Summary
Nous présentons un protocole pour induire et détecter CMHs provoquées par injection de LPS chez le rat Sprague-Dawley, qui peut être utilisé à l’avenir des recherches sur la pathogénie de CMHs.
Abstract
Microhemorrhages cérébrales (CMHs) sont fréquentes chez les patients âgés et sont corrélées aux divers troubles neuropsychiatriques. L’étiologie de CMHs est complexe et neuro-inflammation est souvent observé comme une cooccurrence. Nous décrivons ici une subaiguë CMHs modèle de rat induit par l’injection du lipopolysaccharide (LPS), mais aussi une méthode de détection injection systémique LPS CMHs. est relativement simple, économique et rentable. Un avantage majeur de l’injection du LPS est sa stabilité pour induire une inflammation. CMHs provoquées par injection LPS pouvaient être décelées par l’observation brute, hématoxyline et éosine (HE) coloration, de Perl souillure Prusse, marquage double bleu Evans (EB) et une technologie d’imagerie (MRI-SWI) sensibilité à la résonance magnétique pondérée. Enfin, les autres méthodes d’élaboration de modèles animaux CMHs, y compris leurs avantages ou désavantages, sont également abordées dans ce rapport.
Introduction
Classiques microhemorrhages cérébrales (CMHs) Voir périvasculaires minuscules dépôts de produits de dégradation du sang comme l’hémosidérine de globules rouges dans le cerveau1. Selon l’étude de Scan de Rotterdam, CMHs figurait dans près de 17,8 % des personnes âgées de 60 à 69 ans et 38,3 % dans ceux de plus de 80 ans2. La prévalence de CMHs chez la personne âgée est relativement élevée, et une corrélation entre l’accumulation de CMHs et dysfonctionnement cognitif et neuropsychiatrique a été établi3,4. Plusieurs modèles animaux de CMHs ont récemment été rapportés, y compris les modèles de rongeurs induites par le type IV collagénase stéréotaxiques injection5, APP transgéniques6, exposition de β-N-methylamino-L-alanine,7et8de l’hypertension, avec CMHs induites par l’inflammation systémique comme l’un des choix plus reconnus. Fisher et al. 9 d’abord utilisé LPS dérivés de Salmonella typhimurium pour élaborer un modèle de souris CMHs aiguë. Par la suite, le même groupe a signalé l’élaboration d’un modèle de souris CMHs subaiguë en utilisant la même approche2.
LPS est considéré comme une stimulus inflammatoire normalisés par injection intrapéritonéale. Des études antérieures ont confirmé qu’injection LPS pourrait causer la neuro-inflammation telle que reflétée par les grandes quantités de cellules microgliales et activation des astrocytes dans les animaux modèles2,10. En outre, une corrélation positive entre l’activation de l’activation de la neuro-inflammation et le nombre de CMHs a été établie2,10. Se fondant sur ces études antérieures, nous a invités à élaborer un modèle de rat CMHs par injection intrapéritonéale de LPS.
Les progrès dans la détection technologies ont entraîné une augmentation du nombre de recherches sur CMHs. Le plus largement reconnu de méthodes de détection CMHs incluent la détection de globules rouges par l’hématoxyline et éosine (HE), coloration, détection de fer ferrique de bleu de Prusse coloration9, détection des Evans blue des dépôts par immunofluorescence (EB) imagerie et 7,0 Tesla imagerie par résonance magnétique-susceptibilité pondérée d’imagerie (MRI-SWI)10. La présente étude vise à développer une méthode de dépistage CMHs.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’utilisation Comité (ACUC) de l’hôpital général d’armée PLA et animalier.
1. les matériaux
- Préparation de l’injection de la LPS
- Ajouter 25 mL d’eau distillée à 25 mg de poudre de LPS dérivé de Salmonella typhimurium , à une concentration finale de 1 mg/mL. Stocker l’injection dans un tube stérile à 4 ° C.
ATTENTION : LPS est toxique. - Préparer une solution EB 2 % dans une solution saline normale 0,9 % à garder une injection d’EB à concentration de travail.
- Ajouter 25 mL d’eau distillée à 25 mg de poudre de LPS dérivé de Salmonella typhimurium , à une concentration finale de 1 mg/mL. Stocker l’injection dans un tube stérile à 4 ° C.
2. les animaux
- Administrer les LPS à des rats Sprague-Dawley (SD) mâles, âgés de 10 semaines (poids moyen : 280 ± 20 g) par injection intrapéritonéale.
ATTENTION : Si les rats sont achetés auprès d’une autre organisation, puis la phase d’adaptation ne doit pas être inférieur à 7 jours.
3. Injections de LPS
- Injecter par voie intrapéritonéale LPS tous les rats à une dose de 1 mg/kg et retourner les rats à la cage de leur maison.
Remarque : L’anesthésie n’est pas nécessaire. - Six heures plus tard, injecter la même dose d’injection de LPS dans les rats.
- Seize heures plus tard injecter la même dose de LPS dans les rats.
ATTENTION : Injection de rats SD avec LPS à une dose de 1 mg/kg peut entraîner un taux de mortalité de 5 %. Le taux de mortalité pourrait augmenter encore en rats plus jeunes ou plus âgés ou des rates gravides. - Regagner leurs cages les rats après injection de LPS et fournir un accès à la nourriture et de boisson ad libitum .
NOTE : Rats exposera une réponse inflammatoire systémique distincte, et il est donc essentiel que les cages restent propres tout au long de l’expérience. Rat devrait être fréquemment (2 x jour) surveillance des poids, aspect général et l’attitude après la première injection de LPS. Si les rats commencent à exposer une posture voûtée, la réticence à se déplacer, la perte de poids significative (> 20 %), porphyrine coloration qu’ils être humainement euthanasiés avant le jour 7 EB étude de point de terminaison.
4. le prélèvement
- Injection de EB
- Sept jours après la première injection, anesthésier le rat par voie intrapéritonéale selon votre protocole IACUC approuvé.
- Attendre 1 à 2 min jusqu'à ce que les rats ne montrent pas les réponses réflexes cornéens. Effectuer un 5 à 8 mm-perforation cardiaque profond sur chaque rat ; le point perforation devrait être de 5 mm sur la marge gauche du sternum à l’espace intercostaux 3e et 4e.
- Attendez jusqu'à ce que la récupération du sang est observée et ensuite injecter EB à une dose de 0,2 mL/100 g de poids corporel dans le ventricule cardiaque gauche.
ATTENTION : Ponction cardiaque et l’EB injection doivent être effectuées avec soin. EB pourrait être injecté dans la cavité thoracique ou péricarde au lieu du ventricule cardiaque gauche.- Sucer avec un tube vide et remplacer ce volume avec un tube EB avant l’injection pour aider à réduire le taux d’échec (e.g., injection à la cage thoracique par erreur).
- Garder le rat dans une position couchée pendant 10 min.
Remarque : Si l’échantillon n’est pas utilisé pour détecter une fuite d’EB en imagerie de l’immunofluorescence, alors cette étape peut être omise.
- Observation de brute
- Effectuer des perfusions cardiaques en utilisant glacée 1 M saline du tampon phosphate (PBS) pour effacer les vaisseaux cérébraux et la cervelle.
- À l’aide d’un scalpel, faites une incision abdominale sur toute la longueur du diaphragme.
- Coupe à travers les côtes justes à gauche de la médiane de la cage thoracique.
- Ouvert vers le haut de la cavité thoracique. Utilisez des attaches pour exposer au cœur et à faciliter l’écoulement de sang et autres fluides.
- Tout en maintenant constamment le cœur avec une pince (cœur devrait encore être battu), directement insérer une aiguille dans la partie saillante du ventricule gauche à l’étendre à environ 5 mm. fixer l’aiguille à cette position de serrage près du point d’entrée.
ATTENTION : Ne vont pas excessivement l’aiguille, car il peut percer la paroi intérieure et la circulation des solutions de compromis. - Relâcher la valve pour permettre à la solution de PBS glacee débit (200 à 300 mL) à un rythme lent et régulier, à environ 20 mL/min à l’aide d’une pompe à perfusion. Si les animaux ont besoin de fixation au lieu de l’observation brute, puis utiliser la même dose de glacee 0,9 % solution saline.
- À l’aide de ciseaux pointus, faites une incision dans l’atrium, veiller à ce que la solution s’écoule en continu. Si le liquide ne s’écoule pas librement ou provenance des narines ou la bouche de l’animal, repositionner l’aiguille.
- Écran pour CMHs par observation brute.
Remarque : Si l’échantillon n’est pas utilisé dans le calcul du nombre de CMHs par observation brute, alors cette étape peut être omise.
- Effectuer des perfusions cardiaques en utilisant glacée 1 M saline du tampon phosphate (PBS) pour effacer les vaisseaux cérébraux et la cervelle.
- Fixation
- Effectuer des perfusions cardiaques en utilisant glacee 0,9 % solution saline (200 à 300 mL) pour effacer les vaisseaux cérébraux et la cervelle.
- Effectuer des perfusions cardiaques à l’aide de paraformaldéhyde glacée de 4 % pour la fixation.
- Décapiter le rat, d’isoler le cerveau et immergez le cerveau dans la solution de saccharose de 20 % pendant au moins 6 h.
- Changez la solution à 30 % de saccharose et de fixer un autre 6 h.
- Préparer 10 sections de tissus de cerveau mm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.
5. il a une coloration
Remarque : Cette procédure est effectuée à l’aide d’un Kit de coloration de l’il.
- Laver les lames dans l’eau distillée.
- Tache dans la solution de l’hématoxyline pendant 8 min. laver à l’eau courante pendant 5 min.
- Différencier dans 1 % d’alcool acide pour 30 s. lavage à l’eau courante pendant 1 min.
- Détachant à 0,2 % d’eau ammoniaque (bleuissement) ou saturée au lithium carbonate solution pendant 30 s à 1 min. laver à l’eau courante pendant 5 min.
- Rincer à l’alcool à 95 % (10 dips).
- Contre-colorant avec solution d’éosine pendant 30 s à 1 min.
- Déshydrater à travers de l’alcool à 95 %, deux changements d’alcool absolu, de 5 min chacun.
- Claire dans le xylène pendant 30 s.
- Montez à l’aide de la méthode9 de Liu.
- Analyser à l’aide d’un microscope à fluorescence fond clair.
NOTE : culots globulaires, libéré des vaisseaux sanguins, qui sont les constituants de CMHs, figurent en rouge-orangé il coloration sous.
6. bleu de Prusse de Perl coloration
Remarque : Cette procédure est effectuée à l’aide d’un Kit de coloration de Perls.
- Les lames avec de l’eau distillée.
- Une coloration en solution de réaction avec mélange de parties égales de ferrocyanure et acide chlorhydrique pendant 10 min.
- Déshydrater, effacer, monter et d’analyser les diapositives comme décrit aux points 5.7 – 5.10.
7. EB double coloration
Remarque : Cette procédure suit étape 4.1.3.
- Les lames avec du PBS trois fois de 5 min chacun.
- Incuber les lames avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole solution de (DAPI) pendant 15 min à température ambiante.
- Laver les lames avec une solution de PBS trois fois de 5 min chacun et monter les lames avec une solution de PBS-glycérol.
- Analyser les images sur un microscope à fluorescence. Les dépôts de EB sont indiquée par une fluorescence rouge ; les noyaux sont indiqués par fluorescence bleue.
8. IRM-SWI
- Effectuer MRI sur un aimant 7-T équipé d’un système de gradient activement blindé (diamètre intérieur de 16 cm).
- Sept jours après le traitement, anesthésier les rats par inhalation d’un masque de 1,5 à 2,0 % isoflurane, à l’aide d’un système d’anesthésie isoflurane.
- Pommade vétérinaire sur les yeux du rat pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
- Gardez les rats en position couchée et effectuer un balayage de MRI-SWI.
- Obtenir des scans SWI pondérée à l’aide d’une séquence d’écho de spin rapide utilisant les paramètres suivants : écho temps (TE) 8 ms, répétition (TR) du temps 40 ms, flip angle = 12°, champ de vision (FOV) 35 mm × 35 mm, matrice acquisition 384 × 384, afin d’acquérir 1 tranches de mm d’épaisseur.
- Identifier CMHs dans MRI-SWI selon Greenberg et al. 11, qui comprenait les critères suivants : (1) de diamètre ≤ 10 mm et taches d’intensité (2) circulaire, isolé et faible signal.
- À la fin de l’expérience, euthanasier les rats en utilisant la méthode de dioxyde de carbone (un débit de 6 L/mn) ou 30 % du volume contenant de surdosage.
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Representative Results
CMHs peuvent être détectées en utilisant diverses approches. Les méthodes plus reconnus sont les suivants : (1) brut d’observation et d’évaluation de surfaces CMHs (illustré à la Figure 1, panneau supérieur) ; (2) il a une coloration pour la détection des culots globulaires (illustré à la Figure 2 a, panneau supérieur) ou prussien coloration ferrique détection dérivé de la lyse des globules rouges (Figure 2 a, panneau inférieur) ; (3) EB doublé de coloration pour la détection des dépôts EB provenant de fuites BBB (Figure 3, panneau latéral gauche) ; (4) détection de MRI-SWI CMHs hypointense signaux (Figure 4, panneau de gauche).
Figure 1 : brut observation de surfaces CMHs. Panneau supérieur (A) : modèle de Rat ; Panneau inférieur (B) : animal témoin. Flèches rouges signifient surface CMHs. modification et réutilisée avec permission de10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : il coloration et prussiennes coloration images. Modèle de rat (A) réfléchi. Globules rouges ont été trouvés en dehors des capillaires dans le panneau supérieur, et des points de fer ferrique provenant de la lyse des globules rouges ont été détectés dans le panneau inférieur ; (B) réfléchi contrôle animal. Globules rouges ni points de fer ferrique trouvées. Barreaux de l’échelle = 100 µm (panneau de gauche de A et B). Barreaux de l’échelle = 50 µm (panneau de droite de A et B). L’autorisation modifiée et réutilisée avec10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Double étiqueté imagerie de fluorescence des dépôts EB. Panneau de gauche : modèle de Rat. Quantité de molécules EB échappées du BBB blessé ont été détectés (en rouge) ; Panneau de droite : animal témoin. Sans molécules EB ont été détectés. DAPI en bleu a été utilisé comme support de montage. Barreaux de l’échelle = 100 µm. modification et réutilisée avec permission de10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Images de MRI-SWI. Panneau de gauche (A) : modèle de Rat. Flèches noires signifient hypointense signaux de CMHs ; Panneau de droite (B) : animal témoin. Aucun signal hypointense ne trouvées. L’autorisation modifiée et réutilisée avec10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Études de recherche sur CMHs ont augmenté au cours des dernières années. Toutefois, le mécanisme de CMHs reste peu clair, ce qui incite les chercheurs à établir des modèles animaux qui simulent cette condition particulière. Par exemple, Hoffmann et al. mis au point un modèle de souris CMHs induite par l’hypoxie qui montre que CMHs sont causées par l’hypoxie et la perturbation de l’autorégulation cérébrovasculaire12. Reuter et al. 5 a établi un modèle CMHs chez les souris transgéniques APP23, qui a montré qu’angiopathie amyloïde fois (CAA), un rôle important dans l’étiologie des CMHs. Fisher et al. , a signalé un modèle de souris CMHs qui a été induit par LPS injection9, qui a révélé que CMHs sont causées par l’inflammation2,13,14. De même, nous ont développé avec succès un modèle CMHs subaiguë chez des rats SD en utilisant l’injection de LPS et avons trouvé que l’oxyde nitrique synthase (NOS), en particulier NOS neurones et NOS endothéliales, sont impliqués dans l’étiologie des CMHs, entraînant une inflammation10 .
L’étape critique de notre protocole est l’injection de LPS, qui a été largement utilisée dans le développement de modèles murins de troubles neuropsychiatriques tels que dépression,15,16de la schizophrénie, la maladie de Parkinson17, la maladie d’Alzheimer 18et de maladie à prions19. À notre connaissance, notre utilisation d’une seule dose (1 mg/kg) est beaucoup plus élevée que qui a été appliquée dans les autres études15,16,17,18,19. Cela pourrait être une raison plausible pour la mortalité dans la présente étude. LPS modification de dose pour l’induction CMHs peut être un sujet de recherche intéressant, comme différentes doses ou injection auraient dû être divulgués annexe d’influer sur le nombre, taille, distribution et la progression de CMHs2. Une étude antérieure a montré que l’administration de LPS à une dose de 3 mg/kg chez la souris induit aiguë CMHs2.
Bien que le développement de différents modèles animaux a facilité les recherches sur CMHs, nous devons admettre que ces modèles animaux ne pas simuler le processus de CMHs cliniques. Par exemple, dans notre modèle de rat, comme modèle de souris de Fisher, CMHs ont été observés dans le cervelet, mais la plupart ont été observée dans les régions lobaires (principalement liés au CAA) et deep - ou infra-tentorial emplacements (principalement liée à l’hypertension)20, 21. nous n’avons pas d’explication à cette divergence dans la distribution, bien que Fisher et notre équipe attribuent cette observation à la vulnérabilité du cervelet des vaisseaux sanguins à l’inflammation.
Dans des cas plus cliniques, CMHs résultent de plus d’un facteur étiologique, bien que l’inflammation joue un rôle important dans son étiologie. Études portant sur multiples facteurs qui induisent CMHs, au lieu de pures CMHs induite par l’inflammation, peuvent ainsi être plus utiles en simulant cette condition. Le modèle d’injection de LPS pourrait servir à d’autres facteurs sous-jacents pour examiner le mécanisme de CMHs. Par exemple, Fisher et coll. ont effectué une étape préliminaire, encore intéressante avec le vieillissement souris injectées avec le LPS et démontré que le vieillissement est un facteur clé qui pourrait rendre le cerveau plus susceptibles d’être induite par l’inflammation CMHs14. À notre avis, l’importance du présent modèle est sa compatibilité avec d’autres facteurs dans des modèles animaux pour vieillissement14, traumatisme22, ainsi que des maladies chroniques tels que l’hypercholestérolémie23, ou des modèles transgéniques tels que l’hypertension24 en raison de la simplicité, temps-efficacité et stabilité du présent protocole.
Patients avec CMHs montrent le déclin cognitif, manifestations neuropsychiatriques et vertige, qui sont associés à la distribution de CMHs. Une des limites du présent protocole sont que, après injection de LPS, nous ne pourrions pas exclure les effets de l’inflammation périphérique sur le comportement des rats, bien qu’une diminution de comportement social et fouisseurs (activité naturelle intrinsèque des rongeurs qui reflète la dépréciation des activités quotidiennes) ont été observés. Outre les études sur les moyens d’améliorer notre méthode de génération d’un modèle animal CMHs, par exemple, la méthode d’injection LPS ou annexe d’observation, sont garantis.
Néanmoins, ce simple, rentable et stable CMHs murin modèle induit par LPS injection peut être utilisé par les chercheurs dans l’élucidation de l’étiologie de CMHs.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le professeur Jian Feng Lei et ses collègues de l’Université de médecine de Capital pour un guidage de MRI. Nous remercions également Jing Zeng du département de neurologie, hôpital de Yichang populaire deuxième pour fournir un soutien technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
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