Summary
在这里, 我们描述了一种协议, 以表达蛋白质原生质体使用 peg 介导的转化方法。该方法为感兴趣的蛋白质的表达提供了方便的方法, 有效地研究了蛋白质定位和各种实验条件在体内的导入过程。
Abstract
叶绿体是一个重要的细胞器, 负责植物的各种细胞过程, 如光合作用和许多次生代谢物和脂类的产生。叶绿体需要大量的蛋白质来处理这些不同的生理过程。95% 以上的叶绿体蛋白是核编码的, 在细胞核糖体上翻译后从细胞溶胶中导入叶绿体。因此, 将这些核编码的叶绿体蛋白适当导入或靶向叶绿体对于叶绿体和植物细胞的正常运作至关重要。核编码叶绿体蛋白包含特定于叶绿体的信号序列。分子机械定位到叶绿体或细胞溶胶识别这些信号并进行导入过程。为了研究蛋白质在体内导入或靶向叶绿体的机制, 我们开发了一种快速、高效的原生质体基方法来分析蛋白质导入拟南芥叶绿体的情况。在这种方法中, 我们使用从拟南芥叶片组织中分离出的原生质体。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于使用原生质体来研究蛋白质导入叶绿体的机制。
Introduction
叶绿体是植物中最重要的细胞器之一。叶绿体的主要功能之一是进行光合作用1。叶绿体还为脂肪酸、氨基酸、核苷酸和许多次生代谢物1, 2 的产生进行许多其他生化反应。对于所有这些反应, 叶绿体需要大量不同类型的蛋白质。然而, 叶绿体基因组只包含大约100个基因3,4。因此, 叶绿体必须从细胞溶胶中导入大部分蛋白质。事实上, 大多数叶绿体蛋白被证明是在翻译4,5,6后从细胞溶胶中导入的。植物细胞需要特定的机制来从细胞溶胶导入蛋白质到叶绿体。然而, 尽管这些蛋白质进口机制在过去几十年里一直在研究, 但我们仍然没有在分子层面上完全理解它们。在这里, 我们提供了一个详细的方法来制备原生质体和外生表达基因在原生质体。该方法可用于阐明蛋白质导入叶绿体的分子机制。
蛋白质的导入可以用许多不同的方法来研究。其中一种方法涉及使用体外蛋白质导入系统7,8。利用该方法,体外转化蛋白前体体体培养纯化的叶绿体, 用 sds-page 对蛋白质导入进行分析, 然后进行西方印迹分析。这种方法的优点是可以详细研究蛋白质导入叶绿体的每一步。因此, 该方法已被广泛用于定义蛋白质导入分子机械的成分, 并对过境肽的序列信息进行剖析。最近, 开发了另一种涉及使用叶组织原生质体的方法, 并已被广泛用于研究蛋白质导入叶绿体9,10.这种方法的优点是原生质体提供了一个比体外系统更接近完整细胞的细胞环境。因此, 原生质体系统使我们能够解决这一过程的许多其他方面, 如相关的细胞质事件, 以及如何确定靶向信号的特异性。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 用于使用原生质体研究蛋白质的进口到叶绿体。
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Protocol
1. 拟南芥植物的生长
- 制备1升 gamborg b5 (b5) 培养基, 加入3.2 克 b5 培养基, 包括维生素, 20 克蔗糖, 0.5 克 2-(n-吗啡) 乙烷磺酸 (mes) 约800毫升去离子水, 并调整 ph 值到5.7 与氢氧化钾 (koh)。加入更多的去离子水, 使总体积在121°c 下达到1升, 加入8克植物琼脂和高压灭菌器15分钟。
- 允许介质冷却至 55°c, 并将 b5 介质的 20–25 ml 倒入培养皿中 (直径9厘米, 高度1.5 厘米) 在干净的长凳上。干板 2-3天, 用干净的包装包装, 并将其保存在冰箱中, 直到使用。
- 在离心管 (电子管) 中, 用1毫升 70% (vv) 乙醇消毒拟南芥种子, 连续晃动 2-3分钟, 去除上清液, 加入 1% (v/v) 亚氯酸钠溶液, 并连续晃动2-3分钟准备–每个培养皿150个种子。
- 取出上清液, 用1毫升蒸馏水清洗种子。重复此步骤 4 x。将灭菌种子在4°c 下放置 3天, 使种子发芽同步。
- 使用微移液器将100–150种子播种到 b5 板上, 并用手术胶带密封板。
- 生长在生长室, 在100μmol·m-2 ·s-1 光强、70% 相对湿度和 20°c温度下, 以 16h h 光/暗色循环生长 2周.
2. 质粒的制备
注: 应使用高纯度的质粒进行转化;建议使用商业质粒净化试剂盒。
- 使用 dna 分离试剂盒纯化质粒 (rbcs-nt:gfp)。为了浓缩 dna, 在 1.5 ml 管中进行乙醇沉淀, 并在100μl 的蒸馏水中溶解 dna 颗粒。使用分光光度计确定260纳米的质粒浓度。将质粒稀释至最终浓度 ~ 2μμl. 将质粒保持在-20°c, 直至使用。
3. 原生质体的分离
- 准备以下解决方案。
- 制备含有 0.25% (w/v) macerozyme、1.0% (w/v) 纤维素酶、400 mm d-甘露醇、8 mm 氯化钙 (cicl 2)、0.1% (w/v) 牛血清白蛋白 (bsa) 和 5 mm mes 的酶溶液。使用 koh 将 ph 值调整为5.6。
- 使用孔径0.45μm 的醋酸纤维素过滤单元过滤酶溶液。将酶溶液的25毫升注入50毫升的锥形管, 并保持在-20°c。在室温 (rt) 下解冻酶溶液, 并在使用前充分混合。
- 在100毫升的去离子水中溶解21克蔗糖, 并对该溶液进行高压灭菌, 制备21% 的蔗糖溶液。
- 制备 w5 溶液, 其中含有 154 mm 氯化钠 (ncl)、125 mm ccl2、5 m 氯化钾 (kcl)、5 mm 葡萄糖和 1.5 mm mes。使用 koh 和高压灭菌器将 ph 值调整到5.6。
- 制备含有 400 mm d-甘露醇、15 mm 氯化镁 (mgcl 2) 和 5 mmmes 的 mamg 溶液。使用 koh 和高压灭菌器将 ph 值调整到5.6。
- 制备 1m d-甘露醇和1m 硝酸钙库存溶液, 以制造 peg 溶液。高压灭菌器这些解决方案。
- 制备含有 0.25% (w/v) macerozyme、1.0% (w/v) 纤维素酶、400 mm d-甘露醇、8 mm 氯化钙 (cicl 2)、0.1% (w/v) 牛血清白蛋白 (bsa) 和 5 mm mes 的酶溶液。使用 koh 将 ph 值调整为5.6。
- 用手术刀从 ~ 1-2 b5 板上从2周大的植物中采集完整的叶片组织, 并将收获的叶子放入含有25毫升酶溶液的50毫升锥形管中。将含有酶溶液和叶片组织的锥形管水平放在旋转振动台上, 在黑暗中轻轻搅拌。充分消化叶片组织需要8-12小时。
- 在孵育后 8-12小时, 通过一个具有140μm 孔径的网格, 将酶溶液 (含有从叶片组织中释放的原生质体) 倒入新鲜的培养皿中。在 21% (w/v) 的15毫升蔗糖溶液的顶部仔细分层含有原生质体的酶溶液, 并在 98 x g 的情况下离心 10分钟, 在一个摇杆转子中具有最低的加速和减速设置。
- 使用巴斯德移液器, 小心地将原生质体从最上层 (酶溶液) 转移到含有30毫升 w5 溶液的50毫升锥形管中, 并在酶溶液和蔗糖溶液之间的界面上转移原生质体。以 51 x g 离心这种管6分钟。在这个阶段, 原生质体将在锥形管底部的颗粒中。
- 使用移液器小心丢弃上清液, 而不会干扰原生质体颗粒。加入25毫升的 w5 溶液, 轻轻地重新悬浮原生质体。将原生质体溶液在4°c 冰箱中培养至少 1小时, 以实现稳定。
4. 使用聚乙烯乙二醇进行原生质体转化
- 加入4克 peg 8000、4毫升甘露醇溶液、1 mL ca (no 3)2和 1.8 ml 蒸馏水制备 40% peg 溶液, 加入 50 ml 锥形管, 搅拌良好。将40% 的 peg 溶液放在 rt 冷却, 在微波炉中加热 20-30秒, 将 peg 溶解。
注: 40% peg 溶液应每次都新鲜准备。如果原生质体在冰箱中4°c 孵育过程中没有完全造粒, 则以 46 x 克的速度离心材料2分钟。 - 小心但彻底地取出上清液, 在原生质体颗粒中加入 mamg 溶液, 使浓度达到 5 x106/。
注: 原生质体的数量可以通过在显微镜下观察的血细胞仪来确定。 - 将10微克的质粒 dna 放置在每个空的13毫升圆底管中, 并使用移液器添加300μl 原生质体溶液。
注: 应切断移液器尖端的末端。每当对原生质体进行取样时, 应在移液前重新悬浮含有原生质体的溶液, 以便在每个管中添加相同数量的原生质体。 - 通过轻轻旋转管, 将质粒 dna 与原生质体混合, 并立即使用移液器加入300μl 的 40% peg 溶液。通过旋转管轻轻但完全混合, 在室温下孵育 30分钟;将管子几乎水平倾斜, 并将其旋转几次。
- 加入1毫升的 w5 溶液, 并以类似的方式用手旋转管, 轻轻但完全混合。在室温下将样品孵化10分钟。
- 分别使用 w5 溶液的 1.5 ml 和 2 ml 重复此步骤两次。最后加入 w5 溶液后, 孵化30分钟。
- 以 46 x 克离心 4分钟, 丢弃上清液, 加入2毫升 w5 溶液。轻轻地混合, 但完全。在22°c 的黑暗室中孵化。
5. 蛋白质导入叶绿体的分析
注: 在 peg 介导的原生质体转化后, 孵育时间从8小时到24小时不等。
-
荧光显微镜
- 使用带有修剪尖端的移液器将原生质体溶液的10μl 放置在滑玻璃上, 并小心盖上盖上盖板, 以避免损坏原生质体。
- 将幻灯片放置在配备了兴奋发射滤光片集的荧光显微镜舞台上, 用于观察绿色荧光蛋白 (gfp) 和叶绿素自动荧光。
- 使用冷却电荷耦合器件 (ccd) 摄像机捕获图像, 并使用图像编辑软件处理图像以生成伪彩色图像。
-
总蛋白提取和免疫印迹
- 制备含有 2.5% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (sds) 和 2% (v/v) 2-硫醇的变性缓冲液。
注: 通过使用抗 gfp 抗体进行免疫印迹分析, 测量过境肽的处理程度, 可以量化叶绿体中的蛋白质导入。 - 以 46 x g 的速度将原生质体转移到离心管和离心机中, 持续4分钟。
- 取出上清液, 加入80μl 变性缓冲液。强烈涡流 5 s, 添加 5x sds 样品缓冲液 (250 mm Tris-Cl (ph 6.8), 0.5 m dtt, 10% (w/v) sds, 0.05% (w/v) 溴酚蓝, 50% (v/v) 甘油)。搅拌均匀10分钟。
- 将此蛋白质样本与标准 sds-page 和免疫印迹与抗 gfp 抗体。
- 制备含有 2.5% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (sds) 和 2% (v/v) 2-硫醇的变性缓冲液。
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Representative Results
蛋白质导入叶绿体可以通过两种方法进行检测: 荧光显微镜和 sds-page 介导的分离后的免疫印迹分析。在这里, 我们使用 rbcs-nt:gfp, 一种融合结构编码 79 n-端氨基酸残基 rbcs 含有与 gfp 融合的过境肽。当蛋白质导入叶绿体时, 目标蛋白 rbcs-nt:gfp 应与叶绿素自动荧光的红色荧光信号合并, 如荧光显微镜检查 (图 1)。这两个信号的紧密重叠表明蛋白质导入叶绿体。通常, gfp 信号分布在整个叶绿体中, 或集中在叶绿体的中心, 在叶绿体中的微弱扩散信号, 具体取决于单个蛋白质。蛋白质的导入可以通过使用 gfp 抗体的免疫印迹分析来证实。总蛋白由原生质体制备, 并由 sds-page 分离, 然后进行西方印迹分析 (图 2)。在大多数情况下, 如果一种蛋白质被适当地导入叶绿体, 则应在免疫细胞中观察到两个蛋白质带: 上部带对应于全长前体, 而下带对应于导入叶绿体后的加工形式。蛋白质的加工形式的数量应该以与时间相关的方式增加。这些结果将意味着蛋白质 rbcs-nt:gfp 被导入到拟南芥原生质体的叶绿体中。此外, 加工后的形式与表达的蛋白质总量 (加工形式加前体) 的比率可以作为衡量进口效率的指标。如有必要, 叶绿体可以从轻轻裂解的原生质体中纯化, 叶绿体部分的蛋白质可以通过西方印迹法进行分析, 以进一步确认蛋白质导入叶绿体。
图1。gfp 与rbcs 转运肽融合到叶绿体的体内定位。
在荧光显微镜下进行了18小时的图像转换。绿色 (a)、红色 (b)、合并 (c) 和明亮 (d) 标签分别表示 gfp 图像、叶绿素图像、两个信号的合并图像和明亮的现场图像。刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图2。西方印迹分析 rbcs-nt:gfp 研究蛋白质导入叶绿体的研究。
以原生质体为总蛋白提取物, 用10% 的 sds-page 分离, 然后利用抗 gfp 抗体进行西方印迹分析。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
我们提供了一个详细的方案, 用于使用拟南芥原生质体研究蛋白质进口到叶绿体。该方法对研究蛋白质导入过程具有很强的功能。这种简单、通用的技术可用于检查预定货物蛋白的靶向叶绿体。利用该方法, 从拟南芥11、12的叶片组织中提取原生质体, 可在从非常早期到完全成熟的叶片的许多不同生长阶段提取原生质体。然而, 在种植用于原生质体制备的植物时, 必须小心。人们应该使用非常健康的植物, 因为从健康植物中制备的原生质体可以承受 peg 介导的转化所涉及的许多步骤。另一个重要的预防措施是使用新的解决方案。溶液浓度的轻微变化会极大地损害原生质体, 因为它们很脆弱, 对渗透压力非常敏感。
我们一直在使用原生质体来研究蛋白质导入叶绿体 9,13,14。在这些研究的基础上, 我们能够剖析各种转运肽中的序列图案。此外, 我们使用原生质体来识别针对叶绿体15外包膜的蛋白质靶向信号 (位于跨膜域 c 端侧的正电荷区域).同样, 我们使用原生质体来研究蛋白质导入线粒体 10。再次, 我们能够确定线粒体蛋白前置的许多关键序列图案。此外, 线粒体的外膜蛋白还包含一个正电荷区域, 作为其靶向信号 15.这些靶向信号在氨基酸组成上具有高度的相似性。事实上, 叶绿体蛋白在体外导入实验16中被误定向到线粒体。然而, 叶绿体和线粒体蛋白在体内被专门导入到其目标细胞器中。因此, 原生质体可以用来阐明如何在叶绿体和线粒体之间确定靶向特异性的机制。
原生质体是分析蛋白质在体内输入叶绿体的理想系统。然而, 需要注意的是, 原生质体可能处于强烈的压力条件下, 如伤应激。因此, 我们不能排除这种压力可能影响进口过程的可能性。因此, 在某些情况下, 当原生质体用于蛋白质导入实验时, 应谨慎解释结果。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作是在农业科技发展合作研究方案 (项目号) 的支持下进行的。pj010953012018), 政府农村发展管理局和国家研究基金会 (韩国) 赠款, 由科学和信息和通信技术部资助 (no. 2016r1e1a1a02922014), 大韩民国。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
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