Summary
Presentamos un protocolo para inducir y detectar CMHs causadas por la inyección de LPS en ratas Sprague-Dawley, que puede ser utilizaron en el futuro las investigaciones de la investigación en la patogenesia de CMHs.
Abstract
Microhemorragias cerebrales (CMHs) son comunes en pacientes mayores y están correlacionados con varios trastornos neuropsiquiátricos. La etiología de CMHs es compleja, y neuroinflamación se observa a menudo como una co-ocurrencia. Aquí, describimos una aguda inducido por la inyección de lipopolisacáridos (LPS), así como un método para detectar inyección de CMHs. LPS sistémico del modelo de la rata de CMHs es relativamente simple, económico y rentable. Una ventaja importante de la inyección de LPS es su estabilidad para inducir inflamación. CMHs causadas por la inyección de LPS se podían detectar por observación bruto, hematoxilina y coloración de eosina (HE), Perl prusiano tinción, etiquetado doble de azul de Evans (EB) y la tecnología de imágenes (MRI-SWI) proyección de imagen de resonancia magnética-susceptibilidad ponderada. Por último, otros métodos de desarrollo de modelos animales de CMHs, incluyendo sus ventajas y desventajas, también se discuten en este informe.
Introduction
Microhemorragias cerebrales clásicas (CMHs) consulte perivascular diminutos depósitos de productos de degradación de la sangre como hemosiderina de glóbulos rojos en el cerebro1. Según el estudio de exploración de Rotterdam, CMHs podían encontrarse en casi el 17,8% de las personas de 60-69 años de edad y 38,3% en los 80 años2. La prevalencia de CMHs en los ancianos es relativamente alta, y una correlación entre la acumulación de CMHs y disfunción cognitiva y neuropsiquiátrica ha establecido3,4. De CMHs en varios modelos animales se han divulgado recientemente, incluyendo modelos de roedores inducidos por tipo colagenasa IV de inyección estereotáctica5, transgénicos APP6, β-N-methylamino-L-alanina exposición7y8de hipertensión, con CMHs inducidas por inflamación sistémica como una de las opciones más bien aceptadas. Fisher et al. 9 utilizado primero LPS derivados de Salmonella typhimurium para desarrollar un modelo de ratón agudo de CMHs. Posteriormente, el mismo grupo informó el desarrollo de un modelo de ratón de CMHs agudo utilizando el mismo enfoque2.
LPS se considera como un estímulo inflamatorio estandarizado mediante inyección intraperitoneal. Estudios previos han confirmado que la inyección de LPS puede causar neuroinflamación tal y como refleja grandes cantidades de microglia y activación de astrositos en animales modelos de2,10. Además, una correlación positiva entre la activación de la activación de la neuroinflamación y el número de CMHs ha sido establecido2,10. Basado en estos estudios previos, nos llevó a desarrollar un modelo de rata de CMHs por inyección intraperitoneal de LPS.
Los avances en la detección de tecnologías han dado lugar a un aumento en el número de trabajos de CMHs. Más ampliamente reconocieron que los métodos de detección de CMHs incluyen la detección de glóbulos rojos por hematoxilina y eosina (HE) tinción, detección de hierro férrico por9, la coloración de azul de Prusia azul de detección de Evans deposición (EB) por inmunofluorescencia imágenes y Tesla 7,0 susceptibilidad resonancia magnética ponderada proyección de imagen (MRI-SWI)10. El presente estudio tiene como objetivo desarrollar un método de detección de CMHs.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) del Hospital General del ejército del PLA.
1. materiales
- Preparación de la inyección de LPS
- Añadir 25 mL de agua destilada a 25 mg de polvo de LPS derivado de S. typhimurium a una concentración final de 1 mg/mL. Guarde la inyección en un tubo estéril a 4 º C.
PRECAUCIÓN: LPS es tóxico. - Preparar una solución EB de 2% en solución salina 0.9% normal para mantener la inyección de EB en la concentración de trabajo.
- Añadir 25 mL de agua destilada a 25 mg de polvo de LPS derivado de S. typhimurium a una concentración final de 1 mg/mL. Guarde la inyección en un tubo estéril a 4 º C.
2. los animales
- Administrar LPS a ratas Sprague-Dawley (SD) macho, de 10 semanas de edad (peso promedio: 280 ± 20 g) por inyección intraperitoneal.
PRECAUCIÓN: Si se compran las ratas de otra organización, entonces la fase de adaptación no debe ser menos de 7 días.
3. LPS inyecciones
- Inyectar por vía intraperitoneal LPS en cada rata a dosis de 1 mg/kg y retomar las ratas de su hogar jaula.
Nota: La anestesia no es necesaria. - Seis horas más tarde, inyectar la misma dosis de la inyección de LPS en las ratas.
- Dieciséis horas después inyectar la misma dosis de LPS en las ratas.
PRECAUCIÓN: Inyectar ratas SD con LPS en una dosis de 1 mg/kg puede resultar en una tasa de mortalidad de 5%. La tasa de mortalidad podría aumentar aún más en las ratas más jóvenes o mayores o en ratas hembras embarazadas. - Volver a las ratas a sus jaulas después de la inyección de LPS y proporcionar acceso ad libitum a comida y bebida.
Nota: Las ratas exhiben una respuesta inflamatoria sistémica de distinta, y por lo tanto es fundamental que las jaulas permanecen limpias durante todo el experimento. Las ratas debe ser con frecuencia (2 x día) supervisando peso, apariencia general y actitud después de la primera inyección de LPS. Si las ratas comienzan a exhibir una postura jorobada, renuencia a moverse, pérdida de peso significativa (> 20%), porfirina manchas que sean humanamente sacrificados antes del día 7 EB punto de final de estudio.
4. muestras
- Inyección de EB
- Siete días después de la primera inyección, anestesiar la rata por intraperitoneal según su Protocolo aprobado del IACUC.
- Espere 1-2 min hasta que las ratas no muestran respuestas reflejas corneales. Realizar un 5-8 mm-puntura profunda cardiaca en cada rata; el punto de pinchar debe ser 5 mm a la margen izquierda del esternón en el espacio intercostales 3 º y 4 º.
- Espere hasta que se observa la recuperación de sangre y luego inyectar EB en una dosis de 0,2 mL/100 g de peso corporal en el ventrículo izquierdo del corazón.
PRECAUCIÓN: Punción cardiaca e inyección de EB deben ser cuidadosamente realizados. EB puede ser inyectada en la cavidad torácica o pericardio en lugar del ventrículo izquierdo del corazón.- Aspirar con un tubo vacío y reemplazar este volumen con un tubo EB antes de la inyección para ayudar a reducir la tasa de fracaso (por ej., inyección de costillas por error).
- Mantener la rata en una posición supina durante 10 minutos.
Nota: Si la muestra no se utiliza para detectar fugas EB en proyección de imagen de inmunofluorescencia, entonces este paso puede omitirse.
- Observación bruto
- Realizar perfusiones cardiacas usando solución salina helada de 1 M buffer fosfato (PBS) para borrar la vasculatura cerebral y cerebro.
- Usando un bisturí, haga una incisión abdominal a través de toda la longitud del diafragma.
- Corte a través de las costillas justo a la izquierda de la línea media de la caja torácica.
- Abrir la cavidad torácica. Utilice abrazaderas para exponer el corazón y para facilitar el drenaje de la sangre y otros fluidos.
- Manteniendo constantemente el corazón con unas pinzas (el corazón debe aún ser latiendo), directamente insertar una aguja en el saliente del ventrículo izquierdo para extender esto a unos 5 mm. para asegurar la aguja en esa posición de sujeción cerca del punto de entrada.
PRECAUCIÓN: No extender excesivamente la aguja, ya que puede perforar la pared interior y comprometer la circulación de soluciones. - Suelte la válvula para permitir el flujo helado PBS solución de 200 – 300 mL a un ritmo lento y constante en alrededor de 20 mL/min mediante una bomba de perfusión. Si los animales requieren fijación en vez de observación bruto, utiliza la misma dosis de helada solución salina al 0.9%.
- Usando unas tijeras afiladas, haga una incisión en el atrio, asegurando que la solución fluye continuamente. Si el líquido no fluye libremente o proviene de las fosas nasales o la boca del animal, vuelva a colocar la aguja.
- Pantalla de CMHs por observación bruto.
Nota: Si la muestra no se utiliza para calcular el número de CMHs por observación bruto, entonces este paso puede omitirse.
- Realizar perfusiones cardiacas usando solución salina helada de 1 M buffer fosfato (PBS) para borrar la vasculatura cerebral y cerebro.
- Fijación
- Realizar perfusiones cardiacas usando helada 0,9% solución salina (200-300 mL) para borrar la vasculatura cerebral y cerebro.
- Realizar perfusiones cardiacas usando helada paraformaldehído al 4% para la fijación.
- Decapitar a la rata, aislar el cerebro y sumergir el cerebro en solución sacarosa al 20% durante al menos 6 h.
- Cambiar la solución en 30% de sacarosa y la solución para otro 6 h.
- Preparar 10 secciones de tejidos de cerebro mm de espesor con un criostato.
5. coloración
Nota: Este procedimiento se realiza utilizando un él manchas Kit.
- Lave los portaobjetos en agua destilada.
- Mancha en la solución de hematoxilina durante 8 min lavado en agua corriente durante 5 minutos.
- Diferenciar en alcohol ácido 1% para 30 s. lavado en agua corriente durante 1 minuto.
- Mancha en 0.2% en agua y amoníaco (azulado) o carbonato de litio saturado solución para 30 s a 1 min lavado en agua corriente durante 5 minutos.
- Enjuague en alcohol al 95% (10 inmersiones).
- Contratinción con solución de eosina para 30 s a 1 min.
- Deshidratar con alcohol al 95%, dos cambios de alcohol absoluto, durante 5 minutos.
- Claro en el xileno para 30 s.
- Monte con Liu método9.
- Analizar utilizando un microscopio de fluorescencia de campo luminoso.
Nota: eritrocitos de los vasos sanguíneos, que son los componentes de CMHs, aparecen en rojo-naranja en él manchas.
6. azul de Prusia de Perl tinción
Nota: Este procedimiento se realiza utilizando un Kit de tinción de Perls.
- Lave el portaobjetos con agua destilada.
- Mancha en la solución de reacción con la mezcla de partes iguales de ferrocianuro y ácido clorhídrico durante 10 minutos.
- Deshidratar, claro, montar y analizar las diapositivas como se describe en pasos 5.7, 5.10.
7. EB doble coloración
Nota: Este procedimiento sigue paso 4.1.3.
- Lave el portaobjetos con PBS 3 veces durante 5 minutos cada.
- Incube los portaobjetos con 4', solución 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 min a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos con solución de PBS tres veces por 5 minutos cada uno y montar el portaobjetos con solución de PBS-glicerol.
- Analizar imágenes en un microscopio de fluorescencia. Deposición de EB se indica mediante fluorescencia roja; núcleos se indican con fluorescencia azul.
8. MRI-SWI
- Realizar MRI en un imán 7-T cuenta con un sistema degradado activamente blindado (16 cm de diámetro interno).
- Siete días después del tratamiento, anestesiar las ratas por inhalación de facemask de isoflurane 1.5 – 2.0% mediante un sistema de anestesia isoflurano.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos de la rata para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
- Mantener a las ratas en posición prona y realizar una exploración de MRI-SWI.
- Obtener análisis de IHQ ponderada utilizando una secuencia de eco de la vuelta rápida usando los siguientes parámetros: tiempo (TE) de eco de 8 ms, repetición tiempo (TR) 40 ms, ángulo del tirón = 12°, campo de visión (FOV) 35 mm × 35 mm, matriz de adquisición 384 × 384, para obtener 1 mm de espesor rebanadas.
- Identificar CMHs en MRI-SWI según Greenberg et al. 11, que incluye los siguientes criterios: (1) un diámetro de ≤10 mm y manchas aisladas, (2) circular y señal de baja intensidad.
- Al final del experimento, eutanasia a las ratas con el método de dióxido de carbono (un flujo de 6 L/min) o 30% del volumen del contenedor de sobredosis.
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Representative Results
CMHs pueden detectarse utilizando diversos enfoques. Los métodos más bien aceptados son los siguientes: (1) bruto observación y evaluación de CMHs superficiales (se muestra en la figura 1, panel superior); (2) la coloración para la detección de células de sangre rojas (se muestra en la figura 2A, panel superior) o prusiano tinción detecta hierro férrico derivaba de lisis de glóbulos rojos (figura 2A, panel inferior); (3) EB doble coloración para la detección de la deposición de EB derivada de la salida BBB (figura 3, el panel de la izquierda); (4) detección de MRI-SWI de CMHs hypointense señales (figura 4, panel de la izquierda).
Figura 1: bruto observación de superficie CMHs. Panel superior (A): modelo de la rata; Panel inferior (B): animal de Control. Flechas rojas significan superficie CMHs. modificado y reutilizado con permiso10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: tinción y prusiano tinción imágenes. Reflejado (A) modelo de la rata. Glóbulos rojos fueron encontrados fuera de los capilares en la parte superior del panel, y se detectaron puntos de hierro férrico derivados de lisis de glóbulos rojos en panel inferior; Reflejado (B) control de animales. Se encontraron hematíes ni puntos de hierro férrico. Barras de escala = 100 μm (panel de la izquierda de la A y B). Barras de escala = 50 μm (panel de la derecha de la A y B). Permiso modificado y reutilizado con10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Doble etiquetado imágenes de fluorescencia de deposición EB. Panel de la izquierda: modelo de la rata. Cantidad de moléculas EB se filtró de BBB herido fueron detectados (en rojo); Panel de la derecha: animal Control. No hay moléculas EB fueron detectadas. DAPI en azul fue utilizado como medio de montaje. Barras de escala = 100 μm. modificado y reutilizado con permiso10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes de MRI-SWI. Panel de la izquierda (A): modelo de la rata. Flechas negras significan señales hipointensas de CMHs; Panel de la derecha (B): animal de Control. No se encontraron señales hipointensas. Permiso modificado y reutilizado con10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Estudios sobre las CMHs han aumentado en los últimos años. Sin embargo, el mecanismo de CMHs sigue siendo confuso, lo que los científicos a establecer modelos animales que simulan esta condición particular. Por ejemplo, Hoffmann et al. desarrollado un modelo de ratón de CMHs inducida por la hipoxia que muestra que CMHs son causadas por hipoxia y alteración de la autorregulación cerebrovascular12. Reuter et al. 5 estableció un modelo de CMHs en ratones transgénicos APP23, que demostró que la Angiopatía amiloide juega (CAA) un papel importante en la etiología de CMHs. Fisher et al reportó un modelo de ratón de CMHs que fue inducido por la inyección de LPS9, que reveló que CMHs son causadas por inflamación2,13,14. Asimismo, ha desarrollado con éxito un modelo de CMHs agudo en ratas SD mediante la inyección de LPS y han encontrado que el óxido nítrico sintasa (NOS), especialmente NOS nervios y NOS endoteliales, están implicados en la etiología de CMHs, que resultan en inflamación10 .
El paso crítico de nuestro protocolo es la inyección de LPS, que se ha utilizado extensivamente en el desarrollo de modelos murinos de trastornos neuropsiquiátricos como la depresión15,16de la esquizofrenia, la enfermedad de Parkinson17, la enfermedad de Alzheimer 18y del prión enfermedad19. A nuestro conocimiento, el uso de una dosis única (1 mg/kg) es mucho mayor que la se aplicó en otros estudios15,16,17,18,19. Esta podría ser una razón plausible para la mortalidad en el estudio actual. Modificación de la dosis de LPS de CMHs inducción puede ser un tema interesante de investigación, como diferentes dosis o inyección de horario han demostrado influir en el número, tamaño, distribución y progresión de CMHs2. Un estudio anterior ha demostrado que la administración de LPS a ratones a una dosis de 3 mg/kg induce CMHs aguda2.
Aunque el desarrollo de diferentes modelos animales ha facilitado las investigaciones investigación de CMHs, tenemos que admitir que los modelos animales no simulan el proceso de CMHs clínicas. Por ejemplo, en nuestro modelo de rata, así como el modelo de ratones de Fisher, CMHs se observaron en el cerebelo, aunque la mayoría fueron observada en regiones lobulares (principalmente relacionados con CAA) y profundo - o infra-tentorial lugares (principalmente relacionado con hipertensión)20, 21. no tenemos ninguna explicación para esta discrepancia en la distribución, aunque Fisher y nuestro equipo atribuyen esta observación a la vulnerabilidad de los vasos de sanguíneos cerebelosos a los inflamación.
En casos más clínicos, CMHs resultan de más de un factor etiológico, aunque la inflamación juega un papel importante en su etiología. Estudios centrados en los múltiples factores que inducen CMHs, en lugar de puros CMHs inducida por la inflamación, así pueden ser más útiles para simular esta condición. El modelo de la inyección de LPS puede utilizarse con otros factores subyacentes para investigar el mecanismo de CMHs. Por ejemplo, Fisher et al han realizado un paso preliminar, sin embargo interesante con el envejecimiento de ratones inyectaron con LPS y demostraron que el envejecimiento es un factor clave que podría hacer al cerebro más susceptible a los inflamación inducida CMHs14. En nuestra opinión, la importancia del actual modelo es su compatibilidad con otros factores en los modelos animales de envejecimiento14, trauma22, así como enfermedades crónicas como la hipercolesterolemia23o modelos transgénicos como hipertensión arterial24 debido a la simplicidad, efectividad de tiempo y la estabilidad de este protocolo.
Los pacientes con CMHs demuestran disminución cognitiva, Manifestaciones neuropsiquiátricas y vértigo, que se asocian a la distribución de CMHs. Una limitación del presente Protocolo es que después de la inyección de LPS, que podríamos no descartar los efectos de la inflamación periférica sobre el comportamiento de las ratas, aunque una disminución en el comportamiento social y madriguera (actividad intrínseca natural del roedor que refleja la deterioro del valor de las actividades diarias) fueron observados. Más estudios sobre cómo mejorar nuestro método de generación de un modelo animal de CMHs, por ejemplo, método de la inyección de LPS u horario de observación, están garantizados.
Sin embargo, esta simple, rentable y estable CMHs modelo murino inducido por la inyección de LPS puede ser utilizado por los investigadores en la aclaración de la etiología de CMHs.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a maestro Jian Feng Lei y sus colegas de Universidad médica de Capital para la orientación durante el MRI. También agradecemos a Jing Zeng desde el Departamento de Neurología, Hospital de Yichang la segunda gente para apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
References
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