구 도구 신경에 대 한 마지막 10-15 년 (선택 된 높은-프로필 간행물은 참조1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17).이 소자는 뉴런을 분류 하 고 물리적 및 화학적 신경 somata, 모 수석, 축 삭, 및 시 냅 스18,19를 포함 하 여의 subcellular 영역을 조작 하는 방법을 제공. 그들은 또한 임의의 culture, axonal 수송, axonal 단백질 합성, 축 삭 상해/재생, 및 축 삭-소마 신호의 연구를 포함 하 여 사용 하 여 가능 하지 않은 여러 실험 패러다임을 제공 합니다. 작은 수직 microgrooves의 시리즈에 의해 구분 된 두 개의 병렬 미세 채널 기본 2 구획 구성에 의하여 이루어져 있다. 미세 채널 중 하나에 기본 또는 줄기 세포 유래 신경 세포는 도금, 정착 및 장치의 아래 표면에 연결 그리고 neurites 일의 과정을 통해 확장. 많은 성장 콘 충분히 작은 그들은 입력에서 셀 시체를 방지 하는 microgrooves에 그들의 방법을 찾아. 성장 콘 물리적으로 제한 하 고는 microgrooves 이내 돌아서 수 없습니다 때문에, 그들은 바로 그들이 고립 된다 인접 한 구획 (axonal 구획)에 성장.
역사적으로,이 장치 poly(dimethylsiloxane) (PDMS)를 사용 하 여 photolithographically 패턴된 마스터 금형에서 성형 하 고는 중 사내 조사 실험실에서 만든 또는 상업적으로 구입. PDMS를 사용 하 여의 주요 단점 중 하나는 그것의 hydrophobicity20입니다. PDMS 만들어질 수 있다 친수성 일시적으로, 하지만 그때 신속 하 게 된다 소수 성 비 수성 환경20시간. 이 때문에, 장치 사용 시 유리 coverslip 또는 다른 적합 한 기판에 첨부 합니다. 조립된 플라스틱 multicompartment 칩은 사출 성형 플라스틱에서 지금 상업적으로 사용 가능한 (예를 들어, XonaChips). 이 칩 장치 일로 고 바닥에 미세 채널을 포함 하는 주기적 올레 핀 코 폴리머 (COC)의 얇은 필름 칩의 선 조립 단순화, 영구적으로 친수성 만들어집니다. 이 칩은 고해상도 형광 영상에 적합 한 광학 투명 플라스틱에 조작.
이 프로토콜의 목적은 murine hippocampal 또는 대뇌 피 질의 신경 세포를 사용 하 여 수행 하는 여러 실험 패러다임에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용 방법을 설명 하는 것입니다. 이 프로토콜 레이블 뉴런 칩 내에서 수정 된 광견병 바이러스를 사용 하 여 역행 하는 방법을 설명 합니다. Axotomy 축 삭 상해 및 재생의 연구에 대 한 설명도 합니다. 마지막으로,이 프로토콜에는 장치와 함께 형광 immunostaining를 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
Compartmentalizing 신경, 장기 신경 문화를 제공 하는 사용 하기 쉬운 옵션을 제공 하는 플라스틱 multicompartment 칩 (> 3 주). 이 프로토콜에는 문화 외피 그리고 hippocampal murine 뉴런이 칩 내에서 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 용 해 microenvironments의 생성 및 레이블 뉴런을 역행 하 고, axotomy, 수행 하 고 immunocytochemistry를 수행 하는 방법 또한 토론 되었다. 중요 한 것은, 이러한 칩은 호환 고해상도, 형광, 그리고 라이브 영상.
플라스틱 multicompartment 칩 많은 PDMS 기반 들 에게만 장치, 동일한 기능을 제공 하지만 장점, 단점, 그리고 몇 가지 특징. 표 1 의 플라스틱 칩 및 PDMS 기반 장치 기능 비교를 제공합니다. 맨먼저, 칩은 미리 조립 및 영구적으로 친수성 만든 일로, 그들을 사용 하 여 쉽게 만들기를 용이 하 게 있다. 플라스틱 이므로 하지 가스 투과성, PDMS, 달리 거품 예기치 않게 채널 내에서 형성, 그들은 쉽게 탈출 하지 않는 및 제거 해야 합니다. 주로 에탄올 및 기타 독점 에이전트 포함 된 사전 코팅 솔루션 거품 형성을 제거 합니다.
형광 단백질의 다음 변환 칩 (그림 4) 내에서 수행 하는 계획의 영상 라이브 그리고 플라스틱의 아무 감지 autofluorescence 했다. 경고는 실리콘 오일을 기반으로, 그리고 하지 미네랄 오일 기반 침수 오일을 높은 수 가늠 구멍 목표에 대 한 칩 함께 사용 되어야 합니다. 미네랄 오일 순환 올레 핀 공중 합체와는 부작용을 일으킬 수 있습니다. 대물 영상 끝에서 반올림 되는 칩에 microgrooves의 양쪽 끝에 몇 가지 빛 굴절을 일으키는 microgroove 장벽으로 메인 채널의 z 방향으로의 점진적 나아지고 있다 메모 하는 것이 중요 하다는 (그림 3) 이미징 명시 하는 동안 microgrooves. 미크론 크기의 microgrooves에 항 체 침투의도 수는 칩 조립 때문에 (영구적으로 보 세 PDMS 기반 장치 것과 같이); 따라서, immunostaining 다음 정량 분석 채널/구획에서 수행 되어야 합니다. microgrooves 내의 신경 예측의 Immunostaining는 microgrooves에 항 체의 흐름을 돕기 위해 구획 및 fluorophores 간의 볼륨 차이 생성 하 여 개선할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Smita Paranjape (UNC-채 플 힐), 조이스 Ciechanowski (Xona)와 브래드 테일러 (Xona) 테일러 윌 트 (Xona), 기술 또는 사설 도움을 인정합니다. 저자 인정 Xona 마이크로, LLC 및 국립 연구소의 정신 건강 (R42 MH097377)에서 지원 합니다. 이미징은 Confocal와 다 이미징 핵심 시설의 NINDS 센터 그랜트 P30 NS045892 NICHD 센터 그랜트 (U54 HD079124)에 의해 부분적으로 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |