このプロトコルでは、文化し、一次マウス ニューロンを区分するプラスチック製のチップの使用について説明します。これらのチップは、組み立て済み、ユーザーフレンドリーで、高解像度と互換性がある、ライブ、および蛍光イメージング。このプロトコルでは、これらのチップ内でのラット海馬ニューロンのプレートおよび流体の分離、膠、免疫染色を実行する方法について説明します。
ニューロンを区分する微細加工方法多くの神経科学者に不可欠なツールとなっています。このプロトコルでは、区画化培養初代ラット海馬ニューロンの市販の組み立て済みプラスチック チップの使用について説明します。高解像度と互換性のある標準的な顕微鏡スライドのフット プリント内に含まれるこれらのプラスチック製のチップ、ライブ、および蛍光イメージング。このプロトコルは、蛍光タンパク質をエンコード変更された狂犬病ウイルス分離神経軸索を介してラベル ニューロンを逆行、1 つのコンパートメント内で孤立した微小を作成し、膠の試みとを実行する方法を示します、オンチップ。神経細胞は培養 > 長期神経文化のこれらのチップの互換性を示すプラスチック製のチップ内で 3 週間。
文化伝統的なニューロンの軸索と樹状突起は、そのユニークな偏光形態における神経細胞の研究を防ぐためのランダムな伸長の結果に近づきます。(選択した知名度の高い出版物が参照される1,2,3最後の 10-15 年に神経科学者によく確立され、よく使用される研究ツールとなっている 2重マルチコンパートメント,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17). これらのデバイスは、ニューロンを区分し、物理的、化学的シナプス18,19軸索、樹状突起に含むニューロンの細胞内領域を操作するためのメソッドを提供します。また、軸索輸送、軸索のタンパク質合成、軸索損傷・再生、および軸索-相馬シグナルの研究を含むランダムなカルチャを使用して可能ではない複数の実験パラダイムを提供します。2 コンパートメントの基本的な構成は、一連の小さい垂直溝で区切られた 2 つの並列チャネルで構成されます。マイクロ チャンネルの一つにメッキパーツをプライマリまたは幹細胞由来神経細胞、解決しデバイスの底面に接続し、数日にわたって神経突起を拡張します。多くの成長円錐は、彼らが入力してから細胞体を防ぐため十分に小さいである溝にその方法を見つけます。成長円錐は物理的に制限と溝内を好転させることができないため、分離が隣接する区画 (軸索コンパートメント) まっすぐに育ちます。
歴史的には、これらのデバイス生ぜずパターン マスター型からポリジメチルシロキサン (PDMS) を使用して成形されているとが社内調査官の研究所で行われたまたは商業的に購入。PDMS を使用しての主な欠点の 1 つは、その疎水性20です。PDMS 親水性、一時的に行うことができますが、すぐに疎水性非水溶液環境20時間以内。このため、デバイスは使用時ガラス基板またはその他の適当な基板に接続する必要があります。組み立て済みのプラスチック製のマルチコンパートメント チップは射出成形のプラスチックに市販 (例えばXonaChips) されます。これらのチップは、完全に親水性、デバイスぬれし下部のマイクロ チャンネルを囲む環状オレフィン共重合体 (COC) の薄膜チップの前のアセンブリの簡素化で作られています。これらのチップは、高解像度蛍光イメージングに適した、光学的に透明なプラスチックで製造されています。
このプロトコルの目的は、マウスの海馬や大脳皮質のニューロンを用いて複数の実験的パラダイムの組み立て済みプラスチック製マイクロ流体チップの使用方法を示すことです。このプロトコルでは、チップ内の変更された狂犬病ウイルスを使用してラベルのニューロンを逆行する方法について説明します。軸索傷害および再生の研究のための膠についても述べる。最後に、このプロトコルは、デバイスと蛍光免疫染色を実行する方法を示します。
プラスチック製のマルチコンパートメント チップ提供長期神経文化を提供するニューロンを区画化の簡単に使用できるオプション (> 3 週間)。このプロトコルでは、これらのチップ内皮質と海馬マウスの神経細胞を培養する方法を説明します。水溶性の微小の作成およびラベル ニューロンを逆行、膠を実行し、免疫細胞化学を実行する方法を示した。重要なは、これらのチップと互換性のある高解像度、蛍光とライブ イメージング。
プラスチック マルチコンパートメント チップは、PDMS ベース区分デバイスと同じ機能の多くを提供するが、長所、短所、およびいくつかの特徴があります。表 1は、プラスチック製のチップと PDMS ベースのデバイスの両方の機能の比較を示します。まず、チップが組み立てたし、恒久親水化したを使用しやすく、濡れ性を容易にします。プラスチックはガス透過性、PDMS とは違ってではないので泡が予期せず、チャンネル内で構成されている場合彼らは容易にエスケープしないし、削除する必要があります。主にエタノールと他にいくつか独自のエージェントを含む塗装の前処理ソリューションは、バブル形成を排除します。
蛍光蛋白質の次の伝達を行ったチップ (図 4) 内の予測の画像をライブし、プラスチックの検出可能な蛍光はありませんでした。注意点は、チップと高開口数目標用浸漬オイルこと、シリコーン オイルとない鉱物油ベースです。鉱物油は、環状オレフィン共重合体と有害反応を引き起こす可能性が。明視野イメージング チップの溝が両端に丸みを帯びたの両端にいくつかの光の屈折を引き起こしているマイクログルーブ柵の方へのメイン チャンネルの z 方向の緩やかなテーパーがあることに注意することが重要です、明視野観察 (図 3) をイメージング中に溝。チップが完成、ので抗体ミクロン サイズ溝浸透がもでがあります (完全に接合した PDMS ベースのデバイスと同様)。したがって、チャンネル/コンパートメントで免疫染色の定量的解析を行わなければなりません。溝内神経投射の免疫染色は、溝に抗体の流れを支援するためにコンパートメントと fluorophores のボリュームの違いを作成することによって改善できます。
The authors have nothing to disclose.
著者は、Smita Paranjape (UNC チャペルの丘)、ジョイスの Ciechanowski (ゾナ)、ブラッド ・ テイラー (ゾナ) テイラー萎凋 (ゾナ) からの技術的あるいは校正上の支援を認めます。著者は、ゾナ マイクロ、LLC、国立精神衛生研究所 (R42 MH097377) からの支援を認めます。イメージングは、共焦点と多光子イメージング コア施設の組織プラスミノーゲンアクテベータ センター助成金 P30 NS045892 発育センター助成金 (U54 HD079124) によって部分的に支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |