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Genetics

Explorant les effets des vols spatiaux sur la physiologie de la souris à l’aide de la plate-forme de GeneLab de la NASA accès ouverte

Published: January 13, 2019 doi: 10.3791/58447
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 2, 2
1WYLE Labs, Space Biosciences Division, NASA Ames Research Center, 2Space Biosciences Division, NASA Ames Research Center, 3USRA, NASA Ames Research Center

Summary

La plate-forme de la NASA GeneLab fournit un accès sans entraves aux omics précieux données d’expériences biologiques de vols spatiaux habités. Les auteurs décrivent comment une expérience typique de la souris est réalisée dans l’espace et comment les données de telles expériences sont accessibles et analysées.

Abstract

Réaliser des expériences biologiques dans l’espace requiert des accommodements spéciaux et des procédures visant à garantir que ces enquêtes soient effectuées avec efficacité et efficience. En outre, compte tenu de la rareté de ces expériences, il est impératif que leurs impacts maximisés. L’avancement rapide des technologies d’omique offre l’occasion d’augmenter considérablement le volume de données produits à partir de vols spatiaux précieux spécimens. Pour tirer parti de cela, la NASA a mis au point la plate-forme GeneLab pour fournir un accès illimité aux données omics vol spatial et encourager son analyse très répandue. Rongeurs (souris et rats) sont des organismes modèles communs utilisées par les scientifiques pour étudier les impacts biologiques liées à l’espace. L’enceinte que maison rongeurs au cours des vols spatiaux habités sont appelés rongeur Habitats (anciennement Animal enceinte Modules) et sont sensiblement différentes de cages standard vivarium dans leurs dimensions, débit d’air et l’accès à l’eau et de nourriture. En outre, en raison des conditions atmosphériques et environnementales sur la Station spatiale internationale (ISS), les animaux sont exposés à une plus forte concentration de CO2 . Nous avons récemment rapporté que la souris dans les Habitats de rongeurs connaissent des changements importants dans leur transcriptome indépendamment de savoir si les animaux était sur le terrain ou dans l’espace. En outre, ces changements correspondent à une réponse à l’hypoxie, potentiellement pilotée par des concentrations plus élevées de2 CO. Nous décrivons ici comment une expérience typique de rongeur est effectuée dans l’espace, comment omics données de ces expériences sont accessibles par le biais de la plateforme GeneLab et comment identifier les facteurs clés de ces données. Grâce à ce processus, tout individu peut faire des découvertes essentielles qui pourraient changer la conception des futures missions spatiales et activités.

Introduction

L’objectif global de ce manuscrit est de fournir une méthode claire de l’utilisation de la NASA GeneLab plate-forme1 et comment rongeurs expériences réalisées dans l’espace sont converties en données omiques pour analyse. Les activités spatiales humains sont exposés à nombreux risques pour la santé des champs de gravité altérée, rayonnement spatial, l’isolation de la terre et autres facteurs environnementaux hostiles2,3,4,5, 6. des expériences biologiques dans l’espace et sur le terrain ont contribué à définir et à quantifier ces risques7,8,9,10,11, 12 , 13 , 14. dans l’espace, ces expériences ont été menées sur la Station spatiale internationale (ISS), la navette spatiale et autres plates-formes orbitales. Ces expériences nécessite le matériel spécialisé et la méthodologie compte tenu des préoccupations uniques de réaliser des expériences dans l’espace, y compris les temps d’équipage limité et la microgravité. Diverses plates-formes existent maintenant pour réaliser des expériences sophistiquées dans l’espace à l’aide de plantes, animaux et microbiens modèles15.

Les modèles de rongeurs ont été particulièrement importants pour faire progresser notre compréhension de comment les mammifères, y compris les humains, répondent aux vols habités. Il s’agit de l’impact du vol spatial sur le muscle structure16,17,18 et les fonctions immunitaires19,20,21. Les cages de vivarium standard utilisés pour les rongeurs de logement sur la terre ne conviennent pas aux vols spatiaux habités expériences22,23. Par conséquent, plus les années souris et les rats ont été volés et logés dans des cages différentes, dont l’agence d’Exploration aérospatiale japonaise (JAXA) Habitat Cage24, animal portant des capsules spatiales utilisées sur le BION-M1 sans pilote satellite russe25 ,26,27, le système de tiroir de souris (SDM) conçu par l’Agence spatiale italienne28,29,30, la NASA Animal boîtier Module (AEM) et maintenant la NASA Transporteur et Habitats rongeurs23. Expériences de rongeurs d’abord commencèrent à bord de la navette spatiale à l’aide de cages dénommés comme l’Animal boîtier Module (AEM). Ce matériel a été utilisé dans des expériences de rongeurs 27 sur la navette spatiale23. L’AEM a été initialement développé pour des expériences relativement courtes bord de la navette (< 20 jours). Depuis le développement de l’ISS, l’AEMs ont été modifiés pour des expériences de durée plus longues et sont maintenant appelés rongeur Habitats22,23. Les nouveaux Habitats de rongeurs sont conçus pour appuyer les missions de longue durée à bord de l’ISS à l’aide de l’accélérer le traitement des expériences pour interface Rack Station spatiale (EXPRESS). Habitats de rongeurs sont sensiblement différentes de cages standard vivarium dans leurs dimensions, débit d’air, filtre et système d’échappement et l’accès à la nourriture et l’eau (Figure 1). Néanmoins, ce matériel s’est avéré pour être une plateforme de recherche efficace, permettant aux clés mieux comprendre les changements induits par spaceflight physiologie mammifères19,31,32,33 ,34,35,36.

Grands volumes de données omics maintenant peuvent être générés à partir des expériences de vols spatiaux biologiques y compris celles effectuées sur des rongeurs. Récemment, les données de ces expériences omiques ont été rendues accessibles au public par le biais de la NASA GeneLab plate-forme1 qui est un référentiel de données complètes et la plateforme d’analyse qui permet à quiconque de développer des hypothèses à partir d’expériences de vol spatial. GeneLab fournit des outils pour la découverte, de l’accès, du partage et de l’analyse des données. Nous avons utilisé des ensembles de données GeneLab pour montrer que les différences entre les cages standard vivarium et Habitats spécialisés de rongeurs utilisés dans l’espace causent énormes différences dans le transcriptome de souris36. Nous avons analysé quatre différents ensembles de données accessibles au public, en comparant les différents tissus de rongeurs logés dans les Habitats de rongeur ou cages standard vivarium. À l’aide d’une analyse de biologie des systèmes non biaisée, nous avons déterminé que les principaux moteurs et les voies qui ont été modifiés étaient conformes à une réponse à l’hypoxie en raison des niveaux de2 CO élevés causé par des concentrations plus élevées de2 de CO sur l’ISS, ce qui conduit à CO supérieur 2 les concentrations dans l’Habitat rongeur étant donné qu’ils sont des systèmes passifs qui prennent dans l’air ambiant. Cela démontre comment scientifiques peuvent utiliser des outils open source et données pour générer de nouveaux résultats avec implication sur la santé des astronautes à l’impact l’environnement de la station spatiale internationale.

Ici, nous décrivons comment rongeur des expériences sont effectuées dans l’espace et comment les données de ces expériences sont accessibles via une open source, plateforme omic liées à la biologie de l’espace. Nous discutons de la configuration des Habitats rongeurs utilisés pour les missions spatiales, et comment sont traités les tissus de vols spatiaux habités. On décrit aussi comment spaceflight omics données peuvent être découvert et accessible sur GeneLab et comment principaux facteurs à l’origine de la réponse globale aux vols spatiaux habités peut être identifié à36. L’exemple précis, nous allons présenter sur comment ce protocole est implémenté va comparer les différences biologiques survenant chez les rongeurs, abrité au sein d’Habitat rongeur et les contrôles de vivarium qui ont été publiées par Bent et al.,36. Il est important de noter que les contrôles au sol sont essentielles pour rongeurs expériences de vols habités. Comme décrit dans le présent protocole, ces contrôles sont effectués avec les deux conditions identiques (2 conditions de CO, humidité, température, dimensions de la cage, etc.) dans les Habitats de rongeur sur l’ISS et dans des cages de vivarium standard disposant de la norme environnementaux (p. ex., CO2 conditions, l’humidité et température) conditions sur la terre. Les rongeurs logés dans les contrôles de terrain rongeurs Habitat permettent la comparaison directe de rongeurs dans l’espace. Tandis que les rongeurs logés dans des cages de vivarium permettent la comparaison biologique entre les différents logements (p. ex., les cages de vivarium vs matériel rongeurs). L’Habitat rongeur est différente de celle de vivarium cages dans lequel il a débit d’air constant (0,1 à 0,3 m/s), une longue durée et un filtre secondaire d’échappement qui capture et absorbe les déchets animaux guidé vers le filtre d’échappement par circulation d’air continue en microgravité. En outre, Habitats de rongeurs ont des systèmes passifs et l’air ambiant d’admission ; par conséquent, ils ont aussi des concentrations plus élevées de2 CO en raison des niveaux élevés dans la cabine de l’ISS (~ 5 000 ppm).

Protocol

Les protocoles d’animaux pour le logement et le traitement des tissus suivent les directives standards pour les soins aux animaux de laboratoire et ont été approuvés par la NASA de vol et au sol Institutional Animal Care et utilisation comités (IACUC).

1. configuration des Habitats rongeurs

Remarque : Les Habitats de rongeur de la NASA (précédemment AEMs) ont des caractéristiques différentes de la cage de vivarium pour accueillir des opérations dans l’espace (Figure 1).

  1. Maison 10 souris dans chaque Habitat rongeur (jusqu'à 30 g par souris). Maison 5 souris chaque compartiment lorsque l’habitat est configuré en deux compartiments ou 10 souris s’il y a un seul compartiment.
    Remarque : Les Habitats de rongeur de la NASA ont une plus grande surface accessible par les rongeurs que les cages standard vivarium.
  2. Animaux des contrôles au sol, maison souris rongeur habitat à l’intérieur de l’ISS environnement Simulator (ISSES) dans les mêmes conditions environnementales que les animaux de vol, y compris les concentrations de2 CO, température et humidité relative.
  3. Fournir des animaux avec accès ad libitum à personnalisé fait la NASA nutriment amélioré rongeur Foodbars (NuRFB) conformément aux exigences nutritionnelles du Conseil National de recherches (CNRC) pour souris37et grâce à la pression de l’eau activée lixits.
  4. Surveiller la santé des animaux et le comportement qui sera activé dans les Habitats de rongeurs avec les 12:12 h cycle de lumière semblables à vivarium cages en équipement standard avec éclairage LED pendant la journée et l’éclairage infrarouge lors des contrôles de santé vidéo qui se déroulent au cours de le cycle de sombre.
  5. Placez quatre caméras dans les cages de rongeurs Habitat pour le suivi quotidien de la santé et comportement et vidéos recueillent des animaux au cours de la nuit avec un éclairage infrarouge.
  6. Livraison les rongeurs à l’ISS dans un transporteur (Figure 2 b) à bord de la Capsule Dragon ou lanceur similaire.
  7. Faire en sorte que les rongeurs sont observées et examinés par le vétérinaire de vol de la NASA avant d’être chargé dans le transporteur pour le lancement et par les membres de l’équipage formé à leur arrivée à l’ISS et avant le transfert vers des Habitats de rongeur.
  8. Pour cette période de transition, de la maison jusqu'à 20 souris (10 de chaque côté) ou 12 rats dans le transporteur.
    Remarque : Semblable à l’Habitat rongeur, le transporteur est une unité passive pour des conditions environnementales. Pendant cette courte période de transition, ce logement unique pouvant accueillir jusqu'à 20 souris.

2. les rongeurs de manutention pour des expériences de vol spatial

  1. Se procurer des rongeurs de fournisseurs standards.
    Remarque : Après livraison, groupe de rongeurs dans des cages de vivarium standard et ont les animaux à s’acclimater à la NASA NuRFB, lixits et planchers surélevé fil jusqu'à ce que les animaux sont chargés dans le transporteur. Laissant les rongeurs dans les cages permettra les animaux puissent s’adapter naturellement. La manipulation de la souris dans et hors les Habitats de rongeur et cages de vivarium suit des protocoles couramment utilisés pour tous les rongeurs expériences12,27,28. Le système de rongeurs Habitat (Figure 1 a) est utilisé pour les deux mission vol spatial sur les m ISS, respectivement et pour les contrôles au sol simulant des conditions environnementales ISS ou STS.
  2. Pour certaines missions utilisez cages standard vivarium (Figure 1 b) pour le contrôle de vivarium. Utiliser la souris de 5 ou 10 par cage vivarium standard.
  3. Pour les Habitats des rongeurs, placer 10 souris dans deux compartiments différents avec 5 souris chaque compartiment. Supprimer le séparateur de cage pour abriter 10 souris par Habitat dans un compartiment unique.
  4. Utiliser les trois composantes du matériel rongeurs lors de missions de vol spatial comme décrit ci-dessous (Figure 2).
    1. Placer les rongeurs dans un transporteur (Figure 2 b) pour le voyage entre la terre et l’ISS ou vice versa à double densité (10 souris par côté, 20 souris par transporteur).
    2. Une fois sur l’ISS, fixez l’unité d’accès Animal (AUA) (Figure 2) au transporteur. Transférez le transporteur rongeurs aux Habitats à l’aide de boîtes de transfert de souris (VTT) (5 souris par MTB) (Figure 2D).
      Remarque : L’AUA est utilisé pour contenir des produits d’origine animale (p. ex., fèces, urine, fourrure) de se rendre à la cabine de l’ISS.
    3. Détachez l’AUA de transporteur et fixez à l’Habitat rongeur. Puis transférer les animaux du VTT à l’Habitat rongeur (Figure 2 a), où ils résident pour la durée de la mission.
      Remarque : La concentration de2 CO en raison des niveaux élevés dans la cabine de l’ISS pour tous les Habitats de rongeurs est à 5 000 ppm.
  5. Surveiller la température et l’humidité de l’habitat de rongeurs, mais il n’y a aucun contrôle thermique actif. Veiller à ce que l’équipe de recherche rongeur travaille avec ISS pour maintenir et contrôler la température de la cabine, qui détermine la température de l’Habitat de rongeur.
    Remarque : Le cycle de lumière et l’obscurité dans les Habitats de rongeurs produit toutes les 12 h (par exemple, 05:00 à 17 h 00 GMT, s’allume) et l’équipage de l’ISS effectue des changements réguliers et fréquents de la nourriture (hebdomadaire ou bihebdomadaire) et recharges de l’eau (tous les jours ~ 28).

3. l’euthanasie de rongeurs et de traitement des tissus

  1. Pour l’euthanasie, donne rongeur une surdose d’un anesthésique général (kétamine/Xylazine jusqu'à 150/45 mg/kg de corps masse dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate pour un volume total de 0,3 mL) par injection intrapéritonéale (IP) couplée à un secondaire de la méthode d’euthanasie ( dislocation cervicale ou thoracotomie).
  2. Des expériences menées à bord de l’ISS :
    1. Retourner les rongeurs vivent non plus, ou
    2. Euthanasier sur l’ISS.
      1. Congeler des carcasses rongeurs-95 ± 2 ° C dans les congélateurs sur l’ISS et revenir sur terre, sur le véhicule de retour disponible (actuellement capsule de SpaceX Dragon).
      2. Une fois que les rongeurs sont retournés à la terre, disséquer tous les organes et les tissus (, foie, reins, peau, muscles, coeur, rate, yeux, glandes surrénales, poumons et cerveau, c'est-à-dire) et stocker à-80 ° C ou dans l’ARN stabilisant de solution.
  3. Suivez les mêmes procédures et les horaires pour toutes les expériences de contrôle au sol comme l’expérience en vol avec un décalage de 3 à 5 jours pour faire correspondre les données télémétriques de l’ISS.
  4. Des tissus conservés isoler l’ARN, protéine et l’isolement d’ADN à l’aide de protocoles standard qui sont décrites en détail associée à chaque jeu de données sur la plate-forme de GeneLab (genelab.nasa.gov).
    Remarque : Rongeurs tissus non utilisés par l’investigateur principal deviennent partie de la Collection scientifique institutionnel de la NASA. Ces échantillons sont conservés au Ames Research Center (ARC) Non-Human biobanque où ils sont catalogués et mis à la disposition de la demande par la communauté scientifique. On trouvera des tissus disponibles sur le site Public archives de Sciences de la vie données à : https://Lsda.jsc.nasa.gov/Biospecimen.

4. génération Omics données à partir d’ARN, ADN et protéine extrait

  1. De l’extraits macromolécules (ARN, ADN, protéine) utilisent des protocoles standard pour générer des données omique. Elles sont décrites en détail dans les métadonnées de l’étude respective sur GeneLab.

5. GeneLab référentiel et soumettre des données

Remarque : Espace biologie associés omics données sont soumises à la base de données GeneLab. GeneLab accepte et héberge des données spatiales omics financées par plusieurs agences spatiales du monde entier.

  1. Omique de générer des données qui peuvent être hébergées sur le référentiel de GeneLab.
    1. Soumettre les données générées à GeneLab, soit lorsque l’analyse est complète ou basé sur la discrétion de l’enquêteur.
      Remarque : Données soumises aux autres bases de données publiques omics importées et publiées dans le référentiel GeneLab. Données GeneLab généré sont organisées et publiées sans une période d’embargo. GeneLab, plus précisément le Sample Processing Lab, génère des données de diverses expériences de vols habités à l’aide de techniques et protocoles d’extraction optimisée pour augmenter les données omics des expériences de vols spatiaux habités.
  2. Lorsque les données sont prêtes à être soumises, formater et transférer les données et les métadonnées à GeneLab avec la méthode suivante (Supplemental Figure 1) :
    1. Utiliser les outils de ISAcreator pour définir une étude expérimentale et stocker les métadonnées.
      Remarque : ISAcreator l’outil est disponible en téléchargement avec une guidée ici tutoriel38.
    2. Consulter les données listées ici39 pour comprendre les types de données acceptés et formats pour les fichiers de données brutes et traitées.
      1. Pour optimiser le téléchargement et le stockage, compresser des fichiers de données.
    3. Transférer les métadonnées et les données brutes ou traitées aux conservateurs de GeneLab données par le biais de l’espace de travail de40.
    4. Créer un nom d’utilisateur et mot de passe et télécharger les données.
  3. Une fois que les données ont été téléchargées sur l’espace de travail, partage de données à un conservateur GeneLab.
    Remarque : Obtenir la procédure détaillée sur la façon de télécharger et de partager des fichiers se trouvent dans le Guide de présentation de données41.
  4. Chaque présentation est vérifiée par un conservateur et publiée dans le référentiel de GeneLab42.

6. trouver des ensembles de données pour l’analyse à l’aide de fonctions de recherche sur GeneLab

  1. Recherche de différents ensembles de données sur GeneLab en cliquant sur le lien (la Figure 2)38.
    1. Spécifiquement associés à une précédente publication36, recherchez les termes suivants : BRÛLÉES-21, BRÛLÉES-111, BRÛLÉES-25 et BRÛLÉES-63.
  2. Accéder à la page d’accueil de GeneLab en cliquant sur « GeneLab Data System » sur le côté gauche de l’écran.
  3. Entrez les mots clés dans la zone « Rechercher des données » pour rechercher des domaines d’intérêt spécifiques. Dans ce cas chacun des identificateurs suivants dataset entrer séparément : BRÛLÉES-21, BRÛLÉES-111, BRÛLÉES-25 et BRÛLÉES-63.
  4. En plus de rechercher le référentiel GeneLab, chercher à travers d’autres bases de données y compris les NIH GEO, fierté de l’EBI et ANL MG-RAST en sélectionnant les cases souhaitées sous la barre de recherche.
    Remarque : Actuellement uniquement pour le référentiel GeneLab, un utilisateur peut rechercher en utilisant les catégories suivantes de filtres : organismes, Type de test, facteurs et Type de projet.

7. stocker et transférer des fichiers d’intérêt pour l’analyse

Remarque : L’espace de travail GeneLab est conçu pour stocker et transférer des fichiers directement à partir de la base de données GeneLab (Supplemental Figure 3).

  1. Cliquez sur « Espace de travail » sur le dessus le menu Data Systems.
  2. Si nouvel utilisateur, inscrivez-vous pour un nouveau compte.
    Remarque : L’espace de travail GeneLab est propulsé par GenomeSpace43.
  3. Accès des instructions détaillées sur l’utilisation de l’espace de travail en sélectionnant « Aide » dans le menu du haut et cliquez sur Guide de l’utilisateur.
  4. Pour chaque utilisateur, accéder à tous les ensembles de données dans le référentiel GeneLab en sélectionnant le dossier « Public/genelab » dans le menu de gauche.
  5. Copiez les ensembles de données d’intérêt dans un espace de travail de répertoire local en allant dans le dossier avec les données d’intérêt. Faites un clic droit sur le dossier spécifique, sélectionnez « copier/déplacer » dans le menu qui apparaît, sélectionnez le dossier à copier le fichier et puis cliquez sur « copier ».
    1. Trouver les ensembles de données suivants associés à une précédente publication36 en suivant les instructions ci-dessus et copier sur l’espace de travail local : BRÛLÉES-21, BRÛLÉES-111, BRÛLÉES-25 et BRÛLÉES-63.

8. pour accéder aux métadonnées et la Description de chaque étude

Remarque : Les fichiers de métadonnées pour chaque jeu de données dans le référentiel GeneLab sont dans le sous-dossier de dataset « Public/genelab » dans le menu de gauche.

  1. Trouver les informations de métadonnées pour l’ensemble de données d’intérêt en accédant à un ou plusieurs fichiers de métadonnées contenues dans un sous-dossier « métadonnées » de chaque jeu de données. Par exemple, BRÛLÉES-100, il y a 2 fichiers dans le sous-dossier « Public/genelab/BRÛLÉES-100/metadata » : « BRÛLÉES-100_metadata_RR1_BIOBANK-œil-ISA.zip » et « BRÛLÉES-100_metadata_RR1ExpDesign.pdf ».
    1. Veiller à ce que chaque jeu de données est un fichier compressé unique qui fournit des métadonnées selon les spécifications de ISATab (qui subsume le JASMINA, MIAPE et autres normes de cadre MIBBI pour les métadonnées minimales requises). Toujours mettre fin à ce type de nom de fichier dans « ISA.zip ». Par exemple, pour BRÛLÉES-100, ce fichier est « BRÛLÉES-100_metadata_RR1_BIOBANK-œil-ISA.zip ».
  2. Utilisez l' outil de ISACreator44 ou un éditeur de texte pour visualiser et accéder aux métadonnées de ISATab, qui contient le texte descriptif pour les métadonnées d’étude et d’analyse pour chaque dataset.
    Remarque : Dans les métadonnées de ISATab, échantillons sont décrites et associés d’essais biologiques, et essais biologiques sont décrits et liés aux fichiers de données de sortie.
  3. Vérifier la présence des fichiers de données test sortie qui sont situés dans chaque jeu de données dans des sous-dossiers par type de test. Par exemple, BRÛLÉES-100, RNA-Seq sortie test fichiers sont situés dans le « Public/genelab/BRÛLÉES-100/transcriptomique / » dossier.

9. l’analyse des données de GeneLab

Remarque : Différentes canalisations peuvent être implémentées pour diverses données omique. Ici, l’exemple se concentre sur un pipeline de transcriptomique de biologie des systèmes non biaisée qui sert à définir les déterminants « clés » du système à l’étude.

  1. Check publié précédemment littératures36,45,46,47,48,49,50 pour comprendre ce pipeline.
  2. Lorsque vous avez sélectionné un dataset spécifique d’intérêt pour l’analyse, téléchargez les données à un ordinateur local avec la méthode suivante :
    1. Cliquez sur le jeu de données spécifique.
    2. Cliquez sur l’onglet « Fichiers d’étude » à l’extrême gauche des en-têtes.
    3. S’assurer que tous les fichiers de données et les métadonnées sont disponibles dans ce menu.
    4. Pour télécharger chaque fichier, cliquez sur les noms de fichier spécifique.
  3. Pour les ensembles de données microarray qui doit être téléchargé à partir GeneLab, suivez les étapes de prétraitement suivants.
    1. Processus les données brutes pour chaque dataset séparément à l’aide de soustraction du fond et Quantile normalisé à l’aide de RMAExpress51 pour les puces à ADN commerciales.
    2. Créer le principe composant analyse des parcelles à l’aide de R pour déterminer comment étroitement réplique biologique regroupés.
    3. Importer des données dans la visionneuse MultiExperiment52 et calculer les gènes importants tout d’abord en utilisant les statistiques de taux (FDR) fausse découverte commençant par FDR < 0,05. Si aucun gène significative est apparue avec les statistiques FDR, ensuite utiliser t-tests standard commençant avec une valeur p < 0,05 pour déterminer les gènes importants.
    4. Une fois que les gènes réglementés statistiquement significatifs ont été constatés, mettre en place un seuil de pli-changement de ≥ 1,2 ou ≤ -1,2 pour comparer les échantillons expérimentaux avec les contrôles.
  4. Utilisez analyse d’enrichissement Set (gène GSEA)53 pour voie et prédictions fonctionnelles.
    1. Utilisez GSEA soit par le biais de GenePattern54,55, directement par l’intermédiaire de GSEA ou en utilisant l’environnement de programmation R.
    2. Déterminer les voies considérablement réglementées en utilisant les ensembles de gènes suivants : C2, C5 et poinçons.
    3. Effectuer des analyses de pointe sur les ensembles de gène considérablement réglementées et déterminer les gènes de pointe associés à chaque comparaison expérimentale et Gene Set.
    4. Trouver les gènes de pointe qui se chevauchent entre tous le gène définit pour chaque condition expérimentale.
  5. Utilisez une autre plate-forme pour déterminer les fonctions prévues et les voies qui sont significativement réglementés. Dans ce cas utiliser ingéniosité voie analyse (IPA) pour déterminer les régulateurs en amont significatifs, biofunctions et voies canoniques.
    1. Télécharger la liste des gènes avec pli-changement des valeurs pour les gènes statistiquement significatifs à l’étape 9.4.4.
    2. Suivez les instructions de l’IPA pour générer des régulateurs en amont, biofunctions et voies canoniques pour chaque comparaison expérimentale.
    3. Déterminer que le gène associés pour régulateurs en amont, biofunctions et voies canoniques qui ont un activation z-score ≥ 2 (activation indiquée) ou ≤ -2 (indiquant l’inhibition).
    4. Trouver les gènes qui se chevauchent, associés à toutes les prédictions ci-dessus.
  6. Déterminer les gènes communs/chevauchement entre les étapes 9.4 et 9.5.
    Remarque : Ces gènes sont considérés comme les gènes clés/chauffeur contrôle la majorité de l’activité et les fonctions prévues par les conditions expérimentales en cours d’analyse. Des études antérieures ont montré qu’assommant ou promouvoir ces gènes fera la condition expérimentale ou système à l’étude non-fonctionnel45,46,49.
    1. Construire des réseaux par le biais de IPA (ou n’importe quel logiciel de montage de réseau) afin de déterminer la connectivité des gènes.
    2. Considérer le gène plus branché comme point nodal les gènes clés de la conduite.
    3. Pour déterminer la connectivité entre les ensembles de données, groupe de tous les gènes clés en un seul réseau et test de la connectivité répéter pour déterminer le point nodal qui se produit chez tous les gènes clés de tous les ensembles de données analysées.

10. utilisation Interface56 Galaxy sur GeneLab pour analyser les données Transcriptomiques

Remarque : Ici est décrit un protocole pour utiliser l’interface de GeneLab Galaxy (disponible automne 2018) pour analyser les données transcriptomiques de GeneLab. Tutoriels de Galaxy abondent. Tutoriels d’exemple sur la façon d’utiliser la Galaxy sont en général disponibles elesewhere57,58.

  1. Utilisateurs peuvent se connecter à GeneLab à l’aide des informations d’identification de Google ou de la NASA. Outils de GeneLab Galaxy sont trouvent sous le menu « Analyser ».
  2. Suivez ces trois manières d’importer des données à la plate-forme de GeneLab Galaxy.
    1. Télécharger les données du système de fichiers local à l’aide de la fonction « Transférer des données ».
    2. Importer des données de GeneLab GenomeSpace à l’aide de l’outil importer de GenomeSpace sous la section « Obtenir les données ».
      Remarque : Tous les fichiers de données de GeneLab sont disponibles dans le dossier « public », organisé par le numéro d’ordre de dataset (voir ci-dessus).
    3. Importer les données s’affichent dans le « histoire » de la section "analyse" sur le côté droit. Les utilisateurs peuvent avoir des histoires multiples, qui sont gérés en utilisant les boutons « Options de l’historique » ou « Afficher toutes les histoires » en haut du volet de l’histoire.
  3. Outils d’analyse sont répertoriés et consultable sur le côté gauche de l’interface.
  4. Vérifier l’apparition d’ensembles de données qui ont été importés sur l’histoire actuelle.
    Remarque : Beaucoup de détails concernant les données peuvent être consultés pour chaque dataset.
  5. Sélectionnez un outil sur le côté gauche pour remplir un formulaire dans le panneau central, avec des options d’analyse et de spécification des entrées de données. Créer des emplois pour l’exécution de l’analyse en remplissant le formulaire en appuyant sur « Exécuter ».
  6. Vérifier pour les emplois soumis qui sont représentés dans l’histoire et à codes de couleur pour indiquer l’état d’exécution (en file d’attente, en cours d’exécution, dûment remplis, avec ou sans erreurs).
  7. Lier les outils dans le flux de travail complexes. Gérer les flux de travail grâce à des outils que se trouve dans le menu « Workflows ». La figure 3 illustre un exemple de flux créé pour le traitement des données de RNA-seq.
  8. Partager des ensembles de données, des processus et des histoires avec les autres en utilisant le menu « Données partagées ».

Representative Results

Déterminer les facteurs clés de données transcriptomiques spaceflight aidera la NASA avec la détermination des risques pour la santé et le développement de contre-mesures possibles pour lutter contre les effets négatifs sur la santé des astronautes. Dans notre publication récente, nous avons suivi les étapes ci-dessus et utilisé GeneLab datasets pour démontrer avec succès un roman de trouver que les concentrations de CO2 sur l’ISS peuvent influer santé36. Nous avons aussi utilisé la technique ci-dessus dans d’autres études pour déterminer avec succès les facteurs clés du système étant étudiés45,46,47,48,49,50 . Ici, nous allons montrer comment les résultats de l’utilisation de ce protocole peuvent être utilisés avec succès pour déterminer les principaux facteurs.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés principalement sur les différences biologiques qui se produisent chez les rongeurs, logés dans les contrôles de terrain rongeur habitudes et les contrôles de vivarium. Comme décrit ci-dessus, c’est la clé pour mieux comprendre ces deux habitats, qui nous fournira des renseignements sur les facteurs de confusion possibles qui peuvent influer sur la santé en raison de l’environnement sur l’ISS. Pour toutes les expériences de vols habités rongeurs, ces contrôles au sol sont également essentiels pour déterminer quels facteurs biologiques sont associés directement avec les vols spatiaux habités ou en raison des conditions environnementales sur l’ISS. Comme indiqué dans le protocole, les conditions environnementales pour l’habitat de vivarium ne sont pas exposée à un niveau supérieur de2 CO qui est présent pour l’Habitat rongeur. L’habitat de vivarium a la teneur en CO2 normale qui est présente sur la terre (actuellement 300 à 380 ppm). La température et l’humidité pour les deux habitats sont similaires.

Nous avons utilisé les ensembles de données suivants de la plate-forme GeneLab pour déterminer les gènes clés entre les rongeurs logés dans l’Habitat rongeur sol contrôles et contrôles de sol vivarium qui sont chargés de conduire les différences entre les deux types d’habitats : BRÛLÉES-21, BRÛLÉES-111, BRÛLÉES-25 et BRÛLÉES-63. Analyse pour déterminer les gènes significatives a été réalisée comme décrit plus haut entre l’Habitat rongeur (précédemment AEM) et des contrôles de vivarium indépendamment pour chaque jeu de données. Groupement de parcelles a montré PCA de biologique réplique (Figure 4 montre que l’APC parcelles BRÛLÉES-21). Partir des données prétraitées, nous avons déterminé les gènes de pointe chez les différents ensembles de gènes GSEA. En utilisant les gènes avec 1,2 fois-changement (log2), nous étions en mesure de prédire les gènes impliqués avec les prédictions pour les régulateurs en amont, les voies canoniques et biofunctions. Pour chaque jeu de données nous avons alors trouvé les gènes communs/chevauchement impliqués pour tous les gènes (Figure 5). Ces gènes sont maintenant considérés comme conduire la réponse entre les rongeurs dans les Habitats de rongeur (ou AEM) et des contrôles de vivarium. Réseau de représentation de comment connecter ces gènes clés montre que les moyeux centrales pour chaque dataset étant analysé (Figure 6). Par exemple, MAPK1 est la plaque tournante pour STS-108 tissus des muscles squelettiques des souris (Figure 6 a). Cela serait interprété comme le gène qui est le moteur les gènes clés et, très probablement, l’acteur central pour avoir causé des différences biologiques pour souris logés dans des Habitats de rongeur versus les cages du vivarium. Dans nos travaux précédents, nous discutons comment ces gènes clés sont associés à la réponse2 CO de la littérature scientifique existante et comment ces gènes peuvent être responsables de changements biologiques observées chez les souris36.

Adoptant une approche de biologie des systèmes, nous avons ensuite déterminé un régulateur « maître » qui relie tous les ensembles de données/tissus et est potentiellement responsable d’universal effets biologiques chez les rongeurs, abrité au sein d’AEMs comparées aux cages de vivarium. Cela a été fait par la détermination du gène de tous les ensembles de données qui est le plus branché lors de la construction d’un réseau de tous les gènes clés. Nous avons pu montrer que MAPK1 est le plus branché de gène et de la plaque tournante de tous les gènes clés (Figure 7). Pour confirmer que si le MAPK1 pourrait être responsable de changements biologiques chez les souris de CO2 supérieurs à AEMs, nous avons examiné par le biais de la littérature scientifique pour preuve à l’appui. Nous avons trouvé plusieurs études indiquant la corrélation des MAPK1 avec le CO259 et hypoxie19,60,61.

Figure 1
Figure 1 : L’Habitat rongeur (précédemment AEM) par rapport à la cage vivarium. (A) Image de la cage de l’AEM fournie par la NASA (crédits : NASA/Dominic Hart). (B) la cage vivarium standard qui est actuellement utilisé (photo prise par notre laboratoire). Ce chiffre a été modifié par Bent et al.,36. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Le rongeur Habitat ferrure avec les trois modules différents impliqués pendant le transport vers et depuis les missions spatiales. Le module de gauche (A) est le module d’Habitat rongeur (précédemment AEM), le module central (B) est le transporteur et le module de droit (C) est l’unité d’accès Animal (AUA). (D) La boîte de transfert de souris (MTB). (Crédits : NASA/Dominic Hart). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple de flux analyse qui peut être utilisé dans l’interface de GeneLab Galaxy pour traiter les données RNA-seq. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4
Figure 4 : Principal analyse en composantes (PCA) représentant dataset après les étapes de prétraitement. Dataset BRÛLÉES-21 pour AEM vs vivarium cage est montré pour le muscle squelettique murin de la mission STS-118. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Diagramme de Venn représentant quels gènes clés sont déterminées à l’aide des outils de prédiction de voie différents. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 6
Figure 6 : Les gènes clés déterminées pour toutes les conditions et les tissus murins entre l’AEM vs . cages vivarium. (A.-e.) Représentation du réseau des gènes clés pour chaque dataset/rongeur des tissus. 2 pli-modifications du journal (avec un seuil de 1,2 fois-changement) à l’expression de gène ont été utilisés pour obtenir les différentes nuances de vert de pli-changement dans les gènes réprimés, alors que les différentes nuances de rouge représentent des pli-changement dans les gènes surexprimés. Le plus sombre la nuance de vert ou rouge, plus le pli-changement. Ce chiffre a été modifié par Bent et al.,36. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Déterminer le « régulateur maître » pour rongeurs dans le logement de rongeurs Habitat par rapport aux cages vivarium. Connexions entre tous les gènes clés individuelles (Figure 6) ont été déterminées et affichées comme un réseau par le biais de IPA. Réseau est représenté comme un complot radial avec le gène clé plus branché, MAPK1, dans le centre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1: intégration de GeneLab-GenomeSpace avec ISACreator pour rationaliser les opérations de traitement des données. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre. 

Supplémentaire Figure 2: capture d’écran de GeneLab de recherches à l’aide Fédération/intégration avec les bases de données externes hétérogènes bioinformatique (GEO, fierté, MG-RAST). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre

Supplemental Figure 3: capture d’écran de l’espace de travail collaboratif GeneLab montrant à l’utilisateur compte de gestion et contrôles d’accès (p. ex., des dossiers privés, partagés, publics).  S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre

Discussion

La plate-forme de la NASA GeneLab est une plateforme de base de données et l’analyse d’omics complet qui permettra à la communauté scientifique générer de nouvelles hypothèses relies à la biologie spatiale. Ici, nous avons présenté une procédure globale pour rongeurs expériences depuis le début des vols habités à la génération de la nouvelle hypothèse de l’analyse des données utilisant une plateforme de biologie d’espace accessible au public. En outre, nous avons également fourni un vaste protocole sur une analyse de biologie des systèmes non biaisée pour identifier les gènes clés conduire le système à l’étude. Nous avons utilisé notre récente étude36 comme un exemple de comment le présent protocole est effectivement utilisé pour générer une nouvelle hypothèse pour la biologie de l’espace. Nous espérons que cela aide les enquêteurs de mieux comprendre comment les expériences de vols habités sont appliquées et comment les données de leur part conduisent les données disponibles sur GeneLab et finalement permettre une interprétation plus claire des publiquement disponible espace biologie omics données.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans notre protocole concernant les expériences de vols habités rongeurs et analyse des données produites. Comprendre l’Habitat rongeur installation est essentielle pour développer et concevoir l’expérience optimale pour les vols spatiaux habités. Plus précisément, cela entraînerait le protocole et la description que nous avons fourni à l’étape 1 de notre protocole. Une fois que l’enquêteur comprend parfaitement les différentes conditions existant dans les Habitats de rongeur par rapport aux cages de vivarium, le bilan biologique étant interprétée peut être corrélée correctement aux conditions environnementales dans l’espace. Dans les ajouts, modifications de l’Habitat rongeur ne peuvent se faire, puisque l’Habitat rongeur a été optimale conçu et approuvé par la NASA pour des vols spatiaux.

Pour interpréter les résultats biologiques, nous avons fourni un protocole complet sur chaque étape a consisté de télétransmettre vos données sur GeneLab à l’analyse des données pour générer la nouvelle biologie spatiale hypothèse. Bien que toutes les étapes sont importantes pour comprendre comment générer des données, des opérations plus critiques pour l’analyse des données sont les étapes 9 et 10. Étape 9 fournit un protocole pour analyser des données transcriptomiques en utilisant une méthode de biologie des systèmes impartiale pour déterminer les gènes et des sentiers qui conduisent vraiment la condition expérimentale étant analysée. Étape 10 est critique car il offre aux utilisateurs une méthode facile pour analyser les omiques GeneLab ensembles de données à l’aide de la plateforme GeneLab. Modifications au protocole fourni peuvent être effectuées pour des mesures en ce qui concerne l’analyse des données. Plus précisément, les étapes 9.4 – 9,6 peuvent se faire à l’aide de la programmation R ou autres outils préférés que l’utilisateur préfère. Selon le groupe de données, les différentes statistiques et seuils de pli-changement peuvent servir à déterminer les gènes considérablement réglementées. En outre, pour déterminer les gènes clés en étapes 9.5 et 9.6, l’utilisateur peut modifier le présent protocole et utiliser tout outil qui utilise les gènes considérablement réglementées afin de prédire les fonctions. Le concept important est qu’à l’aide de multiples outils prédictifs omics fonctionnelle permet pour la détermination des gènes impliqué avec la plupart des fonctions réglementées dans le système à l’étude.

La plate-forme GeneLab continue à développer et alors que les analyses décrites ici ont été réalisées après le téléchargement de données, la prochaine phase de GeneLab permettra d’analyse des omiques données directement sur la plateforme GeneLab, qui fournit un flux de travail facile à générer le traitement des données pour l’analyse d’ordre supérieur. En outre, alors que nous nous sommes concentrés sur un protocole pour l’interprétation des données transcriptomiques, GeneLab contient une grande variété de données omics y compris protéomique, génomique, métabolomique et épigénomique. La plate-forme éventuelle contiendra les pipelines et les lignes directrices pour l’analyse de ces différents types d’omique. La dernière phase du GeneLab sera également implémenter une interface de visualisation de niveau système pour permettre à l’utilisateur de base générer facilement des hypothèses de biologie spatiale.

Enfin, notre analyse de biologie des systèmes fournit une méthode unique et impartiale pour déterminer la clé conduite des gènes et des sentiers dans n’importe quel système étudiée l’utilisation de datasets omique. Nous avons utilisé cette méthode dans plusieurs différentes études indépendantes avec beaucoup de succès pour déterminer les principaux facteurs impliqués36,45,46,47,48,49 ,,50. Dans un cancer du sein liés omics étude, en utilisant cette méthode, nous avons validé expérimentalement que nos sentiers/gènes clés prévus roulaient effectivement la réponse au traitement médicamenteux en assommant les gènes clés en vitro45. Nous avons observé, comme nous l’avions prévu par le présent protocole, que le traitement n’était pas efficace plus en raison de l’absence des gènes clés. Nous pensons que ce protocole de biologie des systèmes non biaisée peut être un outil utile pour déterminer les voies principales pour toute étude d’omique.

Ce protocole fournit une méthode rapide et efficace pour la génération de nouveaux espace biologie hypothèses. Les données générées de GeneLab peuvent être exploitées par les enquêteurs pour les futures possibilités de financement et validation expérimentale des cibles potentielles pour le développement de contre-mesures contre les radiations en microgravité et l’espace. Le protocole fourni ici permettra à des investigations futures biologie spatiale assorti d’une efficacité optimale pour permettre des missions spatiales à long terme sans danger.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Alison Français à la NASA Ames Life Science Data Archive pour son aide à l’obtention de la vidéo en relation avec les Habitats des rongeurs et aide globale avec l’obtention d’informations connexes en cage. Nous aimerions également remercier Marla Smithwick au Ames Research Center de la NASA pour son aide à obtenir l’information adéquate. Recherche a été financé par le projet de GeneLab à la NASA Ames Research Center, via le programme de biologie spatiale de la NASA dans la Division of Life de l’espace et les Sciences physiques recherche et les Applications (SLPSRA). Toute utilisation des noms commerciaux est uniquement à des fins descriptives et n’implique pas l’approbation par le gouvernement américain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratoy C57BL/6J C57BL/6 mice were used for datasets related to Rodent Research-1 experiments
BALB/C Mice Taconic BALB BALB/C mice were used for datasets related to Rodent Research-3 experiments
Vivarium Cages Charles River Laboratory Standard murine cages purchased from Charles River Laboratory
Rodent Habitat NASA This cage and all components are built internally at NASA
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 RNAlater is used to store the tissue for further RNA isolation

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Beheshti, A., Shirazi-Fard, Y.,… More

Beheshti, A., Shirazi-Fard, Y., Choi, S., Berrios, D., Gebre, S. G., Galazka, J. M., Costes, S. V. Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform. J. Vis. Exp. (143), e58447, doi:10.3791/58447 (2019).

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