Este protocolo describe el uso de virutas de plástico a la cultura y compartimentar primarias neuronas murinas. Estos chips son confecciones, fácil de usar y compatible con alta resolución, en directo y la proyección de imagen de la fluorescencia. Este protocolo describe cómo las neuronas hippocampal de la rata dentro de estos chips de la placa y realizar la inmunotinción, axotomía y aislamiento fluídica.
Recientemente métodos para compartimentar las neuronas se han convertido en herramientas esenciales para muchos neurocientíficos. Este protocolo describe el uso de una viruta plástica premontada disponible comercialmente para compartimentar las neuronas hippocampal cultivadas rata primaria. Estas virutas de plástico, dentro de la huella de un portaobjetos de microscopio estándar, son compatibles con alta resolución, en directo y la proyección de imagen de la fluorescencia. Este protocolo muestra cómo retrógrada neuronas etiqueta vía axones aislados usando un virus de la rabia modificado codificando una proteína fluorescente, crear microambientes aislados dentro de un compartimiento y realizar axotomía e inmunocitoquímica de la en-viruta. Las neuronas se cultivan por > 3 semanas dentro de las virutas de plástico, que ilustra la compatibilidad de estos chips para culturas neuronales a largo plazo.
Cultura tradicional de la neurona acerca a resultado en consecuencia aleatoria de axones y dendritas, que impiden el estudio de las neuronas en su singular morfología polarizada. Dispositivos multicompartment recientemente se han convertido en herramientas de investigación bien establecido y usado para neurocientíficos en los últimos 10-15 años (alto perfil publicaciones son referencia1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). estos dispositivos compartimentar las neuronas y proporcionan un método para físicamente y químicamente manipular regiones subcelulares de las neuronas, incluyendo Somas, dendritas, axones y sinapsis18,19. También brindan múltiples paradigmas experimentales que no son posibles con las culturas al azar, incluyendo estudios de transporte axonal, la síntesis de proteínas axonal, lesión y regeneración del axón y axón al soma de señalización. La configuración básica de 2 compartimientos consiste en dos canales de microfluidos paralelas separados por una serie de pequeños micro-ranuras perpendicular. Neuronas primarias o derivadas de células madre se platean en uno de los canales de microfluidos, instalarse y fije a la superficie inferior del dispositivo y neurites se extienden a lo largo de días. Muchos conos de crecimiento encuentran su camino en las micro-ranuras, que son lo suficientemente pequeños que impiden que los cuerpos de célula entrando. Porque los conos de crecimiento son físicamente restringidos y no pueda girar alrededor en las micro-ranuras crecen directamente en el compartimiento adyacente (compartimiento axonal) donde están aisladas.
Históricamente, estos dispositivos han sido moldeados con poly(dimethylsiloxane) (PDMS) de un molde maestro photolithographically modelado y hechos internos en laboratorios de investigadores o adquiridos comercialmente. Uno de los principales inconvenientes del uso de PDMS es su hidrofobicidad20. PDMS pueden ser hidrofílicas temporalmente, pero luego rápidamente se vuelve hidrofóbico dentro de horas en un ambiente no acuoso20. Debido a esto, los dispositivos deben fijarse a un cubreobjetos de cristal o de otro sustrato adecuado en el momento de uso. Chips multicompartment plástico premontados ahora están comercialmente disponibles (e.g., XonaChips) en plástico moldeado por inyección. Estos chips son hidrofílicas permanentemente, simplificar el dispositivo humectante y permitiendo al premontaje de la viruta con una fina película de copolímero de olefina cíclica (COC) que incluye los microfluidos canales en la parte inferior. Estos chips son fabricados en un plástico ópticamente transparente adecuado para imágenes de fluorescencia de alta resolución.
El propósito de este protocolo es demostrar el uso de los chips microfluídicos premontado de plástico para múltiples paradigmas experimentales realizados con neuronas de hipocampales o corticales murinas. Este protocolo describe cómo retrógrado las neuronas de la etiqueta usando un virus de la rabia modificado dentro de la viruta. Axotomía estudios de lesión del axón y de la regeneración también se describen. Por último, este protocolo muestra cómo realizar immunostaining de fluorescencia con el dispositivo.
Plástico multicompartment chips ofrecen una opción fácil de usar para compartimentar las neuronas, proporcionando las culturas neuronales a largo plazo (> 3 semanas). Este protocolo detalla cómo las neuronas murinas corticales y del hipocampales en estos chips de la cultura. Se discutieron también la creación de microambientes soluble y cómo retrógrada neuronas etiqueta, realizar axotomía y realizar inmunocitoquímica. Lo importante, estos chips son compatibles con alta resolución, fluorescencia y la proyección de imagen vivo.
Chips multicompartment plástico proporcionan muchas de las mismas funciones que el PDMS compartimentados dispositivos, pero tienen algunas características distintivas, ventajas y desventajas. Tabla 1 ofrece una comparación de la característica de viruta plástica y dispositivos basados en PDMS. Primero y principal, los chips son premontados e hidrofílicas permanentemente, lo que facilita la adherencia de soldadura, haciéndolos más fácil de usar. El plástico no es gas permeable, a diferencia de los PDMS, así que si se forman burbujas dentro de los canales, no escapar fácilmente y debe eliminarse. Una solución de la capa que contiene principalmente etanol y algunos otros agentes propiedad elimina la formación de burbujas.
Vive la proyección de imagen de las proyecciones siguiente transducción de proteínas fluorescentes se realizó dentro de los chips (figura 4) y no había detectable autofluorescencia del plástico. Una advertencia es que aceites de inmersión utilizados con el chip para objetivos de gran apertura numérica deben ser con base de aceite de silicona y no aceite mineral base. Aceite mineral puede causar una reacción adversa con el copolímero de olefina cíclica. Para la proyección de imagen de brightfield, es importante tener en cuenta que las micro-ranuras en el chip son redondeadas en los extremos y hay una reducción gradual de la dirección de z de los canales principales hacia la barrera de microsurco causando algunos refracción de la luz en los extremos de la micro-ranuras en brightfield proyección de imagen (figura 3). Porque el chip es premontado, penetración de anticuerpos en las micro-ranuras tamaño micrométrico puede ser irregular (como con dispositivos permanentemente consolidados de PDMS); así, deben realizarse análisis cuantitativo immunostaining en los compartimientos de canales. Inmunotinción de proyecciones neuronales en las micro-ranuras puede mejorarse mediante la creación de una diferencia de volumen entre los compartimentos para facilitar la circulación de anticuerpos y fluoróforos en las micro-ranuras.
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen la asistencia técnico o editorial de Taylor Wilt (Balada), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Balada) y Brad Taylor (Balada). Los autores reconocen el apoyo de Xona Microfluidics, LLC y el Instituto Nacional de Salud Mental (R42 MH097377). La proyección de imagen parcialmente fue apoyada por el Confocal y multifotón Imaging Core instalación de NINDS centro Grant P30 NS045892 y NICHD centro Grant (U54 HD079124). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |