Bu iletişim kuralı kültür ve birincil fare nöronlar bölümlendirirse için plastik fiş kullanımını açıklar. Preassembled, Kullanıcı dostu ve yüksek çözünürlüklü ile uyumlu bu fişleri, canlı ve floresan görüntüleme. Bu iletişim kuralı, sıçan hipokampal nöronlar içinde bu fişleri plaka ve sıvı yalıtım, axotomy ve immunostaining gerçekleştirmek açıklar.
Nöronlar bölümlendirirse Microfabricated yöntemleri temel araçları için birçok nörologlar haline gelmiştir. Bu iletişim kuralı kültürlü birincil fare hipokampal nöronlar ayrı için piyasada bulunan bir ön montajı plastik çip kullanımını açıklar. Bu plastik fiş, bir standart mikroskop slayt ayak izi içinde bulunan yüksek çözünürlüklü ile uyumludur, canlı ve floresan görüntüleme. Bu iletişim kuralı etiket nöronların izole aksonlar floresan bir protein kodlama değiştirilmiş kuduz virüsü kullanarak üzerinden retrograd, bir bölme içinde izole microenvironments oluşturmak ve axotomy ve immunocytochemistry gerçekleştirmek gösterilmiştir üstünde-küçük parça. Nöronlar için kültürlü > 3 hafta içinde bu fişleri uzun vadeli nöronal kültürler için uyumluluk gösteren plastik fiş.
Geleneksel nöron kültürü rasgele akıbet sonucu akson ve nöronların kendi benzersiz polarize morfoloji incelenmesi önlemek dendrites yaklaşıyor. Microfabricated multicompartment aygıtları iyi kurulmuş ve kullanılmış araştırma araçları (seçili yüksek-profilli başvurulan1,2,3 yayınlardır son 10-15 yılda nörologlar için olmuştur , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). bu cihazlar nöronlar bölümlendirirse ve fiziksel ve kimyasal olarak nöronların, somata, dendrites, akson ve sinapslarda18,19da dahil olmak üzere hücre altı bölgeleri yönetmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca aksonal transport, aksonal protein sentezi, akson yaralanma/yenilenme ve akson soma sinyalizasyon çalışmaları da dahil olmak üzere rasgele kültürler kullanarak mümkün olmayan birden çok deneysel paradigmalar sağlarlar. Temel 2 bölmeli yapılandırma daha küçük dik microgrooves bir dizi tarafından ayrılmış iki paralel mikrosıvısal kanal oluşur. Birincil veya kök hücre kaynaklı nöronlar bir mikrosıvısal kanal kaplama, yerleşmek ve cihazın alt yüzeyine takın ve neurites gün boyunca uzatmak. Birçok büyüme koniler hücre organları girmesini önlemek küçük microgrooves içine kendi yolunu bulmak. Büyüme koniler fiziksel olarak sınırlı ve microgrooves içinde geri dönmek mümkün olduğundan, onlar nerede izole olduklarını düz bitişik bölmesine (aksonal bölme) büyür.
Tarihsel olarak, bu cihazlar poly(dimethylsiloxane) (PDMS) photolithographically desenli bir ana kalıp kullanarak kalıp ve müfettişler laboratuvarlarda şirket içinde yapılan veya ticari olarak satın. PDMS kullanmanın ana dezavantajları biridir onun hydrophobicity20. PDMS geçici olarak hidrofilik yapılabilir, ancak daha sonra hızlı bir şekilde bir sulu olmayan çevre20saat içinde hidrofobik olur. Bu nedenle, belgili tanımlık aygıt bir cam coverslip veya uygun diğer substrat kullanım anda bağlanması gerekir. Ön montajı plastik multicompartment fiş enjeksiyon kalıplı plastik ticari olarak kullanılabilir (Örneğin, XonaChips) oldular. Bu fişleri kalıcı olarak hidrofilik, aygıt ıslatma ve alt mikrosıvısal kanallarda kapsayan çip döngüsel olefin kopolimer (COC) ince bir film ile ön derleme izin basitleştirme yapılır. Bu fişleri bir optik şeffaf plastik yüksek çözünürlüklü floresans görüntüleme için uygun cihazlarında.
Bu iletişim kuralının amacı fare hipokampal veya kortikal nöronlar kullanılarak yapılan birden çok deneysel paradigmalar için ön montajı plastik mikrosıvısal çip kullanımını göstermektir. Bu iletişim kuralı değiştirilmiş kuduz virüsü çip içinde kullanarak etiket nöronlar retrograd açıklar. Axotomy akson hasarı ve yenilenme çalışmaları için de açıklanmıştır. Son olarak, bu protokolü nasıl belgili tanımlık aygıt ile floresan immunostaining gerçekleştirileceğini gösterir.
Plastik multicompartment fiş sağlamak için uzun vadeli nöronal kültürler veren nöronlar, ayrı bir kullanımı kolay seçenek (> 3 hafta). Bu protokolü nasıl kortikal ve hipokampal fare nöronlar içinde bu fişleri kültür ayrıntılı. Çözünür microenvironments oluşturulması ve etiket nöronlar retrograd, axotomy gerçekleştirmek ve immunocytochemistry gerçekleştirmek nasıl da ele alındı. Önemlisi, bu fişleri ile uyumlu yüksek çözünürlüklü, floresan ve canlı görüntüleme.
Plastik multicompartment fiş PDMS tabanlı bölümlere aygıtları olarak aynı işlevlerin çoğunu sunar, fakat avantajları, dezavantajları ve bazı ayırt edici özellikleri vardır. Tablo 1 plastik çip ve PDMS tabanlı aygıtların bir özellik karşılaştırması sunmaktadır. Her şeyden önce çipler önceden monte ve kalıcı olarak hidrofilik yapılan hangi ıslatma, onları daha kolay kullanılır hale kolaylaştırır. Eğer kabarcıklar beklenmedik bir şekilde içinde kanalların, kolayca kaçış yok ve onlar kaldırılmalıdır plastik gaz geçirgen PDMS, değil. Esas olarak etanol ve diğer bazı özel maddeler içeren bir ön kaplama çözüm kabarcık oluşumu ortadan kaldırır.
Aşağıdaki iletim flüoresan proteinlerin yongaları (Şekil 4) içinde yapılan projeksiyonlar görüntüleme yaşamak ve plastik tespit yok autofluorescence oldu. Bir ihtar küçük parça ile yüksek sayısal diyafram amaçları için kullanılan daldırma yağlar silikon yağı bazlı ve değil mineral yağ bazlı olması gerektiğidir. Mineral yağ ile döngüsel olefin kopolimer ters bir tepki neden olabilir. Aydınlık alan görüntüleme için çip microgrooves uçları yuvarlanır ve iki ucundaki ışık bazı kırılma neden microgroove bariyer doğru ana kanal z yönünü bir kademeli sivrilen olduğunu unutmamak önemlidir microgrooves (Şekil 3) görüntüleme aydınlık alan sırasında. Çip ön montajı olduğundan, antikor penetrasyon mikron büyüklüğünde microgrooves içine düzensiz olabilir (kalıcı olarak bağlanmış PDMS tabanlı aygıtlar gibi); Böylece, kantitatif analiz immunostaining takip kanalları/bölmeleri içinde gerçekleştirilmelidir. Nöronal projeksiyonları microgrooves içinde Immunostaining microgrooves içine antikorlar akışının yardım için bölmeleri ve fluorophores arasında bir birim fark oluşturarak geliştirilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Taylor Wilt (Xona), teknik veya Editör yardımdan Smita Paranjape (UNC Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) ve Brad Taylor (Xona) kabul edersiniz. Yazarlar Xona havacilik, LLC ve Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (R42 MH097377) destek kabul etmiş oluyorsunuz. Görüntüleme kısmen Confocal ve Multiphoton Imaging Core tesis, NINDS merkezi Grant P30 NS045892 ve NICHD merkezi Grant (U54 HD079124) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |