Questo protocollo descrive l’uso di chip di plastica per cultura e compartimenti stagni di neuroni primari murini. Questi chip sono preassemblati, facile da usare e compatibile con alta risoluzione, dal vivo e l’imaging di fluorescenza. Questo protocollo descrive come piastra di neuroni ippocampali di ratto all’interno di questi chip ed eseguire immunostaining, assotomia e fluidico isolamento.
Metodi di microfabbricati a compartimenti stagni di neuroni sono diventati strumenti essenziali per molti neuroscienziati. Questo protocollo descrive l’uso di un chip di plastica pre-assemblato commercialmente disponibile per divisione in compartimenti neuroni hippocampal coltivati del ratto primario. Questi chip di plastica, contenuto all’interno l’impronta di un vetrino da microscopio standard, sono compatibili con alta risoluzione, live e l’imaging di fluorescenza. Questo protocollo viene illustrato come retrogrado neuroni etichetta tramite assoni isolati utilizzando un virus di rabbia modificate che codifica per una proteina fluorescente, creare microambienti isolati all’interno di uno scomparto ed eseguire assotomia e immunocitochimica su chip. I neuroni sono coltivati per > 3 settimane all’interno del chip di plastica, che illustra la compatibilità di questi chip per le culture di un neurone a lungo termine.
Cultura tradizionale neurone si avvicina risultato in conseguenza casuale degli assoni e dendriti, che impediscono lo studio dei neuroni nella loro specifica morfologia polarizzata. Multicomparto dispositivi microfabbricati sono diventati strumenti di ricerca ben definiti e ben utilizzato per i neuroscienziati negli ultimi 10-15 anni (pubblicazioni selezionate di alto profilo sono riferimento1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). questi dispositivi compartimenti stagni di neuroni e fornire un metodo per fisicamente e chimicamente manipolare regioni subcellulare dei neuroni, tra cui somata, dendriti e assoni sinapsi18,19. Forniscono anche più paradigmi sperimentali che non sono possibili utilizzando casuale culture, compresi gli studi del trasporto assonale, sintesi proteica assonale, lesioni/rigenerazione dell’assone e segnalazione di assone-a-soma. La configurazione di base 2-vano è costituito da due canali microfluidici parallele separate da una serie di più piccoli Microscanalature perpendicolare. Neuroni primari o derivati da cellule staminali sono placcati in uno dei canali microfluidici, stabilirsi e attaccare alla superficie inferiore del dispositivo ed estendere i neurites nel corso dei giorni. Molti coni di crescita trovano la loro strada in Microscanalature, che sono abbastanza piccoli che impediscono i corpi cellulari di entrare. Poiché i coni di crescita sono fisicamente limitato e in grado di girare intorno all’interno le Microscanalature, crescono direttamente nel vano adiacente (vano assonale) dove essi sono isolati.
Storicamente, questi dispositivi sono stati modellati utilizzando poly(dimethylsiloxane) (PDMS) da uno stampo master photolithographically fantasia e sono fatti in casa, nei laboratori degli investigatori o acquistati in commercio. Uno dei principali svantaggi dell’utilizzo di PDMS è sua idrofobicità20. PDMS può essere fatta idrofila temporaneamente, ma poi rapidamente diventa idrofobo entro ore in un ambiente non acquoso20. Per questo motivo, i dispositivi devono essere collegati a un coprioggetto in vetro o altro substrato adatto al momento dell’uso. Pre-assemblati chip di plastica vari compartimenti sono ora disponibili in commercio (ad esempio, XonaChips) in materiale plastico stampato ad iniezione. Questi chip sono realizzati permanentemente idrofilici, semplificando la bagnatura del dispositivo e che permette il pre-assemblaggio del chip con un sottile film di copolimero ciclico delle olefine (COC) che racchiude i canali microfluidici sul fondo. Questi chip sono fabbricati in una plastica otticamente trasparente adatto per l’imaging di fluorescenza ad alta risoluzione.
Lo scopo del presente protocollo è per illustrare l’utilizzo dei chip microfluidici plastica pre-assemblato per più paradigmi sperimentali eseguite utilizzando murini neuroni hippocampal o corticali. Questo protocollo descrive come retrogrado neuroni etichetta utilizzando un virus di rabbia modificate all’interno del chip. Sono descritte anche assotomia per gli studi di lesione assonale e la rigenerazione. Infine, questo protocollo viene illustrato come eseguire immunocolorazione fluorescenza con il dispositivo.
Chip di plastica multicomparto forniscono un’opzione facile da usare per la divisione in compartimenti neuroni, fornendo colture neuronali a lungo termine (> 3 settimane). Questo protocollo dettagli come cultura corticali e ippocampali murini neuroni all’interno di questi chip. La creazione di microambienti solubile e come retrogrado neuroni etichetta, eseguire assotomia ed eseguire immunocytochemistry inoltre sono stati discussi. D’importanza, sono compatibili con questi chip ad alta risoluzione, fluorescenza e creazione di immagini dal vivo.
Chip di plastica multicomparto forniscono molte delle stesse funzioni come i dispositivi basati su PDMS compartimenti stagni, ma hanno alcune caratteristiche distintive, vantaggi e svantaggi. La tabella 1 fornisce un confronto tra le funzionalità di dispositivi basati su PDMS e chip di plastica. Innanzitutto, i chip sono pre-assemblati e reso definitivamente idrofilici, che facilita il bagnante, rendendoli più facili da utilizzare. La plastica non è gas permeabile, a differenza di PDMS, così se le bolle si formano in modo imprevisto all’interno i canali, non sfuggono facilmente e deve essere rimosso. Una soluzione di pre-rivestimento contenente principalmente etanolo e alcuni altri agenti proprietarie Elimina la formazione di bolle.
Immagini di proiezioni seguenti trasduzione di proteine fluorescenti è stato eseguito entro i chip (Figura 4) dal vivo e non c’era nessun autofluorescence rilevabile della plastica. Un avvertimento è che gli oli di immersione utilizzati con il chip per obiettivi di apertura numerica elevata devono essere base di olio di silicone e non olio base minerale. Olio minerale può causare una reazione avversa con il copolimero ciclico delle olefine. Per l’imaging in campo chiaro, è importante notare che le Microscanalature nel chip sono arrotondati alle estremità e c’è un graduale assottigliamento della direzione z dei principali canali verso la barriera di microsolchi causando qualche rifrazione della luce alle due estremità della Microscanalature durante il campo chiaro imaging (Figura 3). Perché il chip è pre-assemblato, la penetrazione dell’anticorpo le Microscanalature micron imprese potrebbe essere irregolare (come con dispositivi basati su PDMS permanentemente legati); così, analisi quantitativa immunostaining di seguito deve essere eseguita nei canali/compartimenti. Immunostaining delle proiezioni neuronali all’interno le Microscanalature può essere migliorata mediante la creazione di una differenza di volume tra i compartimenti per aiutare il flusso degli anticorpi e fluorofori nelle Microscanalature.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono assistenza tecnica o editoriale da Taylor Wilt (xxxxx), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (xxxxx) e Brad Taylor (xxxxx). Gli autori riconoscono sostegno da Xona Microfluidics, LLC e il National Institute of Mental Health (R42 MH097377). La formazione immagine è stato parzialmente sostenuta dalla confocale e multifotonica Imaging Core Facility di NINDS Center Grant P30 NS045892 e NICHD Center Grant (U54 HD079124). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |