Summary
Vi presentiamo un protocollo per indurre e rilevare CMHs causato da iniezione dei LPS in ratti Sprague-Dawley, che può essere utilizzato in futuro le indagini di ricerca sulla patogenesi di CMHs.
Abstract
Microemorragie cerebrali (CMHs) sono comuni in pazienti invecchiati e sono correlati a vari disordini neuropsichiatrici. L'eziologia di CMHs è complessa e neuroinfiammazione è osservato spesso come un co-avvenimento. Qui, descriviamo una sub-acuta CMHs modello di ratto indotta dall'iniezione di lipopolisaccaride (LPS), come pure un metodo per la rilevazione di iniezione CMHs. sistemica LPS è relativamente semplice, economico e conveniente. Uno dei principali vantaggi di iniezione dei LPS è la sua stabilità per indurre l'infiammazione. CMHs causato da iniezione dei LPS potrebbe essere rilevata da osservazione lordo, ematossilina ed eosina (HE), di Perl macchiatura prussiano, doppia marcatura blu di Evans (EB) e tecnologia di imaging a risonanza magnetica-suscettibilità weighted imaging (MRI-SWI). Infine, altri metodi di sviluppare modelli animali CMHs, compresi i loro vantaggi e/o svantaggi, inoltre sono discussi in questo rapporto.
Introduction
Microemorragie cerebrali classiche (CMHs) riferiscono a perivascolare piccoli depositi di prodotti di degradazione del sangue come emosiderina dai globuli rossi nel cervello1. Secondo lo studio di Rotterdam Scan, CMHs potrebbe essere trovato in quasi il 17,8% di persone di età 60-69 anni e 38,3% in quelli oltre 80 anni2. La prevalenza di CMHs negli anziani è relativamente alta, e una correlazione tra l'accumulo di CMHs e disfunzione conoscitiva e neuropsichiatrica è stata stabilita3,4. Diversi modelli animali di CMHs recentemente sono stati segnalati, tra cui modelli del roditore indotti dal tipo IV collagenosi iniezione stereotassica5, transgenici APP6, β-N-methylamino-L-alanina esposizione7e ipertensione8, con CMHs indotta da infiammazione sistemica come una delle scelte più ben accettate. Fisher et al. 9 in primo luogo usato LPS derivati da Salmonella typhimurium per sviluppare un modello di topo CMHs acuto. Successivamente, lo stesso gruppo segnalato lo sviluppo di un modello di topo CMHs sub-acuto utilizzando lo stesso approccio2.
LPS è considerato come un stimolo infiammatorio standardizzato tramite l'iniezione intraperitoneale. Precedenti studi hanno confermato che iniezione dei LPS potrebbe causare neuroinfiammazione come riflesso di grandi quantità di microglia e attivazione di astrociti in animale modelli2,10. Inoltre, una correlazione positiva tra l'attivazione del neuroinflammation attivazione e il numero di CMHs è stato stabilito2,10. Sulla base di questi studi precedenti ci hanno richiesto di sviluppare un modello di ratto CMHs tramite l'iniezione intraperitoneale di LPS.
I progressi nella rilevazione tecnologie hanno provocato un aumento del numero di ricerche su CMHs. Il più ampiamente riconosciuto di metodi di rilevazione CMHs includono il rilevamento dei globuli rossi di ematossilina ed eosina (HE), rilevazione di ferro ferrico di blu di Prussia macchiatura9, rilevamento di Evans blue deposizione (EB) mediante immunofluorescenza Imaging e 7,0 Tesla risonanza magnetica-suscettibilità weighted imaging (MRI-SWI)10. Il presente studio mira a sviluppare un metodo di screening per CMHs.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) dell'ospedale generale dell'esercito di PLA.
1. materiali
- Preparazione dell'iniezione dei LPS
- Aggiungere 25 mL di acqua distillata a 25 mg di polvere di LPS derivata da S. typhimurium ad una concentrazione finale di 1 mg/mL. Memorizzare l'iniezione in una provetta sterile a 4 ° C.
Attenzione: LPS è tossico. - Preparare una soluzione EB 2% in soluzione fisiologica 0,9% normale per mantenere iniezione EB alla concentrazione di lavoro.
- Aggiungere 25 mL di acqua distillata a 25 mg di polvere di LPS derivata da S. typhimurium ad una concentrazione finale di 1 mg/mL. Memorizzare l'iniezione in una provetta sterile a 4 ° C.
2. gli animali
- Amministrare i LPS a ratti maschii di Sprague-Dawley (deviazione standard), 10 settimane di età (peso medio: 280 ± 20 g) tramite l'iniezione intraperitoneale.
Attenzione: Se ratti vengono acquistati da un'altra organizzazione, quindi la fase adattiva dovrebbe non essere meno di 7 giorni.
3. LPS iniezioni
- Iniettare per via intraperitoneale LPS ogni ratto alla dose di 1 mg/kg e tornare i ratti alla loro gabbia a casa.
Nota: L'anestesia non è necessaria. - Sei ore più tardi, iniettare la stessa dose di iniezione dei LPS in ratti.
- Sedici ore dopo iniettare la stessa dose di LPS in ratti.
Attenzione: L'iniezione ratti SD con LPS ad una dose di 1 mg/kg può provocare un tasso di mortalità del 5%. Il tasso di mortalità potrebbe aumentare ulteriormente in più giovani o più vecchi topi o ratti femminili incinto. - Restituire i ratti nelle loro gabbie dopo iniezione dei LPS e fornire accesso ad libitum per cibo e bevande.
Nota: Ratti esporrà una risposta infiammatoria sistemica distinta, e quindi è essenziale che le gabbie rimangono pulite in tutto l'esperimento. Ratti dovrebbero essere frequentemente (x 2 giorni) il monitoraggio per peso, aspetto generale e atteggiamento dopo la prima iniezione di LPS. Se i ratti iniziano ad esporre una postura ricurva, riluttanza a muoversi, perdita di peso significativa (> 20%), porfirina colorazione che umanamente essere euthanized prima del giorno 7 EB studio punto finale.
4. campionario
- Iniezione di EB
- Sette giorni dopo la prima iniezione, anestetizzare il ratto di intraperitonealmente secondo il protocollo approvato IACUC.
- I ratti non mostrano risposte riflesse corneale, attendere 1-2 min. Eseguire un 5-8 mm-puntura profonda cardiaca su ogni ratto; il punto di foratura deve essere 5 mm al margine sinistro dello sterno presso lo spazio di 3 ° e 4 ° intercostali.
- Attendere fino a quando il recupero sangue è osservato e poi iniettare EB alla dose di 0,2 mL/100 g di peso di corpo nel ventricolo di sinistra del cuore.
Attenzione: Cardiaco puntura ed EB dell'iniezione deve essere eseguite con attenzione. EB può essere iniettato in cavità toracica o pericardio invece il ventricolo di sinistra del cuore.- Succhiare indietro con una provetta vuota e sostituire questo volume con un tubo EB prima dell'iniezione per contribuire a ridurre il tasso di guasto (ad es., iniezione alla gabbia toracica di errore).
- Mantenere il ratto in posizione supina per 10 min.
Nota: Se il campione non è usato per rilevare fughe di EB nell'imaging di immunofluorescenza, quindi questo passaggio può essere omesso.
- Osservazione lordo
- Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata 1m soluzione salina tampone fosfato (PBS) per cancellare il sistema vascolare cerebrale e il cervello.
- Usando un bisturi, fare un'incisione addominale attraverso l'intera lunghezza del diaframma.
- Taglio attraverso le costole appena a sinistra della linea mediana gabbia toracica.
- Aprire la cavità toracica. Utilizzare fascette per esporre il cuore e per facilitare il drenaggio del sangue e altri fluidi.
- Tenendo costantemente il cuore con il forcipe (cuore dovrebbe essere batte ancora), direttamente inserire un ago dentro la protrusione del ventricolo sinistro per estendere questo a circa 5 mm. Fissare l'ago in quella posizione di bloccaggio vicino al punto di entrata.
Attenzione: Non estendere eccessivamente l'ago, come si può perforare la parete interna e la circolazione delle soluzioni di compromesso. - Rilasciare la valvola per consentire la soluzione PBS ghiacciata di flusso (200 – 300 mL) ad un tasso lento e costante a circa 20 mL/min utilizzando una pompa di perfusione. Se gli animali richiedono fissazione invece di osservazione lordo, quindi utilizzare la stessa dose di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata.
- Utilizzando delle forbici affilate, praticare un'incisione nell'atrio, assicurando che la soluzione fluisce continuamente. Se il liquido non scorre liberamente o proviene da narici o la bocca dell'animale, riposizionare l'ago.
- Schermo per CMHs tramite osservazione lordo.
Nota: Se il campione non viene utilizzato nel calcolo del numero di CMHs da osservazione lordo, quindi questo passaggio può essere omesso.
- Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata 1m soluzione salina tampone fosfato (PBS) per cancellare il sistema vascolare cerebrale e il cervello.
- Fissazione
- Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata soluzione fisiologica 0,9% (200 – 300 mL) per cancellare il sistema vascolare cerebrale e il cervello.
- Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata paraformaldeide al 4% per la fissazione.
- Decapitare il ratto, isolare il cervello e immergete il cervello in soluzione di saccarosio al 20% per almeno 6 ore.
- Cambiare la soluzione in 30% di saccarosio e fix per un altro 6 h.
- Preparare 10 sezioni di tessuti del cervello spessore mm utilizzando un criostato.
5. egli macchiatura
Nota: Questa procedura viene eseguita utilizzando un lui Kit di colorazione.
- Lavare i vetrini in acqua distillata.
- Macchia in soluzione di ematossilina per 8 min. lavare in acqua corrente per 5 min.
- Differenziare in alcool acido 1% per 30 s. lavaggio in acqua corrente per 1 min.
- Macchia in 0,2% acqua ammoniacale (azzurrante) o saturato litio carbonato soluzione per 30 s a 1 min. lavare in acqua corrente per 5 min.
- Sciacquare in alcol al 95% (10 immersioni).
- Colorante di contrasto con soluzione di eosina per 30 s a 1 min.
- Disidratare attraverso alcol al 95%, due cambi di alcool assoluto, per 5 minuti ciascuno.
- Chiaro in xilene per 30 s.
- Montare utilizzando metodo9 di Liu.
- Analizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza campo chiaro.
Nota: globuli rossi rilasciato da vasi sanguigni, che sono i componenti di CMHs, appaiono in rosso-arancio sotto Egli macchiatura.
6. blu di Prussia di Perl colorazione
Nota: Questa procedura viene eseguita utilizzando un Kit di colorazione di Perls.
- Lavare i vetrini con acqua distillata.
- Macchia in soluzione di reazione con miscela parti uguali di ferrocianuro e acido cloridrico per 10 min.
- Disidratare, deselezionare, montare e analizzare le diapositive come descritto nei passaggi 5.7 – 5,10.
7. EB double-macchiatura
Nota: Questa procedura segue passo 4.1.3.
- Lavare i vetrini con PBS tre volte per 5 minuti ciascuno.
- Incubare i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole soluzione di (DAPI) per 15 min a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini con soluzione di PBS tre volte per 5 minuti ciascuno e montare i vetrini con la soluzione di PBS-glicerolo.
- Analizzare le immagini su un microscopio a fluorescenza. Deposizione di EB è indicato dalla fluorescenza rossa; i nuclei sono indicati da una fluorescenza blu.
8. MRI-SWI
- Eseguire risonanza magnetica su un magnete 7-T equipaggiato con un sistema di gradiente attivamente schermato (16cm di diametro interno).
- Sette giorni dopo il trattamento, anestetizzare i ratti per inalazione facemask di isoflurane 1,5 – 2,0% utilizzando un sistema di anestesia isoflurano.
- Applicare unguento veterinario sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Tenere i ratti in posizione prona ed eseguire una scansione MRI-SWI.
- Ottenere scansioni SWI ponderata utilizzando una sequenza di fast spin echo utilizzando i seguenti parametri: echo tempo (TE) 8 ms, ripetizione del tempo (TR) 40 ms, angolo di vibrazione = 12°, campo visivo (FOV) 35 mm × 35 mm, matrice di acquisizione 384 × 384, per acquisire fette di spessore mm 1.
- Identificare CMHs in MRI-SWI secondo Greenberg et al. 11, che comprendeva i seguenti criteri: (1) diametro ≤ 10 mm e macchie (2) circolare, isolato e segnale di bassa intensità.
- Alla fine dell'esperimento, eutanasia i ratti utilizzando il metodo di biossido di carbonio (un flusso di 6 L/min) o 30% del volume contenitore di sovradosaggio.
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Representative Results
CMHs può essere rilevato utilizzando vari approcci. I metodi più ben accettati sono i seguenti: (1) lordo osservazione e valutazione della superficie CMHs (illustrato nella Figura 1, pannello superiore); (2) egli macchiando per la rilevazione di cellule di anima rosse (mostrato in Figura 2A, pannello superiore) o prussiano macchiatura rilevazione ferro ferrico derivato dalla lisi dei globuli rossi (Figura 2A, pannello inferiore); (3) EB raddoppiato macchiando per la rilevazione di deposizione di EB derivato dalla perdita BBB (Figura 3, pannello sinistro); (4) rilevamento MRI-SWI di CMHs hypointense segnali (Figura 4, pannello di sinistra).
Figura 1: lordo di osservazione di superficie CMHs. Pannello superiore (A): modello del ratto; Pannello inferiore (B): animale di controllo. Frecce rosse significano superficie CMHs. modificato e riutilizzato con autorizzazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: egli la macchiatura e prussiano colorazione immagini. Modello di ratto (A) riflessa. Globuli rossi sono stati trovati fuori i capillari nel pannello superiore e punti di ferro ferrico derivati dalla lisi dei globuli rossi sono stati rilevati nel pannello inferiore; (B) riflessa controllo animale. Globuli rossi né punti di ferro ferrico sono stati trovati. Scala bar = 100 µm (pannello di sinistra della A e B). Scala bar = 50 µm (pannello di destra della A e B). Modificati e riutilizzati con autorizzazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Doppia con etichetta imaging di fluorescenza di deposizione EB. Pannello di sinistra: modello del ratto. Quantità di molecole EB trapelate da BBB feriti sono stati rilevati (in rosso); Pannello di destra: animale di controllo. Nessun molecole EB sono stati rilevati. DAPI in blu è stato usato come mezzo di montaggio. Scala bar = 100 µm. modificato e riutilizzato con autorizzazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Immagini di MRI-SWI. Pannello di sinistra (A): modello del ratto. Le frecce nere indicano hypointense segnali di CMHs; Pannello di destra (B): animale di controllo. Nessun segnale del hypointense sono stato trovato. Modificati e riutilizzati con autorizzazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Studi di ricerca su CMHs sono aumentati negli ultimi anni. Tuttavia, il meccanismo di CMHs rimane poco chiaro, spingente gli scienziati a stabilire modelli animali che simulano questa particolare condizione. Per esempio, Hoffmann et al. sviluppato un modello di mouse CMHs indotta da ipossia che mostra che CMHs sono causati da ipossia e la rottura di autoregolamento cerebrovascolare12. Reuter et al. 5 hanno stabilito un modello CMHs in topi transgenici APP23, che ha mostrato quel angiopatia amiloide cerebrale ascolti (CAA) un ruolo importante in eziologia di CMHs. Fisher et al ha riferito un modello di topo CMHs è stata indotta da LPS iniezione9, che ha rivelato che CMHs sono causati da infiammazione2,13,14. Allo stesso modo, ci hanno sviluppato con successo un modello CMHs sub-acuto in ratti SD utilizzando iniezione dei LPS e hanno trovato che l'ossido nitrico sintasi (NOS), soprattutto NOS neurale e NOS endoteliale, sono coinvolti nell'eziologia della CMHs, che provocare infiammazione10 .
Il passaggio fondamentale del nostro protocollo è l'iniezione dei LPS, che è stato ampiamente usato nello sviluppo di modelli murini di disordini neuropsichiatrici quali depressione15, schizofrenia16, morbo di Parkinson17, morbo di Alzheimer 18e Prion malattia19. A nostra conoscenza, il nostro uso di una singola dose (1 mg/kg) è molto superiore a quello che è stato applicato in altri studi15,16,17,18,19. Questo potrebbe essere un motivo plausibile per la mortalità in questo studio. Modificazione di dose di LPS per CMHs induzione può essere un interessante argomento di ricerca, come diversi dosaggi o iniezione pianificazione sono stati indicati per influenzare il numero, dimensioni, distribuzione e progressione di CMHs2. Uno studio precedente ha dimostrato che la somministrazione di LPS per topi ad una dose di 3 mg/kg induce acuta CMHs2.
Anche se lo sviluppo di modelli animali ha facilitato le indagini di ricerca su CMHs, dobbiamo ammettere che quei modelli animali non simulare il processo di CMHs clinica. Ad esempio, nel nostro modello di ratto, nonché modello di topi di Fisher, CMHs sono stati osservati nel cervelletto, anche se la maggior parte sono stata osservata nelle regioni lobare (principalmente correlati a CAA) e profondo - o infra-tentorial posizioni (principalmente correlati a ipertensione)20, 21. non abbiamo alcuna spiegazione per questa discrepanza nella distribuzione, anche se Fisher e il nostro team attribuiscono questa osservazione alla vulnerabilità dei vasi sanguigni cerebellare all'infiammazione.
Nei casi più clinici, CMHs derivare da più di un fattore eziologico, anche se l'infiammazione svolge un ruolo importante nella sua eziologia. Studi focalizzati su molteplici fattori che inducono CMHs, invece di puro CMHs indotta da infiammazione, così possono essere più utili simulare questa condizione. Il modello di iniezione di LPS potrebbe essere utilizzato con altri fattori di fondo per studiare il meccanismo di CMHs. Ad esempio, Fisher et al hanno condotto un passo preliminare, ancora interessante con invecchiamento topi iniettati con i LPS e ha dimostrato che l'invecchiamento è un fattore chiave che potrebbe rendere il cervello più suscettibili a indotta da infiammazione CMHs14. A nostro parere, il significato del presente modello è la sua compatibilità con altri fattori in modelli animali per invecchiamento14, trauma22, come pure le malattie croniche quali ipercolesterolemia23, o modelli transgenici come ipertensione,24 , a causa della semplicità, tempo-efficacia e stabilità del presente protocollo.
I pazienti con CMHs mostrano declini conoscitivi, manifestazioni neuropsichiatriche e vertigini, che sono associati con la distribuzione di CMHs. Una limitazione del presente protocollo è che dopo iniezione dei LPS, noi potremmo non regola gli effetti di infiammazione periferica sul comportamento dei ratti, anche se una diminuzione del comportamento sociale e scavatori (attività intrinseca naturale del roditore che riflette il compromissione delle attività quotidiane) sono stati osservati. Ulteriori studi sui modi per migliorare il nostro metodo di generazione di un modello animale di CMHs, ad es., metodo di iniezione di LPS o pianificazione dell'osservazione, sono autorizzati.
Tuttavia, questo semplice, conveniente e stabile modello murino CMHs indotto dall'iniezione dei LPS può essere utilizzato dai ricercatori nel delucidamento l'eziologia di CMHs.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo insegnante Jian Feng Lei e i colleghi di università medica di capitale per l'orientamento durante risonanza magnetica. Ringraziamo anche Jing Zeng dal dipartimento di neurologia, ospedale di Yichang del popolo secondo per la fornitura di supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
References
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