Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att uttrycka proteiner i protoplasts genom att använda PEG-medierad omvandling metod. Metoden ger lätt uttryck av proteiner av intresse och effektiv utredning av protein lokalisering och importprocessen för olika experimentella förhållanden invivo.
Abstract
Kloroplast är en grundläggande organell som ansvarar för olika cellulära processer i växter, såsom fotosyntes och produktionen av många sekundära metaboliter och lipider. Kloroplaster kräver ett stort antal proteiner för dessa olika fysiologiska processer. Över är 95% av kloroplast proteiner nucleus-kodade och importeras till kloroplaster från cytosolen efter översättning på cytosoliska ribosomer. Således är rätt import eller inriktning av dessa nucleus-kodade kloroplast proteiner till kloroplaster väsentliga för en väl fungerande kloroplaster liksom cellen växt. Nucleus-kodade kloroplast proteiner innehåller signal sekvenser för specifika inriktning till kloroplaster. Molekylära maskineri lokaliserade till kloroplast eller cytosol erkänna dessa signaler och utföra importen. För att undersöka mekanismer för protein import eller inriktning till kloroplaster i vivo, utvecklade vi en snabb, effektiv protoplast-baserad metod för att analysera protein import till kloroplaster av Arabidopsis. Den här metoden använder vi protoplasts isolerade från leaf vävnader i Arabidopsis. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för att använda protoplasts för att undersöka den mekanism genom vilken proteiner importeras till kloroplaster.
Introduction
Kloroplast är en av de viktigaste organeller i växter. En av de viktigaste funktionerna i kloroplaster är att utföra fotosyntes1. Kloroplaster utför också många andra biokemiska reaktioner för produktion av fettsyror, aminosyror, nukleotider och många sekundära metaboliter1,2. För alla dessa reaktioner kräver kloroplaster ett stort antal olika typer av proteiner. Kloroplast genomet innehåller dock endast cirka 100 gener3,4. Kloroplaster måste därför importera majoriteten av deras proteiner från cytosolen. I själva verket visades de flesta kloroplast proteiner importeras från cytosolen efter översättning4,5,6. Växtceller kräver särskilda mekanismer att importera proteiner från cytosolen till kloroplaster. Dock även om dessa protein import mekanismer har undersökts under de senaste decennierna, förstår vi fortfarande inte helt dem på molekylär nivå. Här ger vi en detaljerad metod för att förbereda protoplasts och exogent uttrycker gener i protoplasts. Denna metod kan vara värdefullt för att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom protein import till kloroplaster i detalj.
Protein import kan studeras med hjälp av många olika metoder. En av dessa metoder innebär användning av ett in vitro- protein import system7,8. Med detta synsätt, i vitro-översatta protein prekursorer inkuberas med renat kloroplaster i vitrooch protein import analyseras av SDS-PAGE följt av western blot analys. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att varje steg av protein import i kloroplaster kan studeras i detalj. Således, denna metod har använts i stor utsträckning att definiera komponenterna av protein import molekylära maskineri och dissekera sekvensinformation för transitering peptider. Mer nyligen, en annan strategi som inbegriper användning av protoplasts från leaf vävnader har utvecklats och det har blivit allmänt används att studera protein import till kloroplaster9,10. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att protoplasts ger en cellulär miljö som är närmare intakta celler än det in vitro- systemet. Således tillåter det protoplast systemet oss att ta itu med många ytterligare aspekter av denna process, såsom associerade cytosoliska händelserna och hur specificitet riktade signaler bestäms. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för användning av protoplasts att studera protein import till kloroplaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillväxt av Arabidopsis växter
- Förbereda 1 L Gamborg B5 (B5) medium genom att lägga till 3,2 g B5 medium inklusive vitaminer, 20 g sackaros, 0,5 g 2-(N-morpholino) etan sulfonsyra (MES) till cirka 800 mL avjoniserat vatten och justera pH till 5,7 med kaliumhydroxid (KOH). Lägg till mer avjoniserat vatten föra den totala volymen till 1 L. lägga till 8 g phytoagar och autoklav under 15 minuter vid 121 ° C.
- Låt medlet att kyla ned till 55 ° C och häll 20 – 25 mL B5 mediet i en petriskål (9 cm i diameter, 1,5 cm i höjd) på en ren bänk. Torka plattorna i 2 – 3 dagar, packa dem med ren wrap och förvara dem i kylskåp fram till användning.
- Sterilisera Arabidopsis thaliana frön med 1 mL 70% (v/v) etanol i ett centrifugrör (e-tube) genom att kontinuerligt skaka för 2 – 3 min. ta bort supernatanten, tillsätt 1 mL 1% (v/v) natriumhypokloritlösning och skaka kontinuerligt för 2 – 3 min. förbereda 100 – 150 frön per petriskål.
- Ta bort supernatanterna och tvätta fröna med 1 mL destillerat vatten. Upprepa detta steg 4 x. Placera steriliserade frön vid 4 ° C i 3 dagar för att synkronisera frögroning.
- Så 100 – 150 frön på B5 plattor med hjälp av en mikropipett och försegla plattan med kirurgisk tejp.
- Odla växter i ett tillväxt-rum med en 16 h/8 h ljus/mörk cykel vid 100 µmol·m-2·s-1 ljusintensitet, 70% relativ luftfuktighet och temperatur 20 ° C i 2 veckor.
2. beredning av Plasmiden
Obs: Hög renhet plasmider bör användas för omvandling; användning av en kommersiell plasmid rening kit rekommenderas.
- Rena plasmiden (RBC-nt:GFP) med hjälp av ett DNA isolering kit. För att koncentrera DNA, utföra etanol nederbörd i en 1,5 mL tub och upplösa DNA pelleten i 100 µL destillerat vatten. Bestämma koncentrationen av Plasmiden med en spektrofotometer vid 260 nm. Späd plasmiden till en slutlig koncentration av ~ 2 µg / µL. hålla plasmiden vid-20 ° C fram till användning.
3. isolering av Protoplasts
- Förbered följande lösningar.
- Förbereda enzym lösningen innehåller 0,25% (w/v) macerozyme, 1,0% (w/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM kalciumklorid (CaCl2), 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), och 5 mM MES. Justera pH till 5.6 med KOH.
- Filtrera enzym lösningen med en cellulosaacetat filterenhet med porstorlek 0,45 μm. Alikvotens 25 mL av enzymet lösningen i 50 mL koniska rör och hålla på-20 ° C. Tina de enzym lösningen vid rumstemperatur (RT) och blanda väl innan användning.
- Bered en 21% (w/v) sackaros genom upplösning 21 g sackaros i 100 mL avjoniserat vatten och autoklavera lösningen.
- Bered W5 innehåller 154 mM natriumklorid (NaCl), 125 mM CaCl2, 5 mM kaliumklorid (KCl), 5 mM glukos och 1,5 mM MES. Justera pH till 5.6 med KOH och autoklavera lösningen.
- Förbereda MaMg lösning innehåller 400 mM D-mannitol, 15 mM magnesiumklorid (MgCl2), och 5 mM MES. Justera pH till 5.6 med KOH och autoklavera lösningen.
- Laga 1 M D-mannitol och 1 M kalciumnitrat stamlösningar att göra PEG lösningen. Autoklav dessa lösningar.
- Förbereda enzym lösningen innehåller 0,25% (w/v) macerozyme, 1,0% (w/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM kalciumklorid (CaCl2), 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), och 5 mM MES. Justera pH till 5.6 med KOH.
- Skörda intakt leaf vävnader från 2 veckor gamla växter från ~ 1 – 2 B5 plattor med hjälp av kirurgisk kniv och plats skördas bladen till en 50 mL konisk tube innehåller 25 mL av enzymet lösning. Placera koniska röret som innehåller enzymet lösning och leaf vävnader horisontellt på en roterande skakapparat med mild agitation i mörkret. Det tar 8 – 12 h för fullständig nedbrytning av leaf vävnader.
- På 8 – 12 h efter inkubation, häll över enzym lösningen (innehållande protoplasts frigörs från leaf vävnader) i en färsk petriskål genom ett nät med 140 µm porstorlek. Försiktigt lager protoplast-innehållande enzym lösningen ovanpå 15 mL 21% (w/v) sackaroslösning och centrifugera det 98 x g i 10 min med lägsta acceleration och retardation inställningar i en svängande-hink rotor.
- Med Pasteur pipett noggrant överföra protoplasts från det översta lagret (enzym lösning) och vid gränssnittet mellan enzym lösning och sackaroslösning till en 50 mL konisk tub innehållande 30 mL W5 lösning. Centrifugera denna tube vid 51 x g i 6 min. I detta skede, kommer protoplasts att pelleten på botten av koniska röret.
- Kassera supernatanten noggrant med pipett utan att störa pelleten protoplasts. Tillsätt 25 mL W5 och försiktigt Omsuspendera protoplasts. Inkubera protoplast lösningen i kylskåp 4 ° C i minst 1 h för stabilisering.
4. protoplast omvandling med polyetylenglykol
- Förbereda en 40% PEG lösning genom att lägga till 4 g av PEG 8000, 4 mL 1 M mannitol lösning, 1 mL 1 M Ca (nr3)2och 1,8 mL destillerat vatten till en 50 mL konisk rör och blanda väl. Lös upp PEG genom uppvärmning i en mikrovågsugn för 20 – 30 s. plats 40% PEG lösning på RT för att kyla ner.
Obs: De 40% PEG lösning bör beredas på nytt varje gång. Om protoplasts inte är pelleterat helt under 4 ° C inkubering i kylskåp, Centrifugera materialet vid 46 x g i 2 min. - Avlägsna supernatanten noggrant men helt och Lägg till MaMg lösning protoplast pelleten ge koncentrationen av6/5 x 10 ml.
Anmärkning: Antalet protoplast kan bestämmas genom en hemocytometer tittade på under ett mikroskop. - Plats 10 µg av Plasmiden DNA varje tom 13 mL runda-botten röret och tillsätt 300 µL av protoplast lösning med pipett.
Obs: Slutet av pipettspetsen bör klippas av. När protoplasts provtas, bör den protoplast-innehållande lösningen vara resuspended precis före pipettering så att samma antal protoplasts läggs till varje rör. - Blanda plasmiden DNA med protoplasts genom att försiktigt rotera rören och tillsätt omedelbart 300 µL av 40% PEG lösning med pipett. Blanda försiktigt men helt genom att vrida rören och inkubera i 30 min i rumstemperatur; Vrid röret nästan vågrätt och rotera den flera gånger.
- Tillsätt 1 mL W5 lösning och blanda försiktigt men helt genom att vrida röret för hand på ett liknande sätt. Inkubera provet under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Upprepa detta steg två gånger mer med 1,5 mL och 2 mL W5 lösning, respektive. Inkubera i 30 min efter det sista tillskottet av W5 lösning.
- Centrifugera vid 46 x g i 4 min. Kassera supernatanten och tillsätt 2 mL av W5 lösning. Blanda försiktigt men helt. Inkubera vid 22 ° C i en mörk kammare.
5. analys av Protein Import till kloroplaster
Obs: Efter PEG-medierad omformning av protoplasts, inkubation tid varierar från 8 till 24 h.
-
Fluorescensmikroskopi
- Plats 10 µL av protoplast lösningen på en bild glas med pipett med trimmade spets och noggrant Täck med ett täckglas att undvika att skada protoplasts.
- Plats i bilden på scenen av fluorescens Mikroskop utrustat med excitation/utsläpp filter anger för observation grönt fluorescerande protein (GFP) och klorofyll auto-fluorescens.
- Ta bilder med en kyld kostnad – tillsammans enhet (CCD) kamera och processen bilder använda ett bildredigeringsprogram för att producera pseudo färgbilder.
-
Total Protein utvinning och Immunoblotting
- Förbereda denaturering buffert innehållande 2,5% (w/v) natrium dodecylsulfate (SDS) och 2% (v/v) 2-merkaptoetanol.
Obs: Protein import till kloroplaster kan kvantifieras genom att mäta graden av transitering peptid bearbetning via immunoblot analys med anti-GFP antikroppen. - Över protoplasts till ett centrifugrör och centrifugera vid 46 x g under 4 minuter.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 80 µL av denaturering buffert. Kraftfullt virvel för 5 s och Lägg till 5 x SDS prov buffert (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DTT, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) Bromophenol blå och 50% (v/v) glycerol). Blanda väl och koka i 10 min.
- Standard SDS-PAGE och immunoblotting med anti-GFP antikropp som omfattas av detta protein provet.
- Förbereda denaturering buffert innehållande 2,5% (w/v) natrium dodecylsulfate (SDS) och 2% (v/v) 2-merkaptoetanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Import av proteiner till kloroplaster kan undersökas med hjälp av två metoder: fluorescence mikroskopi och immunoblot analys efter SDS-PAGE-medierad separation. Här, vi använde röda blodkroppar-nt:GFP, en fusion konstruera kodning 79 N-terminala aminosyran resthalter av röda blodkroppar som innehåller transit peptiden smält till GFP. När proteiner importeras till kloroplaster, grön fluorescens signaler från målproteinet RBC-nt:GFP skulle slås samman med röd fluorescerande signalerna från klorofyll auto-fluorescens, som granskas av fluorescensmikroskopi (figur 1). Nära överlappningen mellan de två signalerna anger protein import till kloroplaster. Ofta god Jordbrukarsed signalerna är spridda över hela kloroplaster eller är koncentrerad i mitten av kloroplaster, med svagt diffusa signaler i hela kloroplaster, beroende på det enskilda proteinet. Import av proteiner kan bekräftas av immunoblot analys med GFP antikroppen. Totala proteiner är beredd från protoplasts och åtskilda av SDS-PAGE följt av Western blot analys (figur 2). I de flesta fall två protein band bör iakttas i immunoblot om ett protein importerades ordentligt i kloroplaster: övre bandet motsvarar fullängds föregångaren och det lägre bandet till formuläret bearbetade efter import till kloroplaster. Bearbetade form av proteinet bör öka i ett tidsberoende sätt. Sådana resultat skulle innebära att proteinet RBC-nt:GFP importeras till kloroplaster i Arabidopsis protoplasts. Förhållandet mellan bearbetade form till den totala mängden uttryckta proteiner (den bearbetad form plus föregångare) kan dessutom användas som ett mått på import effektivitet. Om nödvändigt, kloroplaster kan renas från försiktigt lyserat protoplasts och proteiner från kloroplast fraktionen kan analyseras av western blotting för att ytterligare bekräfta import av proteiner i kloroplaster.
Figur 1. In vivo lokalisering av GFP smält till röda blodkroppar transit peptiden till kloroplaster.
Bilder togs 18 h efter omvandling enligt fluorescens Mikroskop. Grön (en), röd (b), sammanfogade (c) och ljusa (d) Etiketter anger GFP bild, klorofyll bild, sammanslagna bilden av de två signalerna och ljusa fältet bild, respektive. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Western blot analys av RBC-nt:GFP att undersöka protein import till kloroplaster.
Totalprotein extrakt var beredd från protoplasts och avgränsade med 10% (w/v) SDS-PAGE, följt av western blot analys med anti-GFP antikroppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi gav ett detaljerat protokoll för användning av protoplasts av Arabidopsis att studera protein import till kloroplaster. Denna metod är kraftfulla för att utreda protein importprocessen. Denna enkla, mångsidig teknik är användbar för att undersöka inriktningen av de avsedda Last proteinerna till kloroplaster. Med den här metoden är protoplasts beredda från leaf vävnader Arabidopsis11,12 som kan erhållas från växter i många olika tillväxt stadier alltifrån mycket tidigt till fullt mogna blad. Man måste dock vara försiktig när odling av växter som används för protoplast beredning. Man ska använda mycket friska växter, som protoplasts beredd från friska växter tål de många steg som ingår i PEG-medierad omvandling. En annan viktig försiktighetsåtgärd är att använda färska lösningar. Smärre förändringar i koncentrationen av lösningarna kan kraftigt skada protoplasts, eftersom de är ömtåliga och mycket känslig för osmotiska trycket.
Vi har använt protoplasts för att studera protein import till kloroplaster9,13,14. Baserat på dessa studier, kunde vi att dissekera sekvens motiven i olika transit peptider. Dessutom använde vi protoplasts för att identifiera inriktning signalerna (positivt laddade regionen flankerande C-terminus i domänen transmembrana) av proteiner riktade till ytterkuvertet membranet av kloroplast15. På samma sätt använde vi protoplasts för att undersöka protein import till mitokondrierna10. Igen, vi har kunnat identifiera flera kritiska sekvens motiv i presequences av mitokondrie proteiner. De yttre membranproteiner av mitokondrierna innehåller dessutom också en positivt laddad region som flankerar de transmembrana domänen som deras inriktning signal15. Dessa riktade signaler dela en hög grad av likhet i aminosyra sammansättning. Faktiskt var kloroplast proteiner mistargeted till mitokondrierna vid in vitro- import experiment16. Kloroplast och mitokondrie proteiner är dock specifikt importeras till deras mål organeller i vivo. Protoplasts kan således användas för att klarlägga mekanismerna bakom hur inriktning specificitet bestäms mellan kloroplaster och mitokondrier.
Protoplasts representerar ett idealiskt system för att analysera import av proteiner i kloroplaster i vivo. En varning är dock att protoplasts kan vara under stark stress förhållanden såsom såra stress. Sålunda, vi kan inte utesluta att sådan stress kan påverka importen. I vissa fall bör således resultaten tolkas med försiktighet när protoplasts används för protein import experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete genomfördes med stöd av Cooperative Research Program för jordbruk vetenskap och teknikutveckling (projekt nr. PJ010953012018), landsbygdens utveckling Administration och National Research Foundation (Korea) bidraget finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (nr 2016R1E1A1A02922014), Republiken Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C.
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
