Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

doi: 10.3791/58464 Published: December 14, 2018

Summary

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Abstract

Erythroid hücre bağlılık ve farklılaşma etkinleştirmesi belirleme ve faktörler olgunlaşması hücre kaderi bir grup tarafından düzenledi lineage tarafından kısıtlanmış transkripsiyon ağ üzerinden devam etmek. Biz daha önce faktörler doğrudan lineage fibroblastlar indüklenen erythroid ataları/öncüleri (iEPs) yeniden programlama kullanarak kırmızı kan hücresi geliştirme talimat için gerekli en az sayıda tanımlamak için yola çıktı. Biz bu overexpression Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc (GTLM) hızlı bir şekilde dönüştürmek fare ve insan fibroblast doğrudan bona fide erythroid hücre morfolojisi, açısından benzer iEPs için olabilir gösterdi fenotip, ve gen ekspresyonu. Biz iEPs arttığından ve hücre kader düzenleme eğitim için paha biçilmez bir araç sağlamak niyetindeyim. Burada fare kuyruk ucu fibroblastlar (DLR) yeniden programlama iEPs üzerinden transkripsiyon faktörü uygulamalı doğrudan lineage dönüştürme kademeli işlemi açıklanmaktadır. Bu örnekte, biz fibroblastlar gelen sarı floresan protein (YFP) erythroid hücre görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör gen (EpoR) düzenleyici kontrolü altında hızlı erythroid soy izleme fareler içinde yeniden programlama yapmak yeniden programlama üzerine kader indüksiyon. Bu iletişim kuralı fibroblastlar beş-sekiz gün içinde iEPs programlanabilir.

Gelişmeler hala süreci için yapılabilir iken, biz GTLM-aracılı yeniden programlama hızlı ve doğrudan bir süreç, bona fide özelliklerini içeren hücreleri erythroid yaratıcı ve öncü hücreleri verimli gösteriyor ki.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kırmızı kan hücreleri (RBCs) tüm omurgalıların gereklidir ve tüm hücreleri insan organları%184'yapmak. Yetişkin yaşam için gelen embriyonik, sağlığımız çok RBC homeostazı tam regülasyonu bağlıdır. Olgun RBCs geliştirme yetişkinlik boyunca devam eden üretim arttığından bilinir. RBC geliştirme ve ilkel ve kesin arttığından arasında geçiş alacak ana düzenleyiciler tanımlamak için arttığından araştırma büyük bir sorun olduğunu. Doğrudan soy erythroid ataları yeniden şekillendirmek için daha erythroid geliştirme içinde vivoanlamak için bir fırsat sunuyor.

Doğrudan soy da transdifferentiation bilinen (DLR), yeniden programlama pluripotent ve multipotent progenitör aşamaları atlayarak bir hücre tipi doğrudan içine başka yeniden programlama işlemidir. DLR, sinirsel2, hematopoetik3,4,5, hepatik6 ve nefrotik7, progenitör hücre de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri üretmek için şu ana kadar kullanılmıştır. Gelişimsel biyologlar için DLR lineage bağlılık ve terminal farklılaşma işlemler8,9sorgulama yönleri için önemli bir araç haline gelmiştir. DLR tamamlayan ve kısmen in vivo çalışmalar anlayış mekanizmaları hücre kader geliştirme sırasında faktörlerin belirlenmesi için değiştirin. Bu raporda açıklanan erythroid ataları yeniden programlama için DLR protokol alanı arttığından gelişim çalışmaları için ücretsiz bir yöntem sağlar.

Daha önce dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast doğrudan bağlı erythroid ataları için yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermiştir (iEPs) 10. erythroid GTLM yeniden programlanan hücreler büyük ölçüde bona fide ilkel erythroid ataları morfoloji, fenotip ve gen ifade10açısından benzer. Böylece iEPs nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesi sınırlı ve çekirdekli eritrositler geçici kesin arttığından başlangıcından önce erken embriyo üretilen benzer olgun. (Örneğin, nokta faktörler veya diğer faktörlerin yanı sıra yeniden programlama içinde mutasyonlar) programlama koşullarında değişiklikler yaparak, biri nasıl bu erythroid geliştirme ve farklılaşma değişikliklere neden anlayabiliyorum. Biz örneğin Klf1 veya Myb eklenmesi için GTLM kokteyl globin ifade deseninin ağırlıklı olarak embriyonik (ilkel) değişiklikleri için esas olarak yetişkin göstermiştir (kesin). Bu bulgu DLR arttığından gelişimsel faktörleri tanımlamak için bir araç olarak kullanarak geçerlilik doğruluyor.

