इस प्रोटोकॉल संस्कृति और compartmentalize प्राथमिक murine ंयूरॉंस के लिए प्लास्टिक चिप्स के उपयोग का वर्णन । ये चिप्स, उपयोगकर्ता के अनुकूल है, और उच्च संकल्प, जी के साथ संगत, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्लेट चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स इन चिप्स के भीतर और तरल पदार्थ अलगाव, axotomy और immunostaining प्रदर्शन.
compartmentalize न्यूरॉन्स के लिए Microfabricated तरीकों कई neuroscientists के लिए आवश्यक उपकरण बन गए हैं. इस प्रोटोकॉल compartmentalizing कल्चरल प्राइमरी रैट हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक चिप के उपयोग का वर्णन करता है । ये प्लास्टिक चिप्स, एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड के पदचिह्न के भीतर समाहित, उच्च संकल्प, जी, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे पृथक axons के माध्यम से प्रतिगामी लेबल ंयूरॉंस को एक संशोधित रेबीज एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग वायरस का उपयोग कर, एक डिब्बे के भीतर अलग microenvironments बनाने के लिए, और axotomy और immunocytochemistry पर चिप प्रदर्शन करते हैं । न्यूरॉन्स के लिए संस्कृति रहे हैं > 3 प्लास्टिक चिप्स के भीतर सप्ताह, लंबी अवधि के न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए इन चिप्स की अनुकूलता चित्रण.
पारंपरिक ंयूरॉन संस्कृति axons और dendrites, जो उनके अद्वितीय ध्रुवीय आकृति विज्ञान में ंयूरॉंस के अध्ययन को रोकने के यादृच्छिक वृद्धि में परिणाम दृष्टिकोण । Microfabricated multicompartment उपकरणों अच्छी तरह से स्थापित है और पिछले 10-15 वर्षों में neuroscientists के लिए अच्छी तरह से इस्तेमाल किया अनुसंधान उपकरण बन गए है (चयनित उच्च प्रोफ़ाइल प्रकाशनों1,2,3 संदर्भित कर रहे है , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). इन उपकरणों compartmentalize ंयूरॉंस और शारीरिक और रासायनिक सोमता, dendrites, axons, और synapses18,19सहित न्यूरॉन्स के सेलुलर क्षेत्रों में हेरफेर करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । उंहोंने यह भी कई प्रयोगात्मक मानदंड है कि axonal परिवहन, axonal प्रोटीन संश्लेषण, axon चोट/पुनर्जनन, और axon के अध्ययन सहित यादृच्छिक संस्कृतियों, का उपयोग संभव नहीं है प्रदान करने वाली सोमा संकेतन । बुनियादी 2 डिब्बे विंयास दो समानांतर microfluidic छोटे सीधा microgrooves की एक श्रृंखला से अलग चैनलों के होते हैं । प्राथमिक या स्टेम कोशिका व्युत्पंन न्यूरॉन्स microfluidic चैनलों में से एक में चढ़ाया जाता है, बसा है और डिवाइस के नीचे की सतह के लिए देते हैं, और दिनों के पाठ्यक्रम पर neurites का विस्तार । कई विकास शंकु microgrooves, जो काफी छोटे है कि वे में प्रवेश करने से सेल निकायों को रोकने में अपनी तरह लगता है । क्योंकि विकास शंकु शारीरिक रूप से प्रतिबंधित है और microgrooves के भीतर घूम करने में असमर्थ हैं, वे सीधे सटे डिब्बे (axonal डिब्बे) जहां वे अलग कर रहे है में हो जाना ।
ऐतिहासिक रूप से, इन उपकरणों को एक photolithographically नमूनों मास्टर मोल्ड से पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) का उपयोग कर ढाला गया है और या तो जांचकर्ता प्रयोगशालाओं में घर में किए गए हैं या व्यावसायिक रूप से खरीदे गए हैं । PDMS का उपयोग कर के मुख्य कमियों में से एक इसकी hydrophobicity20है । PDMS अस्थाई रूप से हाइड्रोफिलिक बनाया जा सकता है, लेकिन फिर जल्दी से एक गैर जलीय पर्यावरण20में घंटे के भीतर hydrophobic हो जाता है । इस वजह से, उपकरणों के उपयोग के समय में एक गिलास coverslip या अन्य उपयुक्त सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए. पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक multicompartment चिप्स अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (उदा, XonaChips) इंजेक्शन ढाला प्लास्टिक में । इन चिप्स स्थाई रूप से हाइड्रोफिलिक बना रहे हैं, गीला डिवाइस को सरल बनाने और पूर्व की अनुमति चक्रीय olefin copolymer की एक पतली फिल्म के साथ चिप के विधानसभा (कॉक) नीचे microfluidic चैनल संलग्न । इन चिप्स एक ऑप्टिकली पारदर्शी उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए उपयुक्त प्लास्टिक में गढ़े हैं ।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कई प्रयोगात्मक मानदंड murine हिप्पोकैम्पस या cortical ंयूरॉंस का उपयोग प्रदर्शन के लिए पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक microfluidic चिप्स के उपयोग का प्रदर्शन है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्रतिगामी लेबल ंयूरॉंस चिप के भीतर एक संशोधित रेबीज वायरस का उपयोग कर । axon चोट और पुनर्जनन के अध्ययन के लिए Axotomy भी बताए गए हैं. अंत में, इस प्रोटोकॉल को दिखाता है कि डिवाइस के साथ प्रतिदीप्ति immunostaining प्रदर्शन करने के लिए ।
प्लास्टिक multicompartment चिप्स compartmentalizing ंयूरॉंस के लिए एक आसान उपयोग विकल्प प्रदान करते हैं, लंबी अवधि के ंयूरॉंस संस्कृतियों (> 3 सप्ताह) प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल विवरण कैसे संस्कृति cortical और हिप्पोकैम्पस murine ंयूरॉंस इन चिप्स के भीतर । घुलनशील microenvironments का निर्माण और प्रतिगामी लेबल न्यूरॉन्स के लिए कैसे, axotomy प्रदर्शन, और प्रदर्शन immunocytochemistry भी चर्चा की गई । महत्वपूर्ण बात, इन चिप्स उच्च संकल्प, प्रतिदीप्ति, और लाइव इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं ।
प्लास्टिक multicompartment चिप्स PDMS आधारित compartmentalized उपकरणों के रूप में एक ही कार्य के कई प्रदान करते हैं, लेकिन फायदे, नुकसान, और कुछ भेद सुविधाओं है । तालिका 1 दोनों प्लास्टिक चिप और PDMS-आधारित उपकरणों की एक सुविधा की तुलना प्रदान करता है । और सबसे पहले, चिप्स पूर्व इकट्ठे कर रहे है और स्थाई रूप से हाइड्रोफिलिक, जो गीला की सुविधा, उंहें आसानी से उपयोग कर बना । प्लास्टिक गैस पारगंय नहीं है, PDMS के विपरीत है, तो अगर बुलबुले अप्रत्याशित रूप से चैनलों के भीतर फार्म, वे आसानी से बच नहीं है और हटा दिया जाना चाहिए । मुख्य रूप से इथेनॉल और कुछ अंय स्वामित्व एजेंटों युक्त एक पूर्व कोटिंग समाधान बुलबुला गठन समाप्त ।
अनुमानों के लाइव इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के transduction निंनलिखित चिप्स (चित्रा 4) के भीतर प्रदर्शन किया था और वहां प्लास्टिक की कोई detectable autofluorescence था । एक चेतावनी है कि विसर्जन तेलों उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों के लिए चिप के साथ इस्तेमाल किया सिलिकॉन आधारित तेल, और नहीं खनिज तेल आधारित होना चाहिए । खनिज तेल चक्रीय olefin copolymer के साथ एक प्रतिकूल प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है । brightfield इमेजिंग के लिए, यह ध्यान रखें कि चिप में microgrooves सिरों पर गोल कर रहे है और वहां के एक क्रमिक पतला है microgroove बाधा की ओर मुख्य चैनलों की दिशा में कुछ प्रकाश अपवर्तन के कारण या तो अंत में महत्वपूर्ण है brightfield इमेजिंग (चित्रा 3) के दौरान microgrooves । क्योंकि चिप पूर्व इकट्ठे है, माइक्रोन-आकार microgrooves में एंटीबॉडी पैठ असमान हो सकता है (के रूप में स्थाई रूप से बंधुआ PDMS आधारित उपकरणों के साथ); इस प्रकार, मात्रात्मक विश्लेषण निंनलिखित immunostaining चैनलों में किया जाना चाहिए/ microgrooves के भीतर ंयूरॉन अनुमानों के Immunostaining डिब्बों के बीच एक मात्रा अंतर बनाने के द्वारा सुधार किया जा सकता है microgrooves में एंटीबॉडी और fluorophores के प्रवाह को सहायता ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक टेलर टूटेगी (Xona), स्मिता Paranjape (UNC-चैपल हिल), जॉइस Ciechanowski (Xona) और ब्रैड टेलर (Xona) से तकनीकी या संपादकीय सहायता स्वीकार करते हैं । लेखक Xona Microfluidics, LLC और मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R42 MH097377) से समर्थन स्वीकार करते हैं । इमेजिंग आंशिक रूप से NINDS केंद्र अनुदान P30 NS045892 और niched केंद्र अनुदान (U54 HD079124) के फोकल और Multiphoton इमेजिंग कोर सुविधा द्वारा समर्थित था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |