Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Plastik-Chips zu Kultur und primäre murine Neuronen in Schubladen. Diese Chips sind vormontiert, benutzerfreundlich und kompatibel mit hoher Auflösung, live und Fluoreszenz-Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt die Platte Ratte hippocampal Neuronen innerhalb dieser Chips und strömungstechnische Isolation, Axotomie und Immunostaining durchführen.
Microfabricated Methoden, um Neuronen in Schubladen sind unverzichtbare Werkzeuge für viele Neurowissenschaftler geworden. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines handelsüblichen vormontierten Kunststoff-Chips für Abschottung kultivierten primäre Ratte hippocampal Neuronen. Diese Plastik-Chips enthalten innerhalb der Ausleuchtzone der einen standard Objektträger sind kompatibel mit hoher Auflösung, live und Fluoreszenz-Bildgebung. Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie retrograde Label Neuronen über isolierte Axone mit einer modifizierten Tollwutvirus Codierung eines fluoreszierenden Proteins, isolierte Mikroumgebungen innerhalb einer Abteilung zu erstellen und durchführen Axotomie und Immunocytochemistry auf dem Chip. Neuronen sind für kultiviert > 3 Wochen innerhalb der Plastik-Chips, illustrieren die Vereinbarkeit dieser Chips für langfristige neuronalen Kulturen.
Traditionelle Neuron Kultur nähert sich Ergebnis in zufälligen Auswuchs der Axone und Dendriten, die das Studium der Neuronen in ihrer einzigartigen polarisierte Morphologie zu verhindern. Microfabricated multicompartment Geräte sind etablierte und gut Recherche-Tools für Neurowissenschaftler in den letzten 10-15 Jahren geworden (ausgewählte hochrangige Publikationen sind referenzierten1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). diese Geräte Neuronen in Schubladen und bieten eine Methode, um physikalisch und chemisch subzelluläre Regionen von Neuronen, einschließlich Somata, Dendriten und Axone Synapsen18,19manipulieren. Sie bieten auch mehrere experimentelle Paradigmen, die nicht mit zufälligen Kulturen, einschließlich Studien der axonalen Transport, axonalen Proteinsynthese Axon Verletzungen/Regeneration und Axon-Soma-Signalisierung möglich sind. Die Grundkonfiguration des 2-Kammer besteht aus zwei parallelen mikrofluidische Kanäle getrennt durch eine Reihe von kleineren senkrecht Mikrospuren. Primär- oder Stammzellen abgeleitet Neuronen sind in einer der mikrofluidische Kanäle beschichtet, begleichen und befestigen Sie an der Unterseite des Gerätes und Neuriten im Laufe der Tage zu verlängern. Viele Wachstum Zapfen finden ihren Weg in die Mikrospuren, die klein genug sind, dass sie Zellkörper eindringen verhindern. Denn Wachstum Zapfen sind körperlich eingeschränkt und nicht in der Lage, sich innerhalb der Mikrospuren umzudrehen, wachsen sie direkt in das angrenzende Fach (axonale Fach) wo sie isoliert sind.
Historisch, sind diese Geräte haben mit poly(dimethylsiloxane) (PDMS) aus einem fotolithografisch gemusterten master-Form geformt worden und entweder hausgemacht in Ermittler Laboratorien oder kommerziell erworben. Einer der wichtigsten Nachteile der Verwendung von PDMS ist seine Hydrophobie20. PDMS kann vorübergehend hydrophil gemacht werden, aber dann wird schnell hydrophobe innerhalb von Stunden in einem nicht-wässrigen Umgebung20. Aus diesem Grund müssen die Geräte ein Glas Deckglas oder anderen geeigneten Substrat zum Zeitpunkt der Verwendung beizufügen. Vormontierte multicompartment Plastikchips sind jetzt im Handel erhältlich (z.B.XonaChips) in spritzgegossenen Kunststoff. Diese Chips sind permanent hydrophil, Vereinfachung Gerät Benetzung und damit die Vormontage des Chips mit einem dünnen Film von zyklischen Olefin-Copolymer (COC) umschließt die mikrofluidische Kanäle auf der Unterseite gemacht. Diese Chips werden in einem optisch transparenten Kunststoff geeignet für hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung hergestellt.
Dieses Protokoll soll die Verwendung der vormontierten Kunststoff mikrofluidischen Chips für mehrere experimentelle Paradigmen mit murinen hippocampal oder kortikale Neuronen durchgeführt zu demonstrieren. Dieses Protokoll beschreibt die Bezeichnung Neuronen mit einer modifizierten Tollwutvirus im Chip retrograde. Axotomie für Studien der Axon Schädigung und Regeneration werden ebenfalls beschrieben. Zu guter Letzt zeigt dieses Protokoll wie Fluoreszenz Immunostaining mit dem Gerät durchführen.
Multicompartment Plastikchips bieten eine einfach zu bedienende Option für Abschottung Neuronen, Bereitstellung von langfristigen neuronalen Kulturen (> 3 Wochen). Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie die kortikale und hippocampale murine Neuronen innerhalb dieser Chips Kultur. Die Schaffung von löslichen Mikroumgebungen und Gewusst wie: retrograde Label Neuronen, Axotomie, und durchzuführen Immunocytochemistry wurden ebenfalls erörtert. Wichtig ist, diese Chips sind kompatibel mit hoher Auflösung, Fluoreszenz und live Imaging.
Multicompartment Plastikchips bieten viele der gleichen Funktionen wie die PDMS-basierte unterteilte Geräte jedoch haben Vorteile, Nachteile und einige Unterscheidungsmerkmale. Tabelle 1 bietet einen Featurevergleich der Kunststoff-Chip und PDMS-basierten Geräten. Zuallererst sind die Chips vormontiert und machte permanent hydrophil, was erleichtert Benetzung, so dass sie einfacher zu bedienen. Der Kunststoff ist nicht gasdurchlässig, im Gegensatz zu PDMS, so bilden sich Bläschen unerwartet in den Kanälen, sie nicht ohne weiteres entkommen können und entfernt werden müssen. Ein Pre Beschichtungslösung, enthält hauptsächlich Ethanol und einige andere proprietären Agenten verhindert Blasenbildung.
Live-Darstellung der Projektionen, die folgenden Transduktion von fluoreszierenden Proteinen innerhalb der Chips (Abbildung 4) ausgeführt wurde und gab es keine nachweisbaren Autofluoreszenz des Kunststoffs. Ein Nachteil ist, dass Immersion Öle mit dem Chip für hoher numerischer Apertur Ziele Silikonöl basieren und nicht Mineralöl basiert sein müssen. Mineralöl kann dazu führen, dass eine negative Reaktion mit der zyklischen Olefin-Copolymer. Für Hellfeld Bildgebung, ist es wichtig zu beachten, dass Mikrospuren im Chip an den Enden abgerundet sind und es gibt eine allmähliche Verjüngung der Z-Richtung von der Hauptkanäle in Richtung die Mikrorille Barriere verursacht einige Lichtbrechung an beiden Enden der Mikrospuren im Hellfeld imaging (Abbildung 3). Da der Chip bereits vormontiert ist, Antikörper Eindringen in die Mikron mittelständische Mikrospuren uneben sein kann (wie bei dauerhaft verklebt PDMS-basierte Geräte); Quantitative Analyse nach Immunostaining sollte somit in den Kanälen/Fächern durchgeführt werden. Immunostaining neuronalen Projektionen innerhalb der Mikrospuren kann verbessert werden, indem man eine Volumendifferenz zwischen den Fächern zugunsten den Fluss von Antikörpern und Fluorophore in der Mikrospuren.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erkennen technischen oder redaktionellen Betreuung von Taylor willst (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) und Brad Taylor (Xona). Die Autoren erkennen Unterstützung Xona Microfluidics, LLC und dem National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Bildgebung wurde teilweise durch die Confocal und Multiphoton Imaging Core Facility der NINDS Center Grant P30 NS045892 und NICHD Center Grant (U54 HD079124) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |