Este protocolo descreve o uso de chips de plástico para cultura e compartimentar os neurônios primários de murino. Esses chips são preassembled, fácil de usar e compatível com alta resolução, ao vivo e a imagem latente de fluorescência. Este protocolo descreve como neurônios hippocampal do rato dentro estes chips da placa e executar imunocoloração, axotomy e isolamento fluídico.
Microfabricated métodos para compartimentar os neurônios tornaram-se ferramentas essenciais para muitos neurocientistas. Este protocolo descreve o uso de um chip de plástico pré-montados comercialmente disponível para compartimentar neurônios hippocampal culta rato primário. Esses chips de plástico, contido a pegada de um padrão de microscópio, são compatíveI com alta resolução, ao vivo e a imagem latente de fluorescência. Este protocolo demonstra como retrograde neurônios rótulo através de axônios isolados usando um vírus modificado da raiva codificação de uma proteína fluorescente, criar o microambiente isolado dentro de um compartimento e executar axotomy e imunocitoquímica em-microplaqueta. Os neurônios são cultivados por > 3 semanas dentro o chips de plástico, ilustrando a compatibilidade destes chips para culturas neuronais a longo prazo.
Cultura tradicional neurônio abordagens resultam em consequência aleatória de axônios e dendritos, que impedem o estudo de neurônios em sua morfologia original e polarizada. Microfabricated multicompartment dispositivos se tornaram ferramentas de pesquisa bem estabelecido e bem utilizada para neurocientistas nos últimos 10-15 anos (publicações de alto perfil selecionadas são referenciados1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). estes dispositivos compartimentar os neurônios e fornecem um método para fisicamente e quimicamente manipular regiões subcellular de neurônios, incluindo somata, dendritos, axônios e sinapses18,19. Eles também fornecem vários paradigmas experimentais que não são possíveis usando culturas aleatórias, incluindo estudos de transporte axonal, síntese de proteínas axonal, lesão do axônio/regeneração e axônio-para-soma de sinalização. A configuração básica do compartimento 2 consiste de dois canais microfluídicos paralelo, separados por uma série de pequenos microgrooves perpendicular. Primários ou células-tronco derivadas de neurônios são banhados em um dos canais microfluídicos, resolver e anexar à superfície inferior do dispositivo e estender neuritos ao longo dos dias. Muitos cones de crescimento encontram seu caminho para o microgrooves, que são pequenos o suficiente para que eles impedem corpos celulares entrando. Cones de crescimento são fisicamente restrito e incapaz de girar ao redor dentro do microgrooves, crescem direto no compartimento adjacente (compartimento axonal) onde estão isolados.
Historicamente, estes dispositivos têm sido moldados usando poly(dimethylsiloxane) (PDMS) de um molde mestre photolithographically padronizado e são feitos internamente em laboratórios dos inspectores ou adquiridos comercialmente. Uma das principais desvantagens do uso de PDMS é sua hidrofobicidade20. PDMS pode ser feitas hidrofílicos temporariamente, mas rapidamente torna-se então hidrofóbicos dentro de horas em um ambiente não-aquosa20. Por causa disso, os dispositivos devem ser anexados a uma lamela de vidro ou outros substratos adequados no momento da utilização. Chips de multicompartment plástico pré-montados estão agora comercialmente disponíveis (por exemplo, XonaChips) em plástico moldado por injeção. Esses chips são feitos permanentemente hidrofílicos, simplificando a umectação do dispositivo e permitindo a pré-montagem do chip com uma película fina de copolímero de olefina cíclica (COC) encerram os canais microfluídicos na parte inferior. Esses chips são fabricados em um plástico opticamente transparente apropriado para a imagem latente de fluorescência de alta resolução.
O propósito do presente protocolo é demonstrar o uso dos chips microfluídicos plástico pré-montados para múltiplos paradigmas experimentais realizadas usando murino neurônios hippocampal ou corticais. Este protocolo descreve como retrograde neurônios rótulo usando um vírus de raiva modificados dentro do chip. Axotomy de estudos de lesão do axônio e regeneração também são descritos. Por último, este protocolo mostra como executar imunocoloração de fluorescência com o dispositivo.
Multicompartment de chips de plástico fornecem uma opção fácil de usar para compartimentar os neurônios, fornecendo culturas neuronal a longo prazo (> 3 semanas). Este protocolo detalha como cultura corticais e hippocampal murino neurônios dentro dessas fichas. A criação do microambiente solúvel e como retrograde neurônios de rótulo, realizar axotomy e executar imunocitoquímica também foram discutidos. Importante, esses chips são compatíveis com alta resolução, fluorescência e imagem ao vivo.
Multicompartment de chips de plástico fornecem muitas das mesmas funções que os dispositivos baseados em PDMS compartimentada, mas têm vantagens, desvantagens e algumas características distintivas. Tabela 1 fornece uma comparação de recursos do chip de plástico e dispositivos baseados em PDMS. Primeiro e acima de tudo, os chips são pré-montados e feitos permanentemente hidrofílicos, que facilita a molhadela, tornando-os mais fáceis de usar. O plástico não é gás permeável, ao contrário de PDMS, portanto se inesperadamente bolhas se formam dentro dos canais, eles não escapam facilmente e devem ser removidos. Uma solução de pre-revestimento contendo principalmente etanol e alguns outros agentes proprietários elimina a formação de bolhas.
Viver a imagem latente de projeções seguinte transdução da proteínas fluorescentes realizou-se dentro os chips (Figura 4) e não havia nenhum detectável autofluorescência do plástico. Uma ressalva é que óleos de imersão usados com o chip para objectivos de abertura numérica elevada devem ser à base de óleo de silicone e não base de óleo mineral. Óleo mineral pode causar uma reação adversa com o copolímero de olefina cíclica. Para a imagem latente brightfield, é importante notar que o microgrooves no chip são arredondados nas extremidades e há um afilamento gradual do z-direção dos principais canais para a barreira de disco causando alguma luz refração em das extremidades do microgrooves durante brightfield imaging (Figura 3). Porque o chip é pré-montado, penetração de anticorpo para as micro-empresas microgrooves pode ser irregular (como com dispositivos baseados em PDMS permanentemente ligados); assim, análise quantitativa immunostaining a seguir deve ser realizada nos canais/compartimentos. Immunostaining de projeções neuronais dentro do microgrooves pode ser melhorada através da criação de uma diferença de volume entre os compartimentos para auxiliar o fluxo de anticorpos e fluorophores no microgrooves.
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem a assistência técnica ou editorial de Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) e Brad Taylor (Xona). Os autores reconhecem o apoio de Xona Microfluidics, LLC e o Instituto Nacional de Saúde Mental (R42 MH097377). Imagem latente foi parcialmente suportado pelo Confocal e Multiphoton Imaging Core Facility de NINDS Center Grant P30 NS045892 e FORMULADORES Center Grant (U54 HD079124). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |