ويصف هذا البروتوكول استخدام رقائق البلاستيك للثقافة، وتقسيم الخلايا العصبية مورين الأولية. هذه الرقائق ستنشئ وسهلة الاستخدام ومتوافق مع عالية الاستبانة، ويعيش، وتصوير الأسفار. هذا البروتوكول وصف كيفية لوحة الفئران الخلايا العصبية هيبوكامبال داخل هذه الرقائق وأداء عزل فلويديك وأكسوتومي وإيمونوستينينج.
أساليب ميكروفابريكاتيد لتقسيم الخلايا العصبية أصبحت أدوات أساسية للعديد من علماء الأعصاب. ويصف هذا البروتوكول استخدام شريحة بلاستيكية قبل تجميع متوفرة تجارياً لتجزئة الفئران الابتدائي مثقف هيبوكامبال الخلايا العصبية. هذه الرقائق البلاستيكية، الواردة ضمن البصمة من شريحة مجهر القياسية، تتوافق مع عالية الاستبانة، ويعيش، وتصوير الأسفار. هذا البروتوكول يوضح كيفية إلى الوراء تسمية الخلايا العصبية عبر محاور عصبية معزولة باستخدام فيروس السعار تعديل ترميز بروتين فلوري وإنشاء ميكرونفيرونمينتس معزولة داخل حجرة واحدة، وأداء أكسوتومي وإيمونوسيتوتشيميستري على شريحة. يتم استزراع الخلايا العصبية > 3 أسابيع داخل رقائق البلاستيك، مما يوضح مدى توافق هذه الرقائق للثقافات العصبية طويلة الأمد.
ثقافة العصبية التقليدية باتباع نهج يؤدي ثمرة عشوائية من محاور عصبية و dendrites، التي تحول دون دراسة الخلايا العصبية في مورفولوجيا الاستقطاب بهم فريدة من نوعها. أجهزة مولتيكومبارتمينت ميكروفابريكاتيد قد أصبحت أدوات بحثية راسخة واستخداما جيدا لعلماء الأعصاب في السنوات 10-15 الماضية (منشورات رفيعة مختارة هي المشار إليها1،،من23 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). هذه الأجهزة تقسيم الخلايا العصبية وتوفر أسلوباً جسديا وكيميائيا التلاعب بالمناطق سوبسيلولار من الخلايا العصبية، بما في ذلك سوماتى، dendrites، ومحاور عصبية، ونهايات18،19. كما أنها توفر النماذج التجريبية المتعددة التي لا يمكن استخدام عشوائي الثقافات، بما في ذلك دراسات النقل محواري محواري البروتين، إكسون الإصابة/التجديد، وإشارات إكسون-إلى-سوما. 2-حجرة التكوين الأساسي يتكون من قناتين موائع جزيئية متوازية مفصولة بواسطة سلسلة من أصغر ميكروجروفيس عمودي. يتم مطلي الخلايا العصبية الأولية أو المستمدة من الخلايا الجذعية في إحدى القنوات موائع جزيئية وتسوية ونعلق على السطح السفلي للجهاز، وتمديد نيوريتيس على مدى الأيام. العديد من النمو الأقماع تجد طريقها إلى ميكروجروفيس، وصغيرة بما يكفي أنها تمنع الهيئات الخلية من الدخول. نظراً للنمو والأقماع وتقتصر ماديا وغير قادر على تشغيل جميع أنحاء داخل ميكروجروفيس، أنها تنمو مباشرة إلى حجرة مجاورة (حجرة محواري) حيث أنهم معزولون.
تاريخيا، هذه الأجهزة قد تم مصبوب باستخدام poly(dimethylsiloxane) (PDMS) من العفن رئيسي فوتوليثوجرافيكالي منقوشة وأدلى داخلية في مختبرات المحققين أو شراؤها تجارياً. أحد العوائق الرئيسية لاستخدام PDMS هو ما هيدروفوبيسيتي20. PDMS يمكن إجراء ماء مؤقتاً، ولكن ثم سرعان ما تصبح مسعور في غضون ساعات في بيئة غير مائية20. وبسبب هذا، يجب أن تكون الأجهزة متصلة ساترة من زجاج أو غيرها الركازة مناسبة في وقت الاستخدام. قبل تجميع رقائق البلاستيك مولتيكومبارتمينت الآن متوفرة تجارياً (مثلاً، إكسوناتشيبس) بحقن مصبوب البلاستيك. وتصنع هذه الرقائق ماء بشكل دائم، تبسيط ترطيب الجهاز والسماح للجمعية قبل رقاقة مع طبقة رقيقة من دوري اوليفينيه كوبوليمر (COC) أرفق القنوات موائع جزيئية في الجزء السفلي. هذه الرقائق مصطنعة في بلاستيك شفاف بصريا مناسبة لتصوير الفلورية ذات الدقة العالية.
والغرض من هذا البروتوكول للتدليل على استخدام رقائق موائع جزيئية البلاستيك قبل تجميع لنماذج تجريبية متعددة إجراء باستخدام الخلايا العصبية هيبوكامبال أو القشرية مورين. هذا البروتوكول، توضح هذه المقالة كيفية الوراء تسمية الخلايا العصبية باستخدام فيروس السعار معدلة داخل الرقاقة. كما يتم وصف أكسوتومي للدراسات الإصابة إكسون والتجدد. وأخيراً، هذا البروتوكول يوضح كيفية تنفيذ immunostaining الأسفار مع الجهاز.
رقائق مولتيكومبارتمينت البلاستيك توفر خياراً سهل الاستخدام لتجزئة الخلايا العصبية، تقديم الثقافات العصبية طويلة الأمد (> 3 أسابيع). هذا البروتوكول تفاصيل كيفية الثقافة القشرية وهيبوكامبال مورين من الخلايا العصبية داخل هذه الرقائق. ونوقشت أيضا إنشاء ميكرونفيرونمينتس قابلة للذوبان وكيف للوراء تسمية الخلايا العصبية والقيام أكسوتومي، وأداء إيمونوسيتوتشيميستري. الأهم من ذلك، تكون هذه الرقائق متوافقة مع عالية الدقة، الأسفار، وتصوير حية.
توفر العديد من نفس وظائف الأجهزة المستندة إلى PDMS مجزأة رقائق البلاستيك مولتيكومبارتمينت، ولكن لها مزايا وعيوب، وبعض السمات المميزة. ويقدم الجدول 1 مقارنة ميزة للرقائق البلاستيكية والأجهزة المستندة إلى PDMS. أولاً وقبل كل شيء، الرقائق قبل تجميعها وتدلي ماء بشكل دائم، مما يسهل التبول، جعلها أسهل في الاستخدام. البلاستيك ليس الغاز نفاذية، على عكس PDMS، حتى لو بشكل غير متوقع تشكل فقاعات داخل القنوات، أنهم لن يهربوا سهولة ويجب إزالته. حل قبل طلاء تتضمن أساسا الإيثانول وبعض العوامل الأخرى الملكية يلغي تشكيل فقاعة.
يعيش تصوير إسقاطات التالية توصيل البروتينات الفلورية أنجز داخل الرقائق (الشكل 4) وهناك أوتوفلوريسسينسي لا يمكن كشفها من البلاستيك. تحذير أن غمر الزيوت المستخدمة مع الرقاقة لأهداف الفتحة العددية عالية يجب أن زيت السيليكون على أساس، ولا الزيوت المعدنية على أساس. الزيوت المعدنية يمكن أن يسبب حدوث رد فعل سلبي مع كوبوليمر اوليفينيه دوري. للتصوير برايتفيلد، ومن المهم أن نلاحظ أن يتم تقريب ميكروجروفيس في الرقاقة في النهايات وهناك مستدق تدريجيا من z-اتجاه القنوات الرئيسية نحو الحاجز ميكروجروفي تسبب بعض إنكسار الضوء على حد سواء ميكروجروفيس أثناء برايتفيلد التصوير (الشكل 3). لأن قبل تجميع الرقائق، اختراق جسم ميكروجروفيس ميكرون الحجم قد يكون متفاوتاً (كما هو الحال مع الأجهزة المستندة إلى PDMS المرتهن بشكل دائم)؛ وبالتالي، ينبغي إجراء تحليل كمي عقب إيمونوستينينج في القنوات/المقصورات. يمكن تحسين Immunostaining الإسقاطات الخلايا العصبية داخل ميكروجروفيس بإنشاء فرق حجم بين المقصورات لمساعدة تدفق الأجسام المضادة و fluorophores إلى ميكروجروفيس.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب تقر مساعدة فنية أو تحريرية من الذبول تايلور (شونا)، سميتا بارانجب (UNC-تشابل هيل)، جويس سيتشانووسكي (شونا) وبراد تايلور (شونا). الكتاب الاعتراف بدعم من ميكروفلويديكس شونا، شركة ذات مسؤولية محدودة والمعهد الوطني للصحة العقلية (R42 MH097377). تصوير أيده جزئيا كونفوكال ومولتيفوتون التصوير الأساسية مرفق من نيندس مركز منحة P30 NS045892 ومنحة مركز NICHD (U54 HD079124). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |