Ce protocole décrit l’utilisation de jetons en plastique de la culture et de compartimenter les neurones murins primaires. Ces puces sont prémonté, facile à utiliser et compatible avec haute résolution, en direct et l’imagerie de fluorescence. Ce protocole décrit comment plaque de neurones de l’hippocampe au sein de ces puces rat et exécuter immunostaining, axotomie et l’isolement fluidique.
Méthodes microfabriques à compartimenter les neurones sont devenus des outils essentiels pour de nombreux chercheurs en neurosciences. Ce protocole décrit l’utilisation d’une puce en plastique prémontée disponible dans le commerce pour compartimenter les neurones hippocampal cultivés primaires de rat. Ces jetons en plastique, contenus dans l’empreinte d’une lame de microscope ordinaire, sont compatibles avec la haute résolution, en direct et l’imagerie de fluorescence. Ce protocole montre comment rétrograde des neurones étiquette via les axones isolés à l’aide d’un virus de la rage mis à jour le codant pour une protéine fluorescente, créez des micro-environnements isolés dans un compartiment et exécutez axotomie et immunocytochimie sur puce. Les neurones sont cultivées pour > 3 semaines dans les jetons en plastique, illustrant la compatibilité de ces puces pour les cultures de neurones à long terme.
La culture traditionnelle neurone s’approche résultat dans l’excroissance aléatoire des axones et les dendrites, qui empêchent l’étude des neurones dans leur morphologie polarisée unique. Microfabriques compartiments périphériques sont devenus des outils de recherche bien établi et très utilisé pour les chercheurs en neurosciences dans les 10-15 dernières années (les publications de prestige sélectionnées sont référencé1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). ces dispositifs compartimenter les neurones et fournir une méthode pour manipuler physiquement et chimiquement les régions subcellulaires des neurones, dont les corps cellulaires, dendrites, axones et synapses18,19. Ils fournissent également plusieurs paradigmes expérimentaux qui ne sont pas possibles en utilisant des cultures au hasard, y compris les études de transport axonal, synthèse protéique axonale, blessure/régénération axonale et signalisation axon-à-soma. La configuration de base 2-compartiment se compose de deux canaux microfluidiques parallèles séparés par une série de petits micro-rainures perpendiculaire. Primaires ou de cellules souches dérivées de neurones sont plaqués dans l’un des canaux microfluidiques, de régler et fixer à la surface inférieure de l’appareil et étendre les neurites au cours des jours. De nombreux cônes de croissance trouver leur chemin dans les micro-rainures, qui sont assez petits pour qu’elles empêchent les corps cellulaires entrant. Parce que les cônes de croissance sont physiquement limité et impossible de faire demi-tour dans les micro-rainures, ils se développent directement dans le compartiment adjacent (compartiment axonal) où ils sont isolés.
Historiquement, ces dispositifs ont été moulés en utilisant poly(dimethylsiloxane) (PDMS) partir d’un moule de maître photolitographie modelé et sont faits maison dans les laboratoires des enquêteurs ou achetés dans le commerce. Parmi les principaux inconvénients de l’utilisation de PDMS est son hydrophobicité20. PDMS peut être faite hydrophile temporairement, mais ensuite rapidement devient hydrophobe quelques heures dans un milieu non aqueux20. Pour cette raison, les appareils doivent annexer à une lamelle de verre ou autre substrat adéquat au moment de l’utilisation. Pré-assemblés puces compartiments en plastique sont maintenant disponibles dans le commerce (par exemple, XonaChips) en plastique moulé par injection. Ces puces sont faits en permanence hydrophiles, simplifiant pipi au dispositif et permettant à l’Assemblée avant de la puce avec une fine pellicule de copolymère d’oléfine cyclique (COC) entourant les canaux microfluidiques sur le fond. Ces puces sont fabriqués dans un plastique optiquement transparent approprié pour l’imagerie de fluorescence à haute résolution.
Ce protocole vise à démontrer l’utilisation des puces microfluidiques plastique prémontées pour plusieurs paradigmes expérimentaux effectuée à l’aide des neurones hippocampal ou corticales murines. Ce protocole décrit comment rétrograde des neurones d’étiquette à l’aide d’un virus de la rage modifiés au sein de la puce. Axotomie pour l’étude des lésions axonales et la régénération sont également décrites. Enfin, ce protocole indique comment exécuter immunostaining fluorescence avec l’appareil.
Copeaux de compartiments en plastique offrent une option facile à utiliser pour compartimenter les neurones, fournissant des cultures de neurones à long terme (> 3 semaines). Ce protocole détaille comment la culture de neurones murins corticales et hippocampe au sein de ces puces. La création des micro-environnements solubles et comment rétrograde des neurones de l’étiquette, axotomie et effectuer l’immunocytochimie ont également été examinées. Ce qui est important, ces puces sont compatibles avec haute résolution, fluorescence et l’imagerie live.
Copeaux de compartiments en plastique offrent bon nombre des mêmes fonctions que les dispositifs à base de PDMS compartimenté, mais ont des avantages, inconvénients et certains traits distinctifs. Le tableau 1 fournit une comparaison des fonctionnalités de puce en plastique et de dispositifs à base de PDMS. Tout d’abord, les puces sont pré-assemblés et faits définitivement hydrophiles, qui facilite le mouillage, ce qui les rend plus faciles à utiliser. Le plastique n’est pas gaz perméable, à la différence de PDMS, donc si des bulles forment inopinément dans les canaux, ils n’échappent pas facilement et doivent être enlevés. Une solution de revêtement pré contenant principalement l’éthanol et certains autres agents exclusifs élimine la formation de bulles.
Imagerie des projections suivante transduction de protéines fluorescentes a été réalisée dans les puces (Figure 4) en direct et il n’y avait aucun autofluorescence détectable du plastique. Une mise en garde est que les huiles d’immersion avec la puce pour objectifs d’ouverture numérique élevée doivent être base d’huile de silicone et pas base d’huile minérale. L’huile minérale peut provoquer un effet indésirable avec le copolymère d’oléfine cyclique. Pour l’imagerie du fond clair, il est important de noter que les micro-rainures dans la puce sont arrondies aux extrémités et il y a un effilé graduelle de l’axe z des principaux canaux vers la barrière de microsillons, causant une réfraction de lumière à chaque extrémité de la micro-rainures pendant fond clair d’imagerie (Figure 3). Parce que la puce est prémontée, pénétration d’anticorps dans les micro-rainures taille micron peut être inégale (comme pour les dispositifs à base de PDMS en permanence sous douane) ; ainsi, l’analyse quantitative suite immunostaining doit être effectuée dans les canaux/compartiments. Immunostaining des projections neuronales dans les micro-rainures peut être amélioré en créant une différence de volume entre les compartiments pour faciliter l’écoulement des anticorps et des fluorophores dans les micro-rainures.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent une assistance technique ou éditoriale de Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) et Brad Taylor (Xona). Les auteurs reconnaissent le soutien de Xona Microfluidics, LLC et le National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Imagerie a été partiellement soutenue par le Confocal et Multiphoton Imaging Core Facility de NINDS Center Grant P30 NS045892 et NICHD Center Grant (U54 HD079124). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |