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Genetics

利用开放接入美国宇航局基因实验室平台探索航天对小鼠生理的影响

Published: January 13, 2019 doi: 10.3791/58447
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 2, 2
1WYLE Labs, Space Biosciences Division, NASA Ames Research Center, 2Space Biosciences Division, NASA Ames Research Center, 3USRA, NASA Ames Research Center

Summary

美国宇航局基因实验室平台提供了不受限制地获取来自生物太空飞行实验的珍贵组学数据的途径。我们描述了典型的鼠标实验是如何在太空中进行的, 以及如何访问和分析这些实验的数据。

Abstract

在空间进行生物实验需要特殊的便利和程序, 以确保有效和高效地进行这些调查。此外, 鉴于这些实验很少, 必须最大限度地扩大其影响。组学技术的迅速发展为大幅增加从宝贵的航天标本中产生的数据量提供了机会。为了利用这一点, 美国宇航局开发了 genelab 平台, 以便不受限制地获取航天组学数据, 并鼓励其广泛分析。老鼠 (包括老鼠和老鼠) 是科学家用来调查与空间有关的生物影响的常见模型生物。在太空飞行过程中, 饲养啮齿类动物的圈地被称为啮齿类动物栖息地 (前动物外壳模块), 在尺寸、气流以及获得水和食物方面与标准的 vivarium 笼子有很大的不同。此外, 由于国际空间站 (iss) 的环境和大气条件, 动物接触到较高的二氧化碳浓度.我们最近报告说, 啮齿类动物栖息地的老鼠在转录组中经历了巨大的变化, 无论动物是在地面上还是在太空中。此外, 这些变化与缺氧反应一致, 可能是由较高的二氧化碳浓度驱动的 。在这里, 我们描述了典型的啮齿类动物实验是如何在太空中进行的, 如何通过 genelab 平台访问这些实验中的组学数据, 以及如何识别这些数据中的关键因素。利用这一过程, 任何个人都可以作出关键的发现, 改变未来空间飞行任务和活动的设计。

Introduction

本手稿的总体目标是提供一个清晰的方法, 说明如何使用 nasa 的 genelab 平台1 , 以及如何将在太空中进行的啮齿动物实验转化为组学数据进行分析。太空生物面临着许多来自改变的重力场、空间辐射、与地球的隔离以及其他敌对环境因素的健康风险 2、3、4、5、6.在空间和地面进行的生物实验有助于界定和量化这些风险7、8、9、10、11、12,13,14. 在空间, 这些实验是在国际空间站、航天飞机和其他轨道平台上进行的。鉴于在空间进行实验的独特关切, 包括乘员时间有限和微重力环境, 进行这些实验需要专门的硬件和方法。现在有各种平台可以利用植物、动物和微生物模型15 在太空进行复杂的实验。

啮齿类动物模型对于促进我们了解包括人类在内的哺乳动物对太空飞行的反应特别重要。其中包括航天对肌肉结构16、17、18 和免疫功能19、20、21 的影响。用于在地球上容纳啮齿类动物的标准维变种笼子不适合进行太空飞行实验22,23。因此, 多年来, 老鼠被空运并安置在各种笼子里, 包括日本宇宙航空研究开发机构 (日本宇宙航空研究开发机构) 生境笼子 24, 这些动物携带空间舱用于 biong-m1 俄罗斯无人卫星25 ,26,27, 老鼠抽屉系统 (mds) 设计的意大利航天局 28,29, 30, 美国宇航局动物外壳模块 (aem), 现在的美国宇航局啮老鼠运输车和栖息地23。啮齿类动物实验首先在航天飞机上开始, 使用的笼子被称为动物外壳模块 (aem)。该硬件用于23航天飞机上的27次啮齿类动物实验.aem 最初是为航天飞机上相对较短的实验而开发的 (< 20天)。自国际空间站发展以来, 对 am 进行了长时间的修改, 现在被称为啮7号动物生境 22、23.新的啮齿类动物栖息地旨在使用 "可扩展空间站 (express) 机架" 接口支持国际空间站的长期飞行任务。啮齿类动物栖息地在尺寸、气流、过滤器和排气系统以及获得食物和水方面与标准的活体保持架有很大的不同 (图 1)。然而, 这种硬件已被证明是一个有效的研究平台, 使关键的见解空间飞行引起的变化, 哺乳动物的生理 19,31,32, 33 ,34,35,36。

现在可以从生物航天实验中产生大量的组学数据, 包括与啮齿类动物进行的实验。最近, 这些组学实验的数据已通过 nasa genelab 平台1公开, 该平台是一个全面的数据存储库和分析平台, 任何人都可以从太空飞行实验中得出假设。genelab 提供了用于发现、访问、共享和分析数据的工具。我们利用基因实验室数据集显示, 标准的病毒网箱和太空中使用的专门啮齿类动物生境之间的差异导致小鼠转录组的巨大差异 36.我们分析了四种不同的公开数据集, 比较了位于啮齿类动物栖息地或标准病毒笼中的啮齿类动物的不同组织。通过无偏出的系统生物学分析, 我们确定, 由于 iss 中二氧化碳浓度较高导致二氧化碳浓度较高, 导致 co 含量升高, 导致低氧反应, 因此改变的主要驱动因素和途径与缺氧反应一致。2浓度在啮齿类动物栖息地, 因为他们是被动系统, 采取在周围的空气。这说明了科学家如何利用开源工具和数据生成新的发现, 并暗示国际空间站的环境如何影响航天员的健康。

在这里, 我们描述了如何在空间中进行啮齿动物实验, 以及如何通过与空间生物学相关的开源、组学平台访问这些实验中的数据。我们讨论了用于空间飞行任务的啮罗斯生境的配置, 以及如何处理航天组织。我们还描述了如何在 genelab 上发现和访问航天组学数据, 以及如何确定驱动对航天整体反应的关键因素 36.我们将介绍关于如何执行该议定书的具体例子, 将比较位于啮齿类动物栖息地的啮齿类动物的生物差异和 beheshti 等人发表的 vivarium 控制.需要注意的是, 地面控制对于航天啮齿类动物实验至关重要。如本协议所述, 这些控制是在国际空间站上的啮齿类动物栖息地和具有标准标准的标准 vivarium 笼子中, 在两个相同的条件下进行的 (即二氧化碳条件、湿度、温度、网箱尺寸等)。环境 (即二氧化碳条件、湿度和温度).位于啮齿动物栖息地控制装置中的啮齿类动物可以直接与太空中的啮齿类动物进行比较。而啮齿类动物被安置在 vivarium 笼子中, 可以对不同的外壳进行生物比较 (例如, vivarium 笼子与啮齿类动物硬件)。啮齿类动物栖息地不同于病毒保持架, 因为它具有恒定的气流 (0.1–0.3 m)、长时间和辅助排气过滤器, 该过滤器通过微重力下的连续气流捕获和吸收引导到排气过滤器的动物废物。此外, 啮齿类动物栖息地有被动系统和进气环境空气;因此, 由于国际空间站机舱内的浓度较高 (约为 5, 000 ppm), 它们的 co2 浓度也较高。

Protocol

住房和组织加工的动物规程遵循实验动物护理的标准准则, 并已获得美国宇航局飞行和地面机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准。

1. 啮齿类动物栖息地的配置

请注意:nasa 啮齿类动物栖息地 (以前是 aems) 与 vivarium 保持架具有不同的特性, 可用于空间作业 (图 1)。

  1. 在每个啮齿类动物栖息地的10只老鼠 (每只老鼠最多30克)。每隔间有5只老鼠, 当栖息地被配置成两个隔间或10只老鼠, 如果有一个单独的隔间。
    请注意:美国宇航局啮齿类动物栖息地有一个更大的可接近的表面积每个啮齿类动物比标准的 vivarium 笼子。
  2. 对于地面控制动物, 在与飞行动物 (包括 co2 浓度、温度和相对湿度) 相同的环境条件下, 国际空间站环境模拟器 ( ses) 内的啮齿类动物栖息地的家鼠。
  3. 根据国家研究委员会 (nrc) 对老鼠37的营养要求, 向动物提供定制的美国航天局营养升级啮齿类动物食品条 (nrrfb), 并通过压力活化脂灰石浇水。
  4. 在进行视频健康检查期间, 用12:12h 的光周期监控动物的健康和行为, 类似于标准设施中的 vivarium 笼子, 白天有 led 照明, 红外照明黑暗的循环。
  5. 在啮齿类动物栖息地的笼子里放置四个摄像头, 用于日常监测动物的健康和行为, 并在夜间使用红外照明收集视频。
  6. 用龙胶囊或类似的运载火箭将啮齿动物用运输机 (图 2b) 运送到国际空间站。
  7. 确保在美国宇航局飞行兽医将这些啮齿类动物装载到运输车上发射之前, 并由受过训练的机组人员在抵达国际空间站和转移到啮齿类动物生境之前对它们进行观察和检查。
  8. 在这个过渡期, 最多容纳20只老鼠 (每只每只 10只) 或12只老鼠在运输者中。
    请注意:与啮齿类动物栖息地类似, 运输车是环境条件的被动单元。在这个短暂的过渡期内, 这个单基最多可以容纳 2 0只老鼠。

2. 航天实验中的啮鼠处理

  1. 从标准供应商处采购啮齿类动物。
    请注意:在交付之后, 小组啮齿类动物在标准 vivarium 笼子内, 并且有动物适应美国航空航天局 nurfb, lixits, 并且提出导线地板, 直到动物被装载入运输车。把啮齿类动物留在笼子里, 可以让动物自然地适应。老鼠进出啮齿动物栖息地和活体保持着通常用于所有啮齿类动物实验12、27、28的处理方案。啮罗特人居系统 (图 1a) 将分别用于 sts 和 iss 上的航天飞行任务, 以及模拟基础设施服务部门或 sts 环境条件的地面控制。
  2. 对于某些任务, 使用标准的 vivarium 保持架 (图 1b) 进行 vivarium 控制。每个标准的病毒笼使用5或10只老鼠。
  3. 对于啮齿类动物的栖息地, 将10只老鼠放在两个不同的隔间里, 每个隔间有5只老鼠。取下笼子分隔线, 将每个栖息地的10只老鼠安置在一个单独的隔间中。
  4. 在太空飞行任务期间利用啮齿类动物硬件的三个组成部分, 如下所述 (图 2)。
    1. 将啮齿动物放入运输车中 (图 2b), 用于在地球和国际空间站之间的飞行, 反之亦然, 密度为双密度 (每侧10只老鼠, 每台运输机20只老鼠)。
    2. 进入国际空间站后, 将动物进入装置 (aau) (图 2c) 连接到运输车上。使用鼠标转移箱 (mtb) 将啮齿类动物从运输器转移到生境 (每个 mtb 5只老鼠) (图 2d)。
      请注意: aau 用于包含任何动物产品 (如粪便、尿液 、毛皮)。
    3. 将 aau 从运输车上拆下, 并附着在啮齿类动物栖息地。然后将动物从 mtb 转移到它们在任务期间居住的啮齿类动物栖息地 (图 2a)。
      请注意:所有啮齿类动物栖息地的国际空间站舱内的二氧化碳浓度均为5000ppm。
  5. 监测啮齿类动物栖息地的温度和湿度, 但没有主动的热控制。确保啮齿类动物研究小组与国际空间站合作, 维护和控制机舱温度, 这决定了啮齿类动物栖息地的温度。
    请注意:啮齿类动物生境的光明和黑暗周期每12小时发生一次 (例如,格林尼治标准时间5:00 至 17:00, 开灯), 国际空间站机组人员会定期频繁地更换食物 (每周或每两周一次), 并补充水 (每 ~ 28天)。

3. 啮齿动物的安乐死和加工组织

  1. 对于安乐死, 通过腹腔注射 (ip) 与安乐死的次要方法 (颈椎脱位或开胸手术)。
  2. 对于在国际空间站上进行的实验:
    1. 返回啮齿类动物要么活着, 要么
    2. 在国际空间站上安乐死。
      1. 将啮齿动物尸体冷冻在国际空间站的冰柜中-95±2°c, 然后乘坐可用的返回飞行器 (目前为 spacex 龙舱) 返回地球。
      2. 一旦啮齿类动物返回地球, 解剖所有器官和组织 (即肝脏、肾脏、皮肤、肌肉、心脏、脾脏、眼睛、肾上腺、肺和大脑), 并储存在-80°c 或 rna 稳定溶液中。
  3. 在所有控制地面实验中, 遵循与飞行实验相同的程序和时间, 每3-5天的偏移量与 iss 遥测数据相匹配。
  4. 使用与 genelab 平台 (genelab.nasa.gov) 上的每个数据集相关的标准协议, 从保存的组织中分离出 rna、蛋白质和 dna。
    请注意:主要调查员没有使用的啮齿类动物组织成为美国宇航局机构科学收藏的一部分。这些样本储存在艾姆斯研究中心 (arc) 的非人类生物库中, 在那里对其进行编目, 并提供给科学界的请求。可用的组织可以在生命科学数据档案公共网站上找到: https://Lsda.jsc.nasa.gov/Biospecimen。

4. 从 rna、dna 和蛋白质提取物中生成组学数据

  1. 从提取的大分子 (rna, dna, 蛋白质) 使用标准的协议来生成组学数据。这些都在相关的 genelab 研究元数据中详细介绍。

5. 基因实验室存储库和提交数据

请注意:与空间生物学相关的组学数据被提交给基因实验室数据存储库。genelab 接受并托管由世界各地多个空间机构资助的与空间有关的组学数据。

  1. 生成可托管在 genelab 存储库中的与组学相关的数据。
    1. 在分析完成或根据调查人员的判断时, 将生成的数据提交给 genelab。
      请注意:提交给其他公共组学数据库的数据将被导入并发布到 genelab 存储库中。genelab 生成的数据在没有禁运期的情况下进行管理和公布。genelab, 特别是样品处理实验室, 利用优化的提取协议和技术从各种航天实验中生成数据, 以增加来自航天实验的组学数据。
  2. 当数据准备好提交时, 请使用以下方法格式化元数据和数据传输到 genelab (补充图 1):
    1. 使用 isa 创建者工具定义实验研究并存储元数据。
      请注意: isa 创建者工具可在这里下载一个有指导的教程38。
    2. 请参考此处列出的数据 39, 以了解原始数据和处理数据文件的可接受数据类型和格式。
      1. 要优化上传和存储, 请压缩数据文件。
    3. 通过工作区40将元数据和原始数据或已处理的数据传输到 genelab 数据传送器。
    4. 创建用户名和密码并上传数据。
  3. 将数据上载到工作区后, 将数据共享给 genelab 策展人。
    请注意:有关如何上传和共享文件的详细步骤, 请参阅《数据提交指南》 41。
  4. 每个提交都由策展人进行验证, 并在 genelab 存储库42中发布。

6. 使用 genellab 上的搜索功能查找用于分析的数据集

  1. 通过转到链接 (补充图 2) 38, 在 genelab 上搜索不同的数据集。
    1. 具体与以前的出版物36相关的是, 搜索以下术语: glds-21、glds-111、glds-25 和 glds-63。
  2. 点击屏幕左侧的 "genelab 数据系统" 访问 genelab 主页。
  3. 在 "搜索数据" 框中输入关键字以搜索特定感兴趣的区域。在这种情况下, 分别输入以下每个数据集标识符: glds-21、glds-111、glds-25 和 glds-63。
  4. 除了搜索 genelab 存储库外, 还通过在搜索栏下选择所需的复选框, 跨其他数据库进行搜索, 包括 nih geo、ebi 骄傲和 anl mg-raast。
    请注意:目前, 仅针对 genelab 存储库, 用户可以使用以下筛选器类别进行搜索: "生物"、"检测类型"、"因素" 和 "项目类型"。

7. 存储和转移感兴趣的文件进行分析

请注意:genelab 工作区旨在直接从 genellab 数据库存储和传输文件 (补充图 3)。

  1. 点击 "数据系统" 菜单顶部的 "工作区"。
  2. 如果是新用户, 请注册新帐户。
    请注意:genelab 工作区由 genomespace43提供动力。
  3. 通过选择顶部菜单上的 "帮助" 并单击《用户指南》, 访问有关如何使用工作区的详细说明。
  4. 对于每个用户, 通过选择左侧菜单上的 "public/genelab" 文件夹来访问 genelab 存储库中的所有数据集。
  5. 通过转到具有感兴趣数据的文件夹, 将感兴趣的数据集复制到本地目录工作区。右键单击特定文件, 在出现的菜单中选择 "复制/移动", 选择要将文件复制到的文件夹, 然后单击 "复制"。
    1. 按照上述说明, 查找与以前出版物36相关的以下数据集, 并复制到本地工作区: glds-21、glds-111、glds-25 和 glds-63。

8. 访问元数据和每个研究的描述

请注意:genelab 存储库中每个数据集的元数据文件位于左侧菜单上的 "public/genelab" 数据集子文件夹中。

  1. 通过访问每个数据集的 "元数据" 子文件夹中包含的一个或多个元数据文件, 查找感兴趣的数据集的元数据信息。例如, 对于 glds-100, "public/genelab/glds-100 元数据" 子文件夹中有2个文件: "glds-100_metadata_RR1_BIOBANK-eye-isa. zip" 和 "glds-100_metadata_RR1ExpDesign.pdf"。
    1. 确保每个数据集都有一个压缩文件, 该文件根据 isatab 规范提供元数据 (该规范包括 miame、miape 和其他 mibbi 框架标准, 以满足最低元数据要求)。始终在 "isa. zip" 中结束这种类型的文件名。例如, 对于 glds-100, 此文件是 "glds-100_metadata_RR1_BIOBANK-eye-isa. zip"。
  2. 使用 isa9:reager工具44或文本编辑器可视化和访问 isatab 元数据, 其中包含每个数据集的研究和分析元数据的文本说明。
    请注意:在 isatab 元数据中, 样本被描述并与生物检测相关联, 生物检测被描述并与输出数据文件相关联。
  3. 按检测类型检查子文件夹中每个数据集中的输出分析数据文件是否存在。例如, 对于 glds-100, rna-seq 输出分析文件位于 "public/genelab/gldd-100/转录组/" 文件夹中。

9. 基因实验室数据分析

请注意:可以为各种组学数据实现各种管道。在这里, 具体的例子集中在一个无偏见的系统生物学转录管道, 用于确定正在研究的系统的 "关键驱动因素"。

  1. 查看以前发表的文献36、45、46、47、48、49、50来了解此管道。
  2. 选择感兴趣的特定数据集进行分析后, 请使用以下方法将数据下载到本地计算机:
    1. 单击特定的数据集。
    2. 点击标题最左侧的 "学习文件" 选项卡。
    3. 确保此菜单中的所有数据文件和元数据都可用。
    4. 要下载每个文件, 请单击特定的文件名。
  3. 对于将从 genelab 下载的微阵列数据集, 请使用以下预处理步骤。
    1. 使用后台减法和使用商业微阵列 rmaexpress51 规范化的量数分别处理每个数据集的原始数据。
    2. 使用 r 创建主成分分析 (pca) 图, 以确定生物复制组合在一起的紧密程度。
    3. 将数据导入到多实验查看器52 , 并首先使用从 fdr < 0.05 开始的假发现率 (fdr) 统计信息计算重要基因。如果 fdr 统计数据没有出现重要基因, 则使用从 p 值 < 0.05 开始的标准 t 测试来确定重要基因。
    4. 一旦确定了具有统计学意义的调控基因, 实施≥1.2 或≤-1.2 的折叠变化截止点, 将实验样本与对照组进行比较。
  4. 使用基因集丰富分析 (gsea)53进行途径和功能预测。
    1. 通过 gen修订本54、55、直接通过 gsea 或使用 r 编程环境使用 gsea。
    2. 使用以下基因集确定显著调控的途径: c2、c5 和标记。
    3. 对显著调控的基因集进行边缘分析, 并确定与每个实验比较和基因集相关的边缘基因。
    4. 找到每个实验条件的所有基因集合之间重叠的前沿基因。
  5. 使用另一个平台来确定被显著调节的预测功能和路径。在这种情况下, 使用独创性路径分析 (ipa) 来确定重要的上游调节器、生物功能和规范路径。
    1. 上传9.4.4 步骤确定的具有统计学意义基因的具有褶皱变化值的基因列表。
    2. 按照 ipa 的指示, 为每个实验比较生成上游调节器、生物功能和规范路径。
    3. 确定与上游调节剂、生物功能和具有激活 z-分数≥2 (指示激活) 或≤2 (表示抑制) 的规范途径相关的基因。
    4. 找到与上述所有预测相关的重叠基因。
  6. 确定步骤9.4 和9.5 之间的共同重叠基因。
    请注意:这些基因被认为是控制大多数预测功能和活动的关键驱动基因, 并对实验条件进行分析。先前的研究表明, 淘汰或推广这些基因将使实验条件或系统被研究为非功能 45,46,49。
    1. 通过 ipa (或任何网络组装软件) 构建网络, 以确定基因的连通性。
    2. 考虑到连接最紧密的基因是驱动关键基因的中心枢纽。
    3. 若要确定数据集之间的连接, 请将所有关键基因分组到一个网络中, 并重复连接测试, 以确定在所分析的所有数据集中的所有关键基因中发生的中心集线器。

10. 在基因实验室上使用 galaxy56接口分析转录组数据

请注意:这里描述了一个使用 genelab galaxy 接口 (2018年秋季提供) 来分析 genelab 转录数据的协议。银河教程比比皆是。关于如何使用 galaxy 的示例教程一般是在哪里57,58。

  1. 用户可以使用 google 或美国宇航局的凭据登录 genelab。genelab galaxy 工具位于 "分析" 菜单下。
  2. 按照这三种方式将数据引入 genelab galaxy 平台。
    1. 使用 "上传数据" 功能从本地文件系统上传数据。
    2. 使用 genomespace 导入工具在 "获取数据" 部分下从 genelab genomespace 导入数据。
      请注意:所有 genelab 数据文件都可在 "公用" 文件夹中使用, 按数据集加入号组织 (见上文)。
    3. 导入数据显示在右侧分析部分的 "历史记录" 中。用户可以有多个历史记录, 这些历史记录使用历史记录窗格顶部的 "历史记录选项" 或 "查看所有历史记录" 按钮进行管理。
  3. 分析工具在界面左侧列出并可搜索。
  4. 检查当前历史记录上已导入的数据集的外观。
    请注意:有关数据的许多详细信息可供检查每个数据集。
  5. 选择左侧的工具, 在中心面板中填充窗体, 并提供用于分析和规范数据输入的选项。通过填写表单并按 "执行" 来创建用于执行分析的作业。
  6. 检查已提交的作业, 这些作业在历史记录中表示, 并进行颜色编码, 以指示执行状态 (排队、执行、完成或不出错)。
  7. 将工具链接到复杂的工作流中。通过 "工作流" 菜单中的工具管理工作流。图 3显示了为处理 rna-seq 数据而创建的示例工作流。
  8. 使用 "共享数据" 菜单与他人共享数据集、工作流和历史记录。

Representative Results

从航天转录数据中确定关键驱动因素将有助于美国航天局确定健康风险和制定潜在对策, 以消除对宇航员健康的负面影响。在我们最近的出版物中, 我们遵循了上述步骤, 并利用 genelab 数据集成功地显示了一个新的发现, 即国际空间站上的二氧化碳浓度会影响健康36。我们还在其他研究中使用了上述技术, 成功地确定了推动该系统研究的关键因素 45、46、47、48、49、50.在这里, 我们将展示如何成功地使用使用此协议的结果来确定关键驱动程序。

在这项研究中, 我们主要集中在发生在啮齿类动物习惯地面控制和病毒控制的啮齿类动物的生物差异。如上所述, 这是更好地了解这两个生境的关键, 这将为我们提供信息, 说明可能因国际空间站环境而影响健康的复杂因素。对于所有啮齿类动物的空间飞行实验, 这些地面控制对于确定哪些生物因素与空间飞行直接相关或由于国际空间站的环境条件也是必不可少的。如议定书所述, vivarium 生境的环境条件不会暴露在啮齿类动物栖息地的较高的 co2 水平。vivarium 栖息地具有地球上存在的正常 co2 水平 (目前为300至 380 ppm)。两个生境的温度和湿度相似。

我们使用 genelab 平台中的以下数据集来确定位于啮齿类动物栖息地控制和病毒地面控制中的啮齿类动物之间的关键基因, 这些控制是导致两个生境之间差异的原因: glds-21,glds-111、glds-25 和 glds-63。对每个数据集的啮齿类动物栖息地 (以前为 aem) 和病毒控制进行了上述分析, 以确定重要的基因。pca 图显示了生物复制的分组 (图 4显示了 grds-21 的 pca 图)。从预处理的数据中, 我们确定了不同 gsea 基因集合的前沿基因。利用具有 1.2-折叠变化的基因 (日志2), 我们能够预测与上游调节剂、规范途径和生物功能预测相关的基因。然后, 对于每个数据集, 我们发现了所有基因所涉及的常见重叠基因 (图 5)。这些基因现在被认为是驱动啮齿类动物栖息地 (或 aem) 和病毒控制的啮齿类动物之间的反应。这些关键基因如何连接的网络表示显示了正在分析的每个数据集的中心中心 (图 6)。例如, mapk1 是小鼠 sts-108 骨骼肌组织的中心枢纽 (图 6a)。这将被解释为驱动关键基因的基因, 很可能是导致老鼠与活体笼子的老鼠生物差异的核心角色。在我们之前的研究中, 我们讨论了这些关键基因如何与现有科学文献中的二氧化碳反应有关, 以及这些基因如何对在36小鼠身上观察到的生物变化负责。

接下来, 我们采用系统生物学方法, 确定了一个连接所有数据表组织的 "主调节器", 并对处于 aem 中的啮齿类动物与 vivarium 笼子相比的普遍生物效应负有潜在的责任。这是通过确定所有数据集中的基因来实现的, 这些数据集在从所有关键基因构建网络时连接最紧密。我们能够证明, 从所有关键基因中, mapk1 是连接最紧密的基因和中心枢纽 (图 7)。为了确认 mapk1 是否可能对 aems中二氧化碳含量较高的小鼠的生物变化负责, 我们通过科学文献寻找佐证。我们发现了几项研究表明 mapk1 与 co259和缺氧19, 60,61的相关性。

Figure 1
图 1: 啮齿类动物栖息地 (原 aem) 与 vivarium 网箱相比.(a) 美国航天局提供的 aem 笼子图像 (credite:nasaa/dominic hart)。(b) 目前使用的标准病毒笼 (我们实验室拍摄的照片)。beheshti 等人对这一数字作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2* 啮罗斯人居硬件系统, 在往返空间飞行任务的运输过程中涉及三个不同的模块.左边的模块 (a) 是啮罗斯人居模块 (以前的 aem), 中心模块 (b) 是运输器, 右边的模块 (c) 是动物访问单元 (aau)。(d)鼠标传输框 (mtb)。(学分: nasa过来-dominic hart)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:示例分析工作流, 可用于 genelab galaxy 接口处理 rna-seq 数据.请点击这里查看此图的较大版本. 

Figure 4
图 4: 预处理步骤后具有代表性的数据集的主成分分析 (pca).为 aem 和 vivarium 笼显示了 sts-118 任务中的小鼠骨骼肌的 glds-21 数据集。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:维恩图, 表示使用不同的路径预测工具确定了哪些关键基因.请点击这里查看此图的较大版本. 

Figure 6
图 6: 在 aem 与动物组织之间的所有条件和小鼠组织中确定的关键基因.维维瓦里笼子.(A-E)每个示波组织的关键基因的网络表示。日志2折叠改变 (截止 1.2-折叠改变) 的基因表达被用来获得不同的绿色的颜色为折叠变化在被规的基因, 而不同的红色描述折叠变化在被压缩的基因。绿色或红色的阴影越深, 折叠变化就越大。beheshti 等人对这一数字作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7* 确定啮齿类动物栖息地中啮齿动物的 "主调节器", 并与 vivarium 笼进行比较.所有单个关键基因之间的连接 (图 6) 是通过 ipa 确定并显示为网络的。网络表示为中心连接最紧密的关键基因 mapk1 的径向图。请点击这里查看此图的较大版本.

补充图 1: 与 isa9:er 进行 genedable-genemospace 集成, 以简化数据处理操作. 请点击此处下载此图.

补充图 2: 使用联邦/集成与异构生物信息学外部数据库 (geo、pride、mg-raast) 进行搜索的 genelab 搜索的屏幕截图.请点击此处下载此图

补充图 3: 显示用户帐户管理和访问控制 (例如, 专用、共享、公用文件夹) 的 genelab 协作工作区的屏幕截图 。请点击此处下载此图

Discussion

美国宇航局基因实验室平台是一个全面的组学数据库和分析平台, 将使科学界能够产生与空间生物学有关的新假设。本文提出了从航天开始到新假设产生的广泛的啮齿类动物实验程序, 从利用公开的空间生物学平台分析数据。此外, 我们还提供了一个广泛的协议, 关于无偏见的系统生物学分析, 以确定关键基因驱动的系统正在研究。我们利用我们最近的研究36作为一个例子, 说明如何有效地利用这一协议来产生一个新的空间生物学假设。我们希望这有助于调查人员更好地了解空间实验是如何进行的, 以及其中的数据如何导致基因实验室上的数据, 并最终能够更清楚地解释公开获得的空间生物学数据。

在我们的协议中, 有几个关键步骤涉及啮齿类动物航天实验和所产生数据的分析。了解啮齿类动物栖息地的设置对于开发和设计最佳的航天实验至关重要。这将特别包含我们在协议的步骤1中提供的协议和描述。一旦调查人员充分了解啮齿类动物生境与活体网箱之间存在的不同条件, 所解释的生物结果就可以与空间的环境条件适当相关。此外, 由于美国航天局对啮罗应生境进行了优化设计并批准了用于空间飞行的改良, 因此无法对啮罗应栖息地进行改造。

为了解释生物结果, 我们在从将数据上传到 genelab 到分析数据以生成新的空间生物学假设的每一步都提供了一个完整的协议。尽管所有步骤对于了解如何生成数据都很重要, 但数据分析最关键的步骤是步骤9和10。步骤9提供了一种协议, 用于使用无偏的系统生物学方法分析转录过程数据, 以确定真正驱动实验条件被分析的基因路径。步骤10至关重要, 因为它为用户提供了一种使用 genelab 平台分析组学基因实验室数据集的简单方法。对于有关分析数据的一些步骤, 可以对所提供的协议进行修改。具体来说, 步骤9.4-9.6 可以使用 r 编程或用户喜欢的任何其他喜爱的工具来完成。根据数据集的不同, 可以使用不同的统计数据和折叠更改截止时间来确定受显著调控的基因。此外, 为了确定步骤9.5 和9.6 中的关键基因, 用户可以修改此协议, 并使用任何利用显著调控基因的工具来预测功能。重要的概念是, 使用多重预测功能组学工具可以确定与所研究系统中调节的大多数功能有关的基因。

genelab 平台继续开发, 虽然此处描述的分析是在数据下载后执行的, 但 genelab 的下一阶段将允许直接在 genelab 平台上分析组学数据, 这将提供一个轻松的工作流程来生成用于高阶分析的处理数据。此外, 虽然我们专注于解释转录性数据的协议, 而基因实验室包含了各种各样的组学数据, 包括蛋白质组学、基因组、代谢组学和表观基因组数据。最终的平台将包含分析这些不同类型的组学的管道和指南。genelab 的最后一个阶段还将实现系统级可视化界面, 使基本用户能够轻松生成空间生物学假设。

最后, 我们的系统生物学分析提供了一种独特和公正的方法来确定使用组学数据集进行研究的任何系统的关键驱动途径。我们在几项不同的独立研究中使用了这一方法, 并取得了很大成功, 以确定涉及36、45、46、47、48、49的关键驱动因素 ,50。在一项与癌症相关的组学研究中, 我们用这种方法实验验证了我们预测的关键基因途径实际上是通过在体外敲掉关键基因45来推动药物治疗反应的。正如我们通过这一协议所预测的, 我们观察到, 由于缺乏关键基因, 这种治疗已经无效。我们相信, 这种无偏见的系统生物学协议可以成为一个有用的工具, 以确定任何组学研究的关键途径。

该协议为生成新的空间生物学假设提供了一种快速有效的方法。调查人员可以利用 genelab 产生的数据, 为今后的供资机会、实验验证以及制定针对微重力和空间辐射的对策的潜在目标提供资金。这里提供的议定书将允许今后以最佳效率进行空间生物学调查, 以便进行安全的长期空间飞行任务。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢美国宇航局艾姆斯生命科学数据档案馆的艾莉森法语, 感谢她在获取与啮罗斯栖息地有关的视频方面提供的协助, 并在获取笼子相关信息方面提供了总体帮助。我们还要感谢美国宇航局艾姆斯研究中心的玛拉史密斯威克帮助获得了适当的信息。美国航天局艾姆斯研究中心的 genelab 项目通过美国航天局在空间生命和物理科学研究和应用司的空间生物学方案提供了研究资金。任何使用商品名称的目的都只是为了描述性的目的, 并不意味着美国政府的认可。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratoy C57BL/6J C57BL/6 mice were used for datasets related to Rodent Research-1 experiments
BALB/C Mice Taconic BALB BALB/C mice were used for datasets related to Rodent Research-3 experiments
Vivarium Cages Charles River Laboratory Standard murine cages purchased from Charles River Laboratory
Rodent Habitat NASA This cage and all components are built internally at NASA
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 RNAlater is used to store the tissue for further RNA isolation

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References

  1. GeneLab. , genelab.nasa.gov (2018).
  2. Cortese, F. Vive la radioresistance!: converging research in radiobiology and biogerontology to enhance human radioresistance for deep space exploration and colonization. Oncotarget. 9 (18), 14692-14722 (2018).
  3. Beheshti, A. NASA GeneLab Project: Bridging Space Radiation Omics with Ground Studies. Radiation Research. , (2018).
  4. Fernandez-Gonzalo, R., Baatout, S., Moreels, M. Impact of Particle Irradiation on the Immune System: From the Clinic to Mars. Frontiers in Immunology. 8, 177 (2017).
  5. Bloomfield, S. A., Martinez, D. A., Boudreaux, R. D., Mantri, A. V. Microgravity Stress: Bone and Connective Tissue. Comprehensive Physiology. 6, 645-686 (2016).
  6. Giuliani, A. High-Resolution X-Ray Tomography: A 3D Exploration Into the Skeletal Architecture in Mouse Models Submitted to Microgravity Constraints. Frontiers in Physiology. 9, 181 (2018).
  7. Boice, J. D. Jr The Final Frontier-Research Relevant to Mars. Health Physics. 112 (4), 392-397 (2017).
  8. Chancellor, J. C. Limitations in predicting the space radiation health risk for exploration astronauts. NPJ Microgravity. 4, 8 (2018).
  9. Cucinotta, F. A. Space radiation risks for astronauts on multiple International Space Station missions. PLoS One. 9 (4), e96099 (2014).
  10. Cucinotta, F. A. Review of NASA approach to space radiation risk assessments for Mars exploration. Health Physics. 108 (2), 131-142 (2015).
  11. Frippiat, J. P. Towards human exploration of space: The THESEUS review series on immunology research priorities. NPJ Microgravity. 2, 16040 (2016).
  12. Goel, N. Effects of sex and gender on adaptation to space: behavioral health. Journal of Women's Health (Larchmt). 23 (11), 975-986 (2014).
  13. Mortazavi, S. M. J., Bevelacqua, J. J., Fornalski, K. W., Welsh, J., Doss, M. Comments on "Space: The Final Frontier-Research Relevant to Mars". Health Physics. 114 (3), 344-345 (2018).
  14. Blottner, D. Morphological, physiological and behavioural evaluation of a 'Mice in Space' housing system. Journal of Comparative Physiology B. 179 (4), 519-533 (2009).
  15. Karouia, F., Peyvan, K., Pohorille, A. Toward biotechnology in space: High-throughput instruments for in situ biological research beyond Earth. Biotechnology Advances. 35 (7), 905-932 (2017).
  16. Shen, H. Effects of spaceflight on the muscles of the murine shoulder. The FASEB Journal. 31 (12), 5466-5477 (2017).
  17. Spatz, J. M. Sclerostin antibody inhibits skeletal deterioration in mice exposed to partial weight-bearing. Life Sciences in Space Research (Amst). 12, 32-38 (2017).
  18. Tascher, G. Proteome-wide Adaptations of Mouse Skeletal Muscles during a Full Month in Space. Journal of Proteome Research. 16 (7), 2623-2638 (2017).
  19. Pecaut, M. J. Is spaceflight-induced immune dysfunction linked to systemic changes in metabolism? PLoS One. 12 (5), e0174174 (2017).
  20. Ward, C. Effects of spaceflight on the immunoglobulin repertoire of unimmunized C57BL/6 mice. Life Sciences in Space Research (Amst). 16, 63-75 (2018).
  21. Rettig, T. A., Ward, C., Pecaut, M. J., Chapes, S. K. Validation of Methods to Assess the Immunoglobulin Gene Repertoire in Tissues Obtained from Mice on the International Space Station. Gravitational and Space Research. 5 (1), 2-23 (2017).
  22. Allen, D. L. Effects of spaceflight on murine skeletal muscle gene expression. Journal of Applied Physiology (1985). 106 (2), 582-595 (2009).
  23. Moyer, E. L. Evaluation of rodent spaceflight in the NASA animal enclosure module for an extended operational period (up to 35 days). NPJ Microgravity. 2, 16002 (2016).
  24. Shimbo, M. Ground-based assessment of JAXA mouse habitat cage unit by mouse phenotypic studies. Experimental Animals. 65 (2), 175-187 (2016).
  25. Aseyev, N. Adaptive Changes in the Vestibular System of Land Snail to a 30-Day Spaceflight and Readaptation on Return to Earth. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 348 (2017).
  26. Markina, E., Andreeva, E., Andrianova, I., Sotnezova, E., Buravkova, L. Stromal and Hematopoietic Progenitors from C57/BI/6N Murine Bone Marrow After 30-Day "BION-M1" Spaceflight. Stem Cells and Development. , (2018).
  27. Radugina, E. A. Exposure to microgravity for 30 days onboard Bion M1 caused muscle atrophy and impaired regeneration in murine femoral Quadriceps. Life Sciences in Space Research (Amst). 16, 18-25 (2018).
  28. Albi, E. Reinterpretation of mouse thyroid changes under space conditions: the contribution of confinement to damage. Astrobiology. 14 (7), 563-567 (2014).
  29. Cancedda, R. The Mice Drawer System (MDS) experiment and the space endurance record-breaking mice. PLoS One. 7 (5), e32243 (2012).
  30. Neutelings, T. Skin physiology in microgravity: a 3-month stay aboard ISS induces dermal atrophy and affects cutaneous muscle and hair follicles cycling in mice. NPJ Microgravity. 1, 15002 (2015).
  31. Anselm, V., Novikova, S., Zgoda, V. Re-adaption on Earth after Spaceflights Affects the Mouse Liver Proteome. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), (2017).
  32. Baqai, F. P. Effects of spaceflight on innate immune function and antioxidant gene expression. Journal of Applied Physiology (1985). 106 (6), 1935-1942 (2009).
  33. Blaber, E. A., Pecaut, M. J., Jonscher, K. R. Spaceflight Activates Autophagy Programs and the Proteasome in Mouse Liver. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  34. Jonscher, K. R. Spaceflight Activates Lipotoxic Pathways in Mouse Liver. PLoS One. 11 (4), e0152877 (2016).
  35. Moskaleva, N. Spaceflight Effects on Cytochrome P450 Content in Mouse Liver. PLoS One. 10 (11), e0142374 (2015).
  36. Beheshti, A., Cekanaviciute, E., Smith, D. J., Costes, S. V. Global transcriptomic analysis suggests carbon dioxide as an environmental stressor in spaceflight: A systems biology GeneLab case study. Scientific Reports. 8 (1), 4191 (2018).
  37. National Resource Council. Nutrient Requirements of Laboratory Animals, Fourth Revised Edition, 1995. , The National Academies Press. (1995).
  38. NASA GeneLab Data System. , https://genelab-data.ndc.nasa.gov/genelab/ (2018).
  39. GeneLab FAQ. , https://genelab.nasa.gov/faq/#6 (2018).
  40. GeneLab Workspace. , https://genelab.nasa.gov/faq/#6 (2017).
  41. GeneLab Data Submission Guide. , https://genelab-data.ndc.nasa.gov/genelab/help/GeneLab_Submission_Guide_2.0.pdf (2017).
  42. GeneLab repository. , https://genelab-data.ndc.nasa.gov/genelab/projects (2017).
  43. Qu, K. Integrative genomic analysis by interoperation of bioinformatics tools in GenomeSpace. Nature Methods. 13 (3), 245-247 (2016).
  44. ISACreator. , https://isa-tools.org/category/isacreator/index.html (2014).
  45. Ravi, D. Proteasomal Inhibition by Ixazomib Induces CHK1 and MYC-Dependent Cell Death in T-cell and Hodgkin Lymphoma. Cancer Research. 76 (11), 3319-3331 (2016).
  46. Wage, J. Proton irradiation impacts age-driven modulations of cancer progression influenced by immune system transcriptome modifications from splenic tissue. Journal of Radiation Research. 56 (5), 792-803 (2015).
  47. Beheshti, A. Tumor-host signaling interaction reveals a systemic, age-dependent splenic immune influence on tumor development. Oncotarget. 6 (34), 35419-35432 (2015).
  48. Beheshti, A., Neuberg, D., McDonald, J. T., Vanderburg, C. R., Evens, A. M. The Impact of Age and Sex in DLBCL: Systems Biology Analyses Identify Distinct Molecular Changes and Signaling Networks. Cancer Informatics. 14, 141-148 (2015).
  49. Beheshti, A. Host age is a systemic regulator of gene expression impacting cancer progression. Cancer Research. 75 (6), 1134-1143 (2015).
  50. Beheshti, A., Peluso, M., Lamont, C., Hahnfeldt, P., Hlatky, L. Proton irradiation augments the suppression of tumor progression observed with advanced age. Radiation Research. 181 (3), 272-283 (2014).
  51. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).
  52. Saeed, A. I. TM4 microarray software suite. Methods in Enzymology. 411, 134-193 (2006).
  53. Subramanian, A. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  54. Kuehn, H., Liberzon, A., Reich, M., Mesirov, J. P. Using GenePattern for gene expression analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 7 Unit 7 12 (2008).
  55. Reich, M. GenePattern 2.0. Nature Genetics. 38 (5), 500-501 (2006).
  56. Afgan, E. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  57. Introduction to Genomics and Galaxy. , http://galaxyproject.github.io/training-material/topics/introduction/tutorials/galaxy-intro-strands/tutorial.html (2018).
  58. Galaxy 101. , http://galaxyproject.github.io/training-material/topics/introduction/tutorials/galaxy-intro-101/tutorial.html (2018).
  59. Xu, Y. J., Elimban, V., Dhalla, N. S. Suppression of phosphorylated MAPK and caspase 3 by carbon dioxide. Molecular and Cellular Biochemistry. 436 (1-2), 23-28 (2017).
  60. Sang, N. MAPK signaling up-regulates the activity of hypoxia-inducible factors by its effects on p300. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14013-14019 (2003).
  61. Seta, K. A., Kim, R., Kim, H. W., Millhorn, D. E., Beitner-Johnson, D. Hypoxia-induced regulation of MAPK phosphatase-1 as identified by subtractive suppression hybridization and cDNA microarray analysis. Journal of Biological Chemistry. 276 (48), 44405-44412 (2001).

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利用开放接入美国宇航局基因实验室平台探索航天对小鼠生理的影响
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Beheshti, A., Shirazi-Fard, Y., Choi, S., Berrios, D., Gebre, S. G., Galazka, J. M., Costes, S. V. Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform. J. Vis. Exp. (143), e58447, doi:10.3791/58447 (2019).

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