Burada, iEPs fare kuyruk ucu fibroblastlar (TTF) oluşturma işlemine anahat. Temsilcisi sonuçlarımızda fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Rosa26 odağı tüm gelen sarı floresan protein (eYFP) ifade bu hücreleri erythroid soy bağlılık kolay görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör ifade ettiler. Bu yöntemi kullanarak, YFP pozitif (EpoR +) hücrelerinin beş gün sonra iletim gibi erken mevcut. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, erythroid ataları vitroüretimi için hızlı ve sağlam bir teknik sunar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. kuruluş ve bakım birincil fare kuyruk Fibroblast kültürler İpucu

  1. % 0.1 jelatin ile yüzeyini örten ve bulaşıkları yaklaşık 20 dk 37 ° C'de için kuluçka (10 cm çanak bir kuyruk için tavsiye) jelatin kaplı yemekleri hazırlamak Çanak jelatin çözümden Aspire edin ve en az 2 h için kurumasını bekleyin.
  2. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. Kuyruk kuyruk tabanında kesme makasla kaldırın. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) kuyrukta % 2 fetal Sığır serum ile (FBS) kullanıma hazır kadar koymak.
    Not: en iyi sonuç için kuyrukları yaklaşık 6-8 hafta-in yaş fareler alınmalıdır. Kuyrukları fareler 8 hafta-in yaş, ancak, büyük fareler yaş, fibroblast proliferasyonu kapasitesini ve azalma11yeniden programlama verimliliğini olarak alınabilir.
  3. Doku kültürü başlıklı steril koşullarda bu protokolün tüm sonraki adımları uygulayın. %0,02 tripsin-EDTA DPBS içinde seyreltilmiş tripsin çözeltisi hazırlamak ve 5 mL kaplamasız 10 cm çanak içine ekleyin.
  4. Kuyruk, % 70 etanol ilk, sonra DPBS yıkayın. Bir tabak içinde kuyruk düz ve forseps yerde tutmak için kullanın. Bir kesik ucuna tabanından boyuna ekseni boyunca kuyruk üzerinde olun.
  5. Kuyruk forseps bir çift ile kavramak ve dikey olarak tutun. Forseps ikinci bir çifti kullanarak, cilt üssünde kesik kuyruk yanında kavrama ve geri soyma. Belgili tanımlık kesme her iki tarafında, cildi aşağı kuyruk ucuna doğru çekerek soyulmuş kadar bunu.
  6. Soyulmuş kuyruk forseps ile tripsin solüsyon içeren çanak üzerinde tutun ve kuyruk yaklaşık 1 cm uzun parçalar halinde kesin. Tripsin çözümde kuyruk taşlarla parçaları daha küçük parçalar halinde parçalara ayırması makas kullanın. Kuyruk parçalar için 10 dk. 37 ° C'de tripsin çözümde kuluçkaya.
    Not: Küçük parçalar böylece her parça için hacim oranı yüksek bir yüzey alanı sağlamak için tercih edilmektedir.
  7. Fibroblast genişleme (FEX) Orta 2 birimleri kullanma tripsin gidermek (yüksek glikoz Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) % 15 ile FBS, 2 mM L-glutamin, Sigara-esansiyel amino asitler (NEAA) ve 100 U/mL penisilin/streptomisin).
  8. 50 mL tüp ve 4 ° C'de 5 min için 350 × g , santrifüj çanak tüm içeriğini toplamak Süpernatant Aspire edin ve kuyruk parçaları 10 mL taze FEX orta resuspend.
  9. Jelatin kaplı yemek için kuyruk parçaları orta aktarmak ve % 5 CO2 ve %4 O2taze FEX Orta 2 günde ekleme, 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: 5-7 gün sonra çanak alt kısmında kuyruk parçaları eklediyseniz ve onlardan uzak hareket fibroblastlar görülebilir.
  10. Fibroblastlar kümeleri fark sonra yavaşça kuyruk parçaları çıkarmak ve orta ve plaka bağlı fibroblastlar bırakarak tüm kemik parçaları Aspire çanağı sallamak. Yeni FEX orta ekleyin ve fibroblastlar birleşmesi kadar kültür.
  11. Fibroblastlar hematopoetik ataları tarafından hiçbir kirlenme emin olmak için 5 dakika için 1 x tripsin-EDTA kullanarak plaka hücrelerden ayırmak ve hücreleri toplamak. Hematopoetik işaretleri ifade hücreler için tüketmek (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 ve Ter-119) kullanarak bir manyetik ayırma sistemi10.

2. retrovirüsü üretim

  1. Tohum retroviral ambalaj hücreleri yaklaşık 2.5 × 104 hücreleri/cm2 (2.0 × 106 hücre 10 cm yemek için) bir çanak (tarafından elektrik-gaz plazma) doku kültürü tedavi ve geceleme yüksek glikoz DMEM % 10 ile kültür FBS, 10 mM sodyum Pyruvate ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C ve % 5 CO2.
  2. Ertesi sabah, orta yarım birimi gecede kültür için kullanılan (10 cm yemek için 5 mL) kullanan hiçbir katkı maddesi ile DMEM için değiştirin. Öğleden sonra kontrol edin hücreleri % 70-80 birleşmesi ve transfection başlar.
  3. Programlama her faktör için Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc, ifade vektör (pMX) ve Yardımcısı vektör (gag ve pol genleri içeren) 2:1 karışımı hazırlayın. Fibroblastlar 10 cm fincan için 6 µg ifade vektör ve yardımcı vektör DMEM ortamda 100 µL son bir hacim içinde 3 µg kullanın.
  4. Programlama her faktör için steril bir polistren tüp içinde oda sıcaklığında (RT) DMEM 300 µL hazırlamak ve ticari transfection reaktif 27 µL dikkatle ekleyin.
    Not: Transfection reaktif RT için kullanmadan önce getirilmelidir ve bahçedeki elektrostatik özellikleri bu tüp Plastik duvara sopa yapabilir gibi doğrudan orta eklenmesi gerekir.
  5. Plazmid karışımı transfection reaktif içeren Tüp, kısaca girdap içine ekleyin ve transfection reaktif-DNA karışımı 15 dakika RT. kısaca girdap karışımı, kuluçkaya ve dropwise retroviral ambalaj hücrelere ekleyin böylece transfection reaktif-DNA karışımı kültür üzerinde eşit olarak yayılmış ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  6. 24 h transfection sonra DMEM için % 20 ile orta değiştirmek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin. 48 h transfection sonra süpernatant toplamak ve 0,22 µm gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre.
    Not: Viral supernatants-80 ° C-dondurulmuş ve iletim taze viral süpernatant kullanılırsa daha verimli olmasına rağmen gerekli kadar tutulur.

3. GTLM iletim ve IEP hasat

  1. Kuyruk ön kaplamalı jelatin %0,1 1 × 104 hücreleri/cm2 fibroblastlar ipucu tohum FEX ortamda yemekleri ve 24 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. Ertesi gün, aşağıdaki gibi bir iletim karışımı hazırlayın.
    1. 1 4 µg/mL ile retroviral enfeksiyon reaktif (% 40) desteklenen programlama her faktör için viral süpernatant hacmi FEX Orta (%60) 6 cilt için ekleyin.
    2. Fibroblastlar 10 cm fincan için 1 mL her viral süpernatant ekleyin (4 × virüs 4 mL =) 10 mL iletim karışımı toplam verilmesi 4 µg/mL retroviral enfeksiyon reaktif FEX orta, 6 ml ile desteklenmiştir.
  3. Fibroblast kültür ortamından FEX Aspire edin ve iletim karışımı ile değiştirin. İletim (%5 CO2 ve %4 O2) hipoksik koşullarda 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.
  4. İletim karışımı Aspire edin ve eski yerine koymak o ile taze programlama Orta (Serum-Alerjik genişleme Orta (SFEM), U/mLPenicillin/streptomisin 100, 100 ng/mL fare kök hücre faktör (mSCF), 10 ng/mL fare interlökin-3 (IL3), 2 U/mL insan rekombinant Eritropoietin (hrEPO) ve 100 nM deksametazon).
  5. 8 günlüğüneonda taze programlama Orta 2 günde ekleme hipoksik koşullarda 37 ° C için kuluçkaya. Beş-sekiz gün sonra başarılı yeniden programlama plaka ayırdıktan hücre kümeleri ortaya çıkarır.
  6. Analiz için programlanmış hücreleri toplamak için yavaşça yukarı ve aşağı onları yemek doğrudan hasat için pipet. Karşılaştırma için untransduced fibroblastlar hasat için 1 x tripsin-EDTA kullanarak plaka hücrelerden ayırmak ve toplamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada iEPs gelen yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı DLR kullanarak üretim için tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Akış Sitometresi, koloni oluşturan deneyleri ve gen kullanarak hücre yeniden programlama değerlendirmek ifade analizi. Görselleştirme erythroid hücre kaderi dönüşüm yardımcı olmak amacıyla, fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Sarı floresan protein (eYFP) ifade eritropoetin reseptör (Epor, endojen Epor odağı bir gen çaldı Cre) hızlı tüm hücrelerdeki Rosa26 odağı gelen transkript onların geliştirme12,13 ( herhangi bir aşamada Şekil 1A). Başarılı, yeniden programlama erythroid ataları indüklenen sonra YFP pozitif (EpoR +) observable beş gün sonra iletim gibi erken hücrelerdir. Yeniden programlama, 5 gün hücreleri yuvarlak haline plaka yüzeyinden kaldırın ve kümeleri şekillendirme başlar. Gün 5-iEPs görüntülemek karakteristik Merkez çekirdeği, kaba kromatin ve mavi sitoplazma Mayıs-Grünwald-Giemsa sonra özelliği bir erythroid habercisi gibi morfoloji (Şekil 1C) boyama. Bazı hücrelerin hemoglobinization olumlu benzidine boyama ve zaman pelleted hafif kırmızı bir görünüm tarafından açıkça (Şekil 1 d-E). Buna ek olarak, küçük bir kısmını gün 5-iEPs ortak express YFP ve erythroid özel yüzey marker Ter119 (Şekil 1F). Gün 8, büyük YFP + kümeler görülebilir. Gün 8iEPs gün 5 iEPs daha bir daha farklılaşmış erythroid fenotip sunmak; önemli ölçüde daha küçük, daha fazla hemoglobin birikmiş var ve aynı zamanda önemli ölçüde göstermek upregulated ifade Ter119 (Şekil 1B-1 G). Çok az enucleated reticulocytes (Şekil 1H) gözlenir ise Cyto-spin gün 8-iEPs, erythroid benzeri morfoloji, ortaya koyuyor.

Gen ifade analizi nicel polimeraz zincir tepkimesi (qPCR), toplu iEPs gün 8 toplanan tarafından neredeyse kapatma ifade fibroblast gen var ve upregulated globin genleri, ağırlıklı olarak da dahil olmak üzere birçok erythroid genlere sahip olduğunu gösterir embriyonik türleri (Şekil 1ben) ifade. Programlanmış hücre multipotent ataları geçiş olup olmadığını değerlendirmek için bir zaman ders gerçekleştirilen ve yeniden programlama boyunca hematopoetik işaretleri ifade analiz. Biz daha önce erythroid habercisi çıkış günü 6, günde 8, %10,5 ± % 4.6 ve % 6,6 ± %0.5 CD71 ve Ter119, sırasıyla10ortak ifade canlı YFP + hücre ile ardından en yüksek olduğunu bildirdi. CD41 pozitif hücrelerinin Ter119 pozitif hücrelerinin görünümünü önce nüfusu da vardır. C-kit de genellikle hematopoetik progenitör ve downregulated arttığından olarak ifade edilir, CD45 işaretleri (Şekil 1J) yeniden programlama içinde herhangi bir noktada ifade edilir. Bu veri hücreleri değil gitmek öneririz multipotent hematopoetik progenitör veya İngiliz kontu sahne, ama belki de bir megakaryocyte erythroid dede geçiş yapın.

Yeniden programlama verimliliğini değerlendirmek için güvenilir bir şekilde programlanmış hücre BFU-E koloni oluşturan deneyleri gerçekleştirmektir. Vitro farklılaştırma kapasitesi 5 - gece ve gün 8-iEPs methylcellulose insan Eritropoietin, fare kök hücre faktörü ve deksametazon ile desteklenmiş denetlesinler. 8 gün sonra iEPs oluşan koloniler iki tür: belirgin kırmızı (kırmızı IEP) ve gözle görülür değil kırmızı (kırmızı IEP). Hücreleri kırmızı kolonilerden erythroblast morfoloji görüntülenen iken, hücreleri kırmızı sigara kolonilerden erythroid hücreleri, benzer değil ve düzensiz, büyük derin mavi ve taneli sitoplazma (Şekil 2A) vardı.

Sigara-kırmızı koloniler (Şekil 2B) oluşan çok daha yüksek bir oranı kırmızı koloniler sadece yaklaşık 1:10,000 gün 8-iEPs oluşan iken gün 5-iEPs kırmızı koloniler, yaklaşık 1 1.000 kurdu. Koloni oluşturan bu azalma yeteneği gün 5 - gün 8-iEPs arasındaki farklılaşma gün 5-8 ve zaman içinde susturmak acı GTLM ifade vektörel çizimler geçiren açıkladı byiEPs olabilir. qPCR analiz eksojen transkript ifade 5-8 gün sonra önemli ölçüde azalır doğruladı. Başarılı yeniden programlama beklendiği gibi endojen Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc ifade düzeyini indüklenen vardır, ancak, endojen Lmo2 ifade sadece çok basit ifade edilir (Şekil 2C).

Not bir amacı ve testin bir sınırlama olduğunu makrofaj gibi hücreleri içeren kırmızı sigara kolonileri kırmızı hemoglobinized IEP kolonilerin koloni oluşturan içinde programlanmış fibroblastlar tarafından kurulan sayıca üstün deneyleri. Koloni kurma yeteneği kırmızı IEP kolonileri oluşturmak için GTLM faktörlerin stokiometrik oranlarını değiştirerek geliştirilebilir. İlave Gata1 kırmızı kolonileri oluşumunda önemli bir artış yol açtı iken iki katına Tal1 ve Lmo2 ifade vektörlerin hücrelerle transducing kırmızı kolonileri oranını hafif bir artış olmayan-kırmızı koloniler üzerinde yol açtı ve neredeyse sigara-kırmızı kolonileri tam kaldırılması önemli rol arttığından (Şekil 2D) bu faktörler için destek. İlginçtir, c-Myc ifade büyük ölçüde artan yeniden programlama için vazgeçilmez olmasına rağmen sigara-kırmızı kolonileri üretimi artar. Saf indüklenen erythroid ataları aşağı akım analizi için elde etmek için kolonilerin koloni oluşturan deneyleri ayrılmış olabilir. Biz gen ifade Analizi Mikroarray kırmızı şeklinde gerçekleştirilen ve sigara-kırmızı kolonileri gün 5-iEPs gelen ve koloniler 14.5 gün cinsel birleşme (dpc) fetal karaciğer (FL) ve yetişkin kemik iliği (BM) karşılaştırma için deftere nakledin. Mikrodizi veri NCBI'ın gen ifade Omnibus (GEO) üzerinden erişilebilir: GSE73344. Biz daha önce kırmızı-IEP kolonileri bona fide erythroid koloniler (FL ve BM) gen ifade10tarafından benzer göstermiştir. Gata1, Tal1, Lmo2 ve c-Myc ifadesi incelenmesi her koloni kırmızı kolonileri FL ve BM tüm dört faktör ifade benzer düzeyde gösterirken, Sigara-kırmızı kolonileri alt ifade gösterir tüm faktörler, özellikle Gata1 (resim 2E). Ne anlamak için makrofaj gibi hücreleri içeren kırmızı sigara kolonileri vardır, her tür koloni Mikroarray verilerden bir hücre türüne özgü genlerin ifade araştırılmıştır. Önceden bildirildiği gibi kırmızı kolonileri birçok erythroid özel genler, FL ve BM, benzer hızlı. Verileri yeniden ziyaret sonra sigara-kırmızı kolonileri genlerin bir sayının yüksek ifadesi makrofaj hücreleri14 (Şekil 2F) karakteristik göster açıktır. Ne kırmızı ne de sigara-kırmızı kolonileri tipik megakaryocyte genler15önemli ölçüde artış ifade göster. Birlikte, bu verileri olmayan-kırmızı koloniler daha yakından eritrositler makrofajlar benzer göstermektedir. Sigara-kırmızı kolonileri asla ne zaman bir GTLM faktörlerin kaldırılır gözlenir bu makrofaj benzeri hücreler bir veya daha fazla programlama faktörler Gata1, Tal1, Lmo2 ifade düzeyleri daha düşük olduğunda oluşturulmasına izin gibi görünüyor iEPs için yeniden programlama için gerekli. Birlikte, bu ifade düzeyleri tüm dört GTLM faktörlerinin IEP yeniden programlama için TTF içinde önemli ve heterojenlik eksik potansiyel olarak ayarlayarak düzeltilebilir bireysel hücrelerin yeniden programlama tarafından açıklanmıtır göstermektedir stokiometrik oranları.

Verimlilik ve sağlamlığı bizim protokol değerlendirmek için test ettik fibroblastlar numaraları ayarlama yeteneği 5 gün sonra görünür kümeleri IEP hücre üretmek için ne zaman 384-şey levha kültürlü. Biz dışarı 24 transductions 20, 30, 40 ve 50 TTF'ler wells ile en az bir IEP küme sayısı 3 (tabak fibroblastlar %0.6), 15 (tabak fibroblastlar %2.0), 15 (tabak fibroblastlar % 1.6) ve 13 (% 1,1 plakaları fibroblastlar) olduğunu tespit ettik , sırasıyla. Bu GLTM IEP yeniden şekillendirmek için bir verimlilik % 1'lik ulaşabilirsiniz sağlam ve güvenilir bir süreç olduğunu göstermektedir.

Yeniden programlama verimliliğini etkileyen diğer faktörler fibroblastlar ve kültür koşulları geçiş sayısını içerir. Biz bu üç kez pasajlı TTF'ler ya da dokuz kez iletim önce programlama verimliliği göre. Bu dokuz kez pasajlı TTF'ler (P9) iEPs (Şekil 3A) kümeleri üretmek için yetenek dramatik bir azalma gösterdi. İlginçtir, serum programlama medya dahil tamamen yeniden programlama, bloklar yerine geçmesini erythroid sitokinler serumla transduced faktör bileşik sinyaller olmadan yeni hücre kader serum götürmek için izin vermek gereklidir. Serum kaldırılması ve yeni faktörler hücre içindeki ifade hücreleri üzerinde stresli olma olasılığı yüksektir. Nitekim, p53 harekete geçirmek büyük ölçüde engelleme oluşturulan iEPs sayısı arttı. Bu etkiyi de p53 nakavt fibroblastlar (Şekil 3B-D) yeniden programlama görülebilir. P53 götürmek-e doğru daha fazla hücre hayatta kalma ve daha iyi yeniden programlama ve verim iyileştirilmesi için bir doğrulanmış yöntemdir sinyal inhibisyonu. Son olarak, hipoksik koşullarda yeniden programlama olumlu ama değil IEP üretim için çok önemli. Ancak, transduced TTF'ler normoxia içinde kültürlü yeniden programlamak çok daha yavaş ve IEP kümeleri beş-sekiz gün (Şekil 3E) yerine 10 gün sonra gözlenir.

Figure 1
Resim 1 : Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc zorla ifade reprograms fare yetişkin fibroblastlar hangi bona fide erythroid hücre özellikleri sergi erythroid ataları. (A) transkripsiyon faktörü-aracılı erythroid muhabir yeniden programlama için deneysel tasarım (Epor-Cre R26-eYFP) EpoR + yeniden programlanan hücrelere kuyruk ucu fibroblastlar (TTF). (B-F) Zaman untransduced TTF'ler (0 gün) nesil IEP ders ve GTLM transduced TTF'ler gün 5 ve 8 toplu (temsilcisi n = 2-3). Transdifferentiation (B) canlı hücre, alan parlak görüntüler tek Wells (ölçek bar, 50 µm); tarafından değerlendirilmiştir (C) Mayıs-Grünwald'ın - Giemsa boyama cyto-spin (ölçek çubuğu, 20 µm); (D) Benzidine/Giemsa boyama cyto-spin (ölçek çubuğu, 20 µm); (E) hücre Pellet makroskopik muayene; ve (F) temsilcisi akış sitometresi araziler YFP gösterilen / Ter119 ifade. (G) hücre çapı 5 ve 8 gün hasat iEPs gün 8 hücre boyutu bir düşüş gösteren birkaç cyto-spin slaytlardan ölçülür. Veri ± SD demek olarak sunulmaktadır (n = 21-25); p ≤ 0,0001 unpaired t-test. (H) temsilcisi yüksek çözünürlüklü benzidine/Giemsa görüntüleri GTLM transduced TTF'ler günde 8. Ölçek çubuğu, 5 µm. (ı) qPCR tarafından belirlenen globin genleri untransduced TTF'ler (gri sütun) karşı toplu olarak GTLM transduced TTF'ler (kırmızı sütunlar) günde 8, tarih de dahil olmak üzere ilgili fibroblast ve erythroid özel genlerin göreli mRNA ifade. Veri ± SD demek olarak sunulmaktadır (n = 4-6 için iEPs, n = 2 untransduced TTF'ler için). (J) untransduced TTF (0 gün) ve toplu GTLM transduced TTF gün 2, 4, 6 ve 8 YFP, CD45, CD71 ve Ter119 ifade gösterilen hasat zaman ders Akış Sitometresi Analizi özetini gösteren grafik (n = 3). Verileri ortalama ± SD şekil Capellera-Garcia S, adapte olarak sunulmaktadır ve ark. 10. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : GTLM iEPs üretmek BFU-E koloni deneyleri kırmızı ve kırmızı kolonilerde. (A) IEP elde edilen kırmızı ve kırmızı temsilcisi May Grünwald Giemsa ve parlak bir alan cytospin görüntülerini koloniler. Ölçek çubukları, 50 µm (kolonisi görüntüleri) ve 10 µm (cyto-spin görüntüler). (B) kaplama untransduced TTF'ler oluşturulan koloni sayıları 5 gün iEPs toplu ve günde 8 toplu. Veri ± SD demek olarak sunulmaktadır (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 iki yönlü ANOVA tarafından. (C) göreli mRNA ifade Gata1, Tal1, Lmo2, ve c-Myc untransduced TTF ve toplu GTLM transduced TTF 5 gün ve günde 8, qPCR tarafından belirlenen hasat. Endojen ifade toplam ifadeden ayırt böylece astar dizayn edilmiştir. Veri ± SD demek olarak sunulmaktadır (n = 4-6 için iEPs, n = 2 için untransduced TTF). (D) untransduced TTF'ler ve 5 iEPs GTLM faktörlerin her biri oranını iki katına tarafından oluşturulan toplu gün üretilen koloni sayıları kaplama. Veri ± SD demek olarak sunulmaktadır (n = 3); ** p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001 iki yönlü ANOVA tarafından. 14,5 dpc fetal karaciğer ve yetişkin kemik Gata1, Tal1, Lmo2 ve c-Myc untransduced fibroblastlar ve çekilen kolonileri göreli ifadesi (E) GTLM transduced iEPs (kırmızı ve kırmızı olmayan), oluşturulan iliği, Mikroarray tarafından belirlenir. Veri ± SD demek gibi sunulur; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 iki yönlü ANOVA tarafından. (F) seçili genlerin göreli ifade onların ifade erythroid (üst), megakaryocyte (orta) ve makrofaj (alt) hücrelerde untransduced fibroblastlar ve GTLM transduced iEPs (kırmızı ve kırmızı olmayan) oluşturulan çekilen kolonileri bilinen, 14.5dpc fetal karaciğer ve yetişkin kemik iliği, Mikroarray tarafından belirlenir. Veri ± SD; demek olarak sunulan * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0.005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 iki yönlü ANOVA tarafından. Şekil Capellera-Garcia S, et al. adapte 10. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : GTLM yeniden programlama, bu sağlam ve güvenilir bir süreçtir. (A) GTLM üç pasajlar (P3) veya yeniden programlama önce dokuz pasajlar (P9) uğramıştır kuyruk ucu fibroblastlar (TTF), yeniden programlama, günde 5 küme sayısı grafiği gözlenen 10.000 TTF'ler ve temsilcisi resimlerden. Veri ± SD demek olarak sunulmaktadır (n = 6); ölçek çubukları çoğu 50 µm. (B-D) temsilcisi IEP resimlerini kümeleri (B) GTLM kuyruk ucu fibroblastlar; yeniden programlama sonra 6 gün (C) GTLM p53DN ifade vektör eklenmesiyle TTF'ler yeniden programlama; (D) GTLM p53 nakavt TTF'ler yeniden programlama (ölçek çubukları 50 µm =). (E) GTLM yeniden programlama 10 gün normoxic koşulları gerçekleştirmesinden sonra IEP kümeleri temsilcisi resimleri (ölçek çubuğu 50 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast iEPs10için doğrudan yeniden programlamak için yeterli. Programlanmış erythroid hücreleri bona fide erythroid ataları morfoloji, fenotip, gen ekspresyonu ve koloni kurma yeteneği açısından büyük ölçüde andıran. Bu bulgu gelişimsel faktörler hematopoiesis içinde tanımlamak için bir araç olarak doğrudan yeniden programlama kullanma mantığı doğruluyor. Bu yöntem geçerliliğini desteklemek için iEPs da GTLM indüksiyon fare embriyonik fibroblastlar ve insan sünnet derisi fibroblastlar, fibroblastlar farklı kökenleri ve türler10üzerinden için çalıştığını gösteren kullanarak oluşturulabilir. Bu raporda, erythroid soy izleme fareden fibroblastlar, dönüşüm bir erythroid hücreye görselleştirmek için bir araç olarak yeniden şekillendirmek için ikna etmek. Bu fare kullanımı yararlı ama protokol için kritik değil. Biz rutin fibroblast çeşitli fare suşları üzerinden birden çok çeşitli kullanarak yeniden programlama yapmak ve iEPs Ter119 ve CD71 hücre yüzey marker ifade tarafından tanımlamak.

Bizim geçerli yöntem kesin bir yetişkin fenotip aksine ilkel erythroid fenotip sergi iEPs oluşturur. Bu aşamalar gelişimi arasında bir büyük fark farklı globin genleri ifadesidir. Ancak, Biz esas olarak yetişkin için ağırlıklı olarak embriyonik10,14' GTLM kokteyl değişiklikler iEPs globin ifade deseni için Klf1 ve Myb bu ek göstermiştir. İlginçtir, Gata2 ve Runx1 ek dört faktör kokteyl ve thrombopoietin orta programlama işleminin megakaryocytic lineage16karşı önyargıları.

GTLM kaynaklı iEPs erythroid ataları ilkel gen ifade imza ve sınırlı bir proliferatif kapasitesi ile üretmek. Ayrıca, iEPs çok az enucleated eritrositler üretmek. Zavallı erythroid yaratıcı genişleme potansiyel olarak diğer faktörler kesin gen ekspresyonu ile iEPs için doğrudan yeniden programlama inducing eklenmesi ile elde edilebilir seti + kesin erythroid hücreleri yeniden programlamak için hata açıklaması program.

Bizim veri de zavallı enükleasyon verimlilik iEPs GTLM kaynaklı kesin gen ifade programın değil de öncüleri ile basit bir tür oluşturmak gerçeğiyle açıkladı öneririz. Kültür koşulları en iyi duruma getirme, çeşitli girişimlerde geliştirilmiş enükleasyon denendi. Her iki progenitör yayılması ve enükleasyon verimliliğini artırmak için devam eden girişimleri için kesin iEPs yeniden programlama inducing eksik etkenler belirlenmesi bu nedenle odaklanmıştır.

Kırmızı IEP kolonileri en uygun üretimi için hücreleri dört vektörel çizimler ile transduced ve yüksek düzeyde GTL genlerin ifade edilir hayati önem taşımaktadır. Ne yazık ki şu anda en verimli yöntem vektör titreleri önceden kontrol izin vermez. Bir girişim bicistronic lentiviral vektörler kullanarak verimliliği artırmak için büyük olasılıkla daha aşağı stoichiometry veya yetersiz ifade düzeyleri ile ilgili sorunlar nedeniyle başarısız oldu. Programlama vektörel çizimler geliştirmek için çalışmalar sürmektedir sırasında taze bileşimlerini kullanarak en verimli yöntem kalır sadece bir faktör ve hiçbir seçim işaretçisi gen ifade yukarıda açıklanan retroviral vektörler ile vektör süpernatant üretilen.

GTLM için iEPs yeniden şekillendirmek için tek bildirilen protokol erythroid atası benzeri hücrelerden bir taahhüt somatik hücre üretmek mümkün olmasıdır. Bir araştırma aracı DLR IEP yöntemi, bu nedenle diğer birçok avantajı olduğu gibi erythroid hücre modeli sistemleri gibi erythroid cep HiDEPs/HuDEP hücre hatları (PMID: 23533656)17. HiDEPs/HuDEP hücreler büyük ölçekli eritrosit üretimi ve gen işlevi sırasında terminal arttığından değerlendirmek için daha uygun araçlar olmakla birlikte, GTLM iEPs için yeniden şekillendirmek için benzersiz avantajı doğrudan temel çalışma yeteneğidir Transkripsiyon programları erythroid hücre kaderini belirleme. GTLM yeniden programlama ilkel ve kesin arttığından arasında geçiş eğitim için insan ve fare, örneğin, her iki arttığından eğitimi için çok değerli bir platform sağlar. Bu anahtarı Hemoglobinopati, orak hücreli anemi, hangi araştırmacılar yetişkin anahtarda fetal hastalık hafifletmek için hemoglobin için tersine çevirmek çalışıyoruz gibi potansiyel tedavisinde büyük ilgi en önemli noktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar raporlanacak hiçbir çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Biz Evelyn Wang ve Gregory Hyde (Whitehead Enstitüsü, Cambridge, MA) klonlama ve Harvey Lodish (Whitehead Enstitüsü) için birçok retroviral kütüphane oluşturmak için kullanılan plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz berkay Siva ve Sofie Singbrant (Moleküler Tıp bölümü ve gen terapisi, Lund Üniversitesi), Göran Karlsson ve Shamit Soneji (moleküler Hematoloji Bölümü, Lund Üniversitesi) Açıklama IEP üretim rolleri için teşekkür ederim. Ayrıca kabul ve teşekkür Julian Pulecio (rejeneratif tıp merkezi, Barcelona Biyomedikal Araştırma Parkı), Violeta Rayonu-Estrada (The Rockefeller Üniversitesi, New York), Carl Walkley istiyorum (St. Vincent'ın Enstitüsü tıbbi araştırma ve Bölümü tıp, St Vincent'ın hastane, Melbourne Üniversitesi), Ángel Raya (Katalan kurumun araştırma ve ileri araştırmalar, Barcelona) ve Vijay G. Sankaran (Broad Enstitüsü Massachusetts Institute of Technology ve Harvard, Cambridge ) Bu çalışmaya önceki katkılarından dolayı. Bu eser (için JF); Ragnar Söderberg Vakfı tarafından desteklenmiştir İsveç Araştırma Konseyi (için JF); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (için JF); İsveçli Vakfın Stratejik Araştırma (için JF); Åke Wiberg'ın kuruluşuna (J.F.); Marie Curie tümleştirme grant (için JF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164, (3), 337-340 (2016).
  2. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (7), 2527-2532 (2012).
  3. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468, (7323), 521-526 (2010).
  4. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, (2), 205-218 (2013).
  5. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, (5), 1871-1884 (2014).
  6. Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13, (3), 328-340 (2013).
  7. Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24, (9), 1424-1434 (2013).
  8. Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29, (10), 892-907 (2011).
  9. Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10, (2), 107-109 (2017).
  10. Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15, (11), 2550-2562 (2016).
  11. Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24, (6), 744-756 (2012).
  12. Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117, (21), 5631-5642 (2011).
  13. Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104, (3), 659-666 (2004).
  14. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13, (11), 1118-1128 (2012).
  15. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17, (1), 83 (2016).
  16. Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17, (3), 671-683 (2016).
  17. Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8, (3), 59890 (2013).
Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).More

Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter