Dit protocol beschrijft het gebruik van plastic fiches om cultuur en grendelen primaire lymfkliertest neuronen. Deze chips zijn voorgemonteerd, gebruiksvriendelijke en compatibel met hoge resolutie, levend, en fluorescentie beeldvorming. Dit protocol wordt beschreven hoe plaat rat hippocampal neuronen binnen deze chips en uitvoeren van fluidic isolatie, axotomy en immunokleuring.
Microfabricated methoden te grendelen neuronen zijn essentiële instrumenten geworden voor vele neurowetenschappers. Dit protocol beschrijft het gebruik van een commercieel beschikbare vooraf geassembleerde kunststof chip voor compartimentering gekweekte primaire rat hippocampal neuronen. Deze plastic chips, deel uitmaakt van de voetafdruk van een standaard microscoopglaasje, compatibel zijn met hoge resolutie, levend, en fluorescentie beeldvorming. Dit protocol laat zien hoe retrograde label neuronen via geïsoleerde axonen met behulp van een gemodificeerde rabiësvirus codering een fluorescente proteïne, geïsoleerde microenvironments binnen één compartiment maken en uitvoeren van axotomy en immunocytochemie op de chip. Neuronen worden gekweekt voor > 3 weken binnen de plastic chips, ter illustratie van de verenigbaarheid van deze chips voor lange termijn neuronale culturen.
Traditionele neuron cultuur benaderingen leiden tot willekeurige uitgroei van axonen en dendrites, waardoor de studie van neuronen in hun unieke gepolariseerde morfologie. Microfabricated multicompartment apparaten zijn gevestigde en goed gebruikt onderzoekstools voor neurowetenschappers geworden in de afgelopen 10-15 jaar (geselecteerde spraakmakende publicaties zijn waarnaar wordt verwezen1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). deze apparaten gecompartimenteerd neuronen en bieden een methode om te fysisch en chemisch manipuleren subcellular regio’s van neuronen, met inbegrip van waarin, dendrites, axonen en synapsen18,19. Zij bieden ook meerdere experimentele paradigma’s die niet mogelijk met behulp van willekeurige culturen, met inbegrip van studies van axonale vervoer, axonale eiwitsynthese axon blessure/regeneratie en axon-naar-soma signalering. De basisconfiguratie van de 2-vaks bestaat uit twee parallelle microfluidic kanalen gescheiden door een aantal kleinere loodrecht microgrooves. Primair of afgeleid van stamcellen neuronen zijn verguld in één van de microfluidic kanalen, regelen en hechten aan de onderkant van het apparaat en neurites in de loop van dagen uitbreiden. Veel groei kegels vinden hun weg naar de microgrooves, die klein genoeg zijn dat ze voorkomen cel organen invoeren dat. Omdat de groei kegels zijn fysiek beperkt en niet in staat om te draaien binnen de microgrooves, groeien ze rechtstreeks in het aangrenzende compartiment (axonale compartiment) waar ze geïsoleerd zijn.
Historisch, zijn deze apparaten hebben is gevormd met behulp van poly(dimethylsiloxane) (PDMS) van een photolithographically patroon meester mal en gemaakt van in-house in onderzoekers laboratoria of commercieel gekocht. Een van de belangrijkste nadelen van het gebruik van PDMS is haar hydrophobicity20. PDMS tijdelijk hydrofiele kan plaatsvinden, maar dan snel wordt hydrofobe binnen uur in een niet-waterig milieu20. Vanwege dit, moeten de apparaten worden aangesloten op een glas dekglaasje aan of andere geschikt substraat op het moment van gebruik. Vooraf geassembleerde kunststof multicompartment chips zijn nu commercieel beschikbaar (bijvoorbeeldXonaChips) in spuitgegoten kunststof. Deze chips zijn gemaakt permanent hydrofiele, vereenvoudiging van de apparaat bevochtiging en waardoor de pre-assemblage van de chip met een dunne film van cyclische olefine copolymeer (COC) bijvoeging van de microfluidic kanalen op de bodem. Deze chips zijn vervaardigd in een optisch doorzichtig plastic geschikt voor hoge-resolutie fluorescentie imaging.
Het doel van dit protocol is het gebruik van de chips van vooraf geassembleerde kunststof microfluidic voor meerdere experimentele paradigma’s uitgevoerd met behulp van lymfkliertest hippocampal of corticale neuronen te demonstreren. Dit protocol wordt beschreven hoe retrograde label neuronen met behulp van een gemodificeerde rabiësvirus binnen de chip. Axotomy voor studies van axon blessure en regeneratie worden ook beschreven. Tot slot, dit protocol laat zien hoe fluorescentie immunokleuring uitvoeren met het apparaat.
Kunststof multicompartment chips hebben een easy-to-use-optie voor compartimentering van neuronen, die op lange termijn neuronale culturen (> 3 weken). Dit protocol detailleert hoe cultuur corticale en hippocampal lymfkliertest neuronen binnen deze chips. De oprichting van oplosbare microenvironments en hoe retrograde label neuronen, het uitvoeren van axotomy, en het uitvoeren van immunocytochemie werden ook besproken. Belangrijk is dat deze chips zijn compatibel met hoge resolutie, fluorescentie, en levende imaging.
Kunststof multicompartment chips bieden veel van de dezelfde functies als de PDMS gebaseerde gecompartimenteerd apparaten, maar hebben voordelen, nadelen en enkele onderscheidende kenmerken. Tabel 1 bevat een functievergelijking van zowel plastic chip en PDMS-gebaseerde apparaten. Eerst en vooral, zijn de chips voorgemonteerd en permanent hydrofiele, die vergemakkelijkt bevochtiging, waardoor ze makkelijker te gebruiken. Het plastic is niet gas permeabele, in tegenstelling tot PDMS, dus als bubbels onverwacht binnen de kanalen vormen, ze niet gemakkelijk ontsnappen doen en moeten worden verwijderd. Een oplossing van de pre coating met voornamelijk ethanol en sommige andere merkgebonden agentia elimineert luchtbel vorming.
Live beeldvorming van projecties volgende transductie van fluorescente proteïnen werd uitgevoerd binnen de chips (Figuur 4) en er was geen detecteerbare autofluorescence van de plastic. Een valkuil is dat onderdompeling oliën die worden gebruikt met de chip voor hoge numerieke diafragma doelstellingen siliconenolie gebaseerde, en geen minerale olie gebaseerd moeten zijn. Minerale olie kan leiden tot een negatieve reactie met de cyclische olefine copolymeer. Voor helderveld beeldvorming, is het belangrijk op te merken dat de microgrooves in de chip aan de uiteinden zijn afgerond en er is een geleidelijke stiftschroeven van de z-richting van de belangrijkste kanalen naar de barrière van de microgroove veroorzaken sommige lichtbreking aan elk uiteinde van de microgrooves tijdens helderveld imaging (Figuur 3). Omdat de chip voorgemonteerd is, antilichaam penetratie in de micron en middelgrote microgrooves mogelijk ongelijke (zoals bij permanent gekleefde PDMS-gebaseerde apparaten); kwantitatieve analyse na immunokleuring moet dus worden uitgevoerd in de kanalen/compartimenten. Immunokleuring van neuronale projecties binnen de microgrooves kan worden verbeterd door het creëren van een volumeverschil tussen de compartimenten om de stroom van antilichamen en fluorophores in de microgrooves.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen technische of redactionele hulp van Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) en Brad Taylor (Xona). De auteurs erkennen steun van Xona Microfluidics, LLC en het National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Imaging werd gedeeltelijk ondersteund door de Confocal en Multiphoton Imaging Core faciliteit van NINDS Center Grant P30 NS045892 NICHD Center Grant (U54 HD079124). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |