Summary
우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 흐름 챔버 모델, 조직 이식에 세균성 부착의 조사 수 있는 설명 합니다.
Abstract
다양 한 valved 도관 및 텐트 장착 밸브 오른쪽 심 실 유출 지역 (RVOT) 밸브 교체 선 천 성 심장 질환 환자에 사용 됩니다. 그러나 인공 재료를 사용 하 여, 이러한 이식 세균성 감염 및 다양 한 호스트 응답을 따르게 됩니다.
미생물의 혈관 내 수술 준수에서 중요 한 역할을 하는 박테리아 및 호스트 요인의 식별은 중요성 더 나은 infective 심장 내 막 염 (IE) 같은 감염의 발병의 병 태 생리학을 이해 하 고 예방을 개발 하 전략입니다. 따라서, 생리 전단 조건 하에서 세균성 접착을 조사 하기 위해 유능한 모델의 개발은 필요. 여기, 우리는 새롭게 설계 된 생체 외에서 관류 챔버 병렬 플레이트에 따라 조직 이식의 다른 구성 요소에 세균성 부착의 연구와 같은 기질, 내 피 세포와 불활성 영역 노출 수를 사용 하 여 설명 . 이 방법은 결합 된 식민지를 형성 단위 (CFU) 세 흐름에서 세균성 접착으로 이식 재료의 성향 평가 하다. 더욱, 흐름 챔버 시스템 전단 조건 하에서 세균성 접착 구성 요소 혈액의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 조직, 그들의 표면 형태 및 세균성 종 특이성의 소스는 우리의 사내 디자인 된 생체 외에서 관류 모델을 사용 하 여 조직 이식에 세균성 부착에 주요 결정 요인 설명 했다.
Introduction
황색 포도상구균 (S. 구 균) 독성 패 혈 증 같은 심한 혈관 내 감염에 이르게 인간의 순환에 이식 하는 생물 학적 또는 생물 학적 비 표면 정착 호스트 면역 방어 시스템을 회피 전략의 다양 한 고용 및 IE1,2,3,,45. IE 남아 있다 중요 한 치료 관련 개별 요인 IEare의 발병에 기여 하지 아직 완전히 이해6,7동안 인공 심장 밸브의 이식 후 환자에서 합병증. 흐름 조건 하에서 박테리아 발생 하는 전단 세력, 그들은 배 벽8을 준수 하기 위해 극복 하기 위해 필요. 모델, 박테리아와 인공 밸브 조직 또는 흐름에서 endothelium 사이 상호 작용을 공부 하 고 수 있도록, 그들은 더 많은 비보에 상황을 반영 관심 있습니다.
몇 가지 특정 메커니즘 내 피 세포 (ECs) 노출된 subendothelial 매트릭스 (ECM) 조직 식민 및 vegetations, IE9에 필수적인 초기 단계 고의 성숙 하 고 세균 부착을 촉진 한다. 다양 한 포도 표면 단백질 또는 MSCRAMMs (미생물 표면 구성 요소 접착제 매트릭스 분자 인식) 설명 되었습니다 접착 호스트 세포와 ECM 단백질의 중재자로 fibronectin, 같은 분자와 상호 작용 하 여 fibrinogen, 콜라겐과 폰 Willebrand 요인 (VWF)8,,1011. 그러나, 일부 독성 요인, 정적 조건에서 공부 하는 대부분의 분자 내 폴딩에 비추어 이러한 상호 작용의 많은 다른 혈관 내 수술 감염 혈액 순환에 관련이 있을 수 있습니다.
따라서, 우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 병렬 플레이트 흐름 챔버 모델, RVOT 위치에 이식 조직 이식의 맥락에서 ECM와 ECs의 서로 다른 구성 요소에 세균성 부착의 평가 수 있는 선물. 이 작품에서 설명 하는 방법의 전반적인 목적은 박테리아와 밀접 하 게 관련 혈 류 병원 체의 환경 vivo에서 와 같은 흐름 조건에서 기본 혈관 내 수술 조직 간의 상호 작용의 메커니즘을 연구 하는 S. 구 균. 이 새로운 접근 방식을 이식 조직 표면 세균 준수 IE의 개발에 대 한 잠재적인 위험 요소를 식별 하는 민감성에 초점을 맞추고.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 생체 외에서 연구에 대 한 이식 조직 준비
참고: 세 가지 유형의 조직 사용 되었다: 소 심장 패치 (BP), Cryopreserved Homograft (CH)와 소 경 정 맥 이식 (BJV). BJV 도관 채널 (조직 유럽 Homograft 은행 (EHB)에 의해 처리 하 고 액체 질소를 사용 하 여 이전에 저장 된) 경우에, 벽과 판 막 병 전단지 사용 되었다. BP 패치 및 BJV 도관 제조 업체에서 구매 되었다. 사용 전에 다음 EHB 지침12채널을 녹여.
- 모든 조직 0.9 %NaCl 사전 사용 하 여 린스 합니다.
- 사용 하는 일회용 피부 생 검 조직 생 검 펀치 (직경에서 10 m m) 원형 조직 조각을 잘라 준비 합니다.
- 일회용 멸 균 scalpels를 사용 하 여 같은 높이에 모든 조직 패치를 잘라.
- 도 (예 : BJV 도관)로 고정 하는 조직에 대 한 인간의 알 부는 정착 액을 중화 하의 200 g/L와 4 ° C에서 하룻밤 이식 조각 품 어.
- 도 0.9%의 잔류물에 밖으로 세척 NaCl 결정 접시에. 1 분 동안 3 번 반복 합니다.
2. 관류 실험에 대 한 박테리아를 준비
참고: 세 개의 세균 분리 사용 되었다: S. 구 균 완 (ATCC 12598), ATCC 149900 S. epidermidis , S. sanguinis NCTC 7864. S. 구 균 과 S. epidermidis tryptic 간장 국물 (TSB)에 37 ° C에서 성장 했다와 S. sanguinis 5% CO2 두뇌 심 혼 주입 국물 (BHI)에서 37 ° C에서 성장 했다.
- 단단한 혈액 한 천 격판덮개에 박테리아의 숙박 문화를 준비 합니다.
- 메 마른 루프를 사용 하 여 냉동된 박테리아를 다쳤어요 37 ° c.에 숙박 문화에 대 한 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지 위에 접종을
- 살 균 접종 루프를 사용 하 여 하룻밤 혈액 한 천 문화에서 하나의 식민지를 선택 하 고 37 ° c.에 하룻밤 문화와 14 mL 튜브에 TSB 또는 BHI의 10 mL에 접종을
- 야간 문화 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000) centrifuge 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 10 mL에 산 탄을 resuspend. 얼음에 14 mL 튜브를 배치 합니다.
- 5 (6)-카-fluorescein N-hydroxy-succinimidyl 에스테 르 (CF)에서 에탄올의 3.7 mg/mL 해결책의 약 수를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 또한 CF의 150 µ g/mL의 ' 초순 '를 사용 하 여 재고 희석.
참고: 알루미늄 호 일을 사용 하 여 광원에서 튜브를 보호 하 고-20 ° c.에 저장 - Centrifuge 박테리아 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000)와 PBS의 800 µ L에 산 탄을 resuspend 고 150 µ g/mL CF 솔루션 (관류 실험을 위해 사용 하는 30 µ g/mL의 최종 농도)의 200 µ L를 추가 합니다. 알루미늄 호 일 빛에서 튜브를 보호 하 고 궤도 셰이 커를 사용 하 여 30 분 동안 품 어.
- 라벨, 후 PBS에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션의 2%를 차단 하 고 스핀 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000). 원심 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000), PBS와 펠 릿 박테리아의 10 mL를 사용 하 여 세척 단계를 따르십시오.
- 해당 하는 OD600 (광학 밀도) 0.65의 얻을 107 콜로 니 형성 단위 (CFU) /mL (CFU 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지에서 계산에 의해 확인), PBS와 박테리아를 희석. 관류 실험 전에 얼음에 어둠 속에서 튜브를 유지.
참고입니다. OD600 측정 박테리아의 대략적인 수를 반영 하는 명심에서 하십시오. 효과적인 접종 량을 계산, 직렬 희석 방법은 섹션 3.8에에서 설명 된 대로 숫자를 기반 하는 마약을 확인 하는 추가 필요한 단계입니다.
3. 관류 실험 체 외에 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여
- 연락해 세균 현 탁 액 직면 하는 내부 표면 조직 생 검 (1.1-1.5 단계에서 준비 하는) 동일한 두께 직경 10 mm의 흐름 챔버 시스템에 탑재 합니다.
참고: 다양 한 이식에 걸쳐 동일한 조직 두께 같은 조직 높이 모든 조건에서 층 류를 허용 하는 채널에 도달 보장 합니다. 흐름 챔버의 모든 요소는 제시 하 고 그림 1에 설명 된.- 프로토콜을 시작 하는 8 m m 원형 구멍 뚫 기와 현미경 슬라이드와 고무 가스 켓 라운드 조직 조각을 놓습니다.
참고: 현미경 슬라이드 8 m m 구멍의 생성을 허용 하도록 초박형 하단 필름을 소유한 다. 고무 시트 함께 그것은 조직 표본 및 흐르는 매체 간의 직접 접촉을 가능 하 게 수정 하 고 또한 실험 기간 동안 생 검의 전위를 방지. 조사 조직의 흐름 (작은 직경)에 노출 되는 표면은 겸 자에 의해 조작 될 수 없습니다. - 챔버의 하단 금속 프레임에 포함 되는 가스 켓 시트에는 조직으로 홀더를 삽입 합니다.
- 이전 삽입된 조직 홀더 있는 챔버의 아래쪽에 해당 가스 켓 시트 위쪽 금속 프레임에 부착. 이후 8 개의 나사와 전체 챔버를 탑재 하 고 너트를 나사. 챔버 높이 항상 같은 이식에서 다는 것을 확인 하십시오.
참고: 챔버 높이 나사를 강화 시 항상 결정 되어야 합니다. 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용 합니다.
- 프로토콜을 시작 하는 8 m m 원형 구멍 뚫 기와 현미경 슬라이드와 고무 가스 켓 라운드 조직 조각을 놓습니다.
- 연동 펌프와 튜브와 유체 저수지 흐름 챔버를 연결 합니다.
- 3 다 인/cm2 (평방 센티미터 압력 단위 당 다 인)의 전단 응력으로 107 CFU/mL (CFU 계산과 OD600 측정 관련 하 여 확인) 붙일 표시에 박테리아의 PBS 정지 된 조직에 의해 perfuse 연동 펌프의 수단 (흐름 속도 4 mL/min) 1 h 400 mL 세균성 저수지 (사내 디자인, 그림 1) 접시 온도 (자료 테이블)를 사용 하 여 37 ° C에서 에어컨을 사용 하 여.
- 지속적으로 동일한 컬렉션 저수지를 사용 하 여 100 mL 세균성 정지 recirculate.
- 관류, 후 출시 하는 이식 고 3 분에 대 한 실험실 궤도 셰이 커를 사용 하 여 12-잘 접시에 PBS의 두 번 4 mL와 조직 조각을 세척 챔버를 해체. 이후에 작은 직경의 펀치 피부 생 검을 사용 하 여 이식의 안쪽 부분을 잘라.
- 각 조직 생 검 살 균 0.9%의 1 mL를 포함 하는 별도 14 mL 튜브에 배치 NaCl. #1 튜브 레이블.
- 10 분 동안 쥡니다 목욕을 사용 하 여 조직에서 세균을 분리 (진폭 = 100% 및 주파수 = 45 kHz).
참고: 이식 패치 TSB 액체 매체 OD600 측정 뒤에 37 ° C에서 하룻밤의 외피에 평가 해야 하는 조직에서 박테리아의 전체 분리 제어 패치 박테리아 무료 솔루션으로 치료에 비해. - CFUs 계산 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지에서 희석 직렬 메서드를 사용 합니다.
- 10 mL 쥡니다 후 얻은 세균 현 탁 액의 직렬 희석 수 있도록 메 마른 염 분의 단일 14 mL 튜브를 준비 합니다. # 2이이 튜브 레이블.
참고: 각 조직 실험 한 튜브 10 mL의 0.9 %NaCl 필요 합니다. - 살 균 0.9%의 10 mL와 함께 3 14 mL 튜브 준비 단계 2.7에서에서 초기 세균 서 스 펜 션의 직렬 희석에 대 한 NaCl. #3, #4, #5 다음과 같이 튜브 라벨.
참고:이 단계는 세균성 관류 실험에 사용에 진짜 CFU 번호를 알고 하는 데 필요한. - 소용돌이 혼합 각 튜브 15 미 소용돌이 대 한 튜브 직렬 희석 수 있도록 초기 세균 현 탁 액 뿐만 아니라 조직 생 검.
- 3 한 천 배지, 두 조직 실험 (박테리아의 관류와 PBS의 제어 관류)에 대 한 및 perfusions 사용 초기 세균 현 탁 액에 대 한 세 번째 준비.
- 다음과 같은 방식으로 10-1, 10-3 , 10-4조직 실험에 대 한 접시 당 3 개의 분야를 레이블을 지정 합니다. 세균 perfusates에서 CFUs의 수를 계산 하려면 다음과 같이 라벨 접시: 10-1, 10-3, 10-5 및 10-7.
참고: 모든 표시 agar에 번호판 등 10-1, 10-3 CFU/mL는 다음날에 계산의 마지막 번호를 참조 하십시오. 컨트롤 플레이트 팬 들은 어떤 분야의 정보를 요구 하지 않는다. 사용 하기 전에, 혈액 한 천 배지 한다 층 류 후드 아래에 배치 되며, 과도 일 분을 제거 하려면 열. - 계속 하려면 직렬 희석을 준비, 튜브 # 2에 지하철 # 1의 100 µ L 전송 하 고 적극적으로 소용돌이 함께 혼합.
- # 1과 #2 해당 분야 10-1 에 튜브의 내용을 100 µ L 10-3 한 천 격판덮개의 확산. 마찬가지로, 10 µ L 튜브 #2 부문 10-4에 확산, 4 번 10 µ L의 각 볼륨에서 4 별도 종양을 얻기 위해이 단계를 반복.
참고: 때문에 작은 볼륨 도금 분야 10-4에 대 한 사용, 그것 성장된 CFUs의 평균 수 있도록 방울의 여러 수 하도록 조언 된다. - 준비 하려면 초기 문화의 직렬 희석, 튜브 #3 단계 2.7에서에서 100 µ L 세균 현 탁 액의 전송 하 고 적극적으로 소용돌이 함께 혼합. 튜브 # 4를 100 µ L 튜브 # 3의 추가 잘 혼합, 후속 튜브 # 5에 대 한 절차를 반복.
- 분야 10-3, 10-5, 10-7 , 10-1 의 혈액 한 천 배지 위에 각각의 튜브 #3, #4, #5 및 조정된 세균 현 탁 액 (2.7 단계)의 내용 100 µ L를 확산.
- 두고 공기 층 류 후드에 혈액 한 천 배지 건조 10 분 동안 일반적으로 세균 확산. 이후에, 야간 보육에 대 한 37 ° C에서 접시를 놓습니다.
- 밤새 부 화 후 세균성 식민지는 관류 사용 시작 세균 현 탁 액에는 조직 생 검으로 CFUs/mL 접착에서 발생 하는 CFUs의 수를 계산 합니다. CFU/c m2로 결과 표현 한다.
- 10 mL 쥡니다 후 얻은 세균 현 탁 액의 직렬 희석 수 있도록 메 마른 염 분의 단일 14 mL 튜브를 준비 합니다. # 2이이 튜브 레이블.
4. 형광 현미경 검사 법 준수 박테리아 관류 시 조직의 이식에
- 관류, 후 PBS의 조직 조각을 세척 (단계 3.5 참조) 및 작은 직경의 펀치를 사용 하 여 이식의 안쪽 부분을 잘라.
- 6 잘 플레이트를 준비 하 고 장착 매체 (자료 테이블)의 작은 물방울을 배치.
- 설치 매체의 한 방울에 아래로 그것의 perfused 표면 조직의 각 조각을 놓습니다.
- 접시는 형광 스캐너 (테이블의 재료)를 사용 하 여 읽기. 세균성 라벨 사용 fluorophore 따라 여기 및 방출 파장의 매개 변수를 설정 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
뒤에 있는 메커니즘을 이해 하기 IE 개발,이 모델 박테리아의 평가 및 조직 관련 요인 감염 발병의 비보에 상황에 존재.
자세하게, 소설 체 외에서 접근 수 있게 3-10 다 인 생리 적 범위의 전단 응력을 발휘 하는 조직에 붙일 레이블된 박테리아를 perfusing에 의해 다른 이식 조직에 흐름 조건에서 세균성 접착을 계량 / cm2 는 RVOT에 대 한입니다. 이 작품에서는, 우리는 3 다 인/c m2에 대응 4 mL/min의 유량을 사용 합니다. 고려 채널 높이 0.3 m m의 모든 조직 패치, 탑재 된 이식 약 39 mm의 중간 입구 사이의 거리, ( 그림 1참조) 관류 챔버 보장 완전 개발된 층 류 흐름 (= 3.89 다시는 2000; 보다 크게 낮은 입구 길이 = 0.05 m m 거리 ' 입구-이식 ', 적절 한 흐름 패턴을 가정에 필요한 매개 변수 보다 훨씬 작습니다).
전단 응력 조건 하에서 다양 한 이식 조직에 걸쳐 비슷한 세균 첨부 파일에 대 한 모두 S. 구 균 과 S. epidermidis (그림 2 및 그림 3) 관찰 되었다. 비록 중요 하지, 채널 전단지에 S. 구 균 의 더 높은 접착을 경향 두 드러 졌다.
S. sanguinis BJV 벽에 부착의 뜻깊은 감소에 대 한 혈압 패치 (그림 4;에 비교 될 때 발견 되었다 P < 0.05). 때 상당히 낮은 접착 S. 구 균 과 S. epidermidis BJV 벽에 선물 한다 박테리아S. sanguinis 3 종 비교 (P < 0.01 및 P < 0.05 각각 비디오 참조). 일반적으로 전단 응력에서 조사 하는 모든 조직에 유사한 세균성 접착을 관찰 합니다.
CFU (그림 2, 그림 3, 그림 4) 계산에서 우리의 데이터는 (그림 5, 그림 6, 그림 7) 높은 처리량 스캐너를 사용 하 여 형광 현미경 검사 법에 의해 지원 됩니다. 이미지는 조직 이식 준수 레이블된 박테리아의 발음된 foci 제시 하고있다. 이 접근 방식으로 인해 우리가 직접 실험 용도로 처리 게시물 없이 관류 시 조직의 시각화 수 있었다.
결과 이식 조직, 표면 형태학 적 차이 뿐만 아니라 세균성 adhesins의 소스는 세균성 부착의 주요 결정 요인 입증이러한 생물 재료에.
그림 1: 새로 개발 된 유량 챔버 시스템 (사내 디자인 학과의 Biohybrid & 의료 섬유, ア-공학, 아 헨, 독일 헬름홀츠 연구소)의 이미지. A. 흐름 챔버 (1) 장착 크기 LxWxH 흐름 집합: 55 m m x 18 m m x 125 (나사 스크류 너트와 함께에서 만요 챔버의 부분 함께 넣어 압력을 통해 금속 프레임 누설을 방지 하기 위해 가스 켓); (2) 열;의 위쪽 부분 (3) 튜브 커넥터, 튜빙 시스템; 흐름 챔버는 펌프와 유체 저수지 연결을 해결 하기 위해 두 개의 구멍과 상단 가스 켓 시트 (4) 거리 사이 중간 인 레트와 조직 (입구 길이); (허용 세균 현 탁 액을 조직의 노출 하는 8 m m 원형 천공)와 (5) 얇은 포 일 슬라이드 (슬라이드의 쉬는 시간에는 고무 가스 켓 B9는 관류 동안 조직 조각을 무력화를 위한 공간); (6) 조직 이식 장소를 전용 쉬는 시간 하단 개스킷 시트 장착 현미경 슬라이드와 고무 가스 켓; (7) 하단 부분의 흐름 챔버; B. 전체 설정 (8) 얇은 포 일 슬라이드; (9) 고무 가스 켓; (10) 8 나사와 너트-해당 (11) 8 나사; (12) 유체 저수지 (400 mL); (13) 배관 시스템; C. 관류 장치 (14) 연동 펌프; (15) 전용 하는 튜브 연동 펌프 액션의 엄격을 견딜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 흐름 조건 하에서 조직 이식에 S. 구 균 완의 접착. 붙일 레이블된 박테리아 했다 끼얹는다 이상 5 이식 조직 (도관 벽 이나 판 막 병 전단지) PBS에. 박테리아는 쥡니다에 의해 감염 된 조직 조각에서 분리 했다. 세균성 접착 CFU 계산 메서드를 사용 하 여 직렬 희석에 의해 평가 되었고 CFU/c m2으로 표시. 모든 결과 ± SEM (n > 3 물자의 제한으로 인해 판 막 병 전단지; n > 5 도관 벽)를 뜻으로 표현 됩니다. CFU: 콜로 니 형성 단위; 혈압: 소 심장; BJV: 소 경 정 맥; 채널: cryopreserved homograft. 이 그림 Veloso 외 에서 수정 되었습니다. (흉부 및 심장 혈관 수술의 전표 155 (1), 325-332 (2018)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: S. epidermidis 흐름 조건 하에서 조직 이식에 접착. 붙일 레이블된 박테리아 했다 끼얹는다 이상 5 이식 조직 (도관 벽 이나 판 막 병 전단지) PBS에. 박테리아는 쥡니다에 의해 감염 된 조직 조각에서 분리 했다. 세균성 접착 CFU 계산 메서드를 사용 하 여 직렬 희석에 의해 평가 되었고 CFU/c m2으로 표시. 모든 결과 ± SEM (n > 3 물자의 제한으로 인해 판 막 병 전단지; n > 5 도관 벽)를 뜻으로 표현 됩니다. CFU: 콜로 니 형성 단위; 혈압: 소 심장; BJV: 소 경 정 맥; 채널: cryopreserved homograft. 이 그림 Veloso 외 에서 수정 되었습니다. (흉부 및 심장 혈관 수술의 전표 155 (1), 325-332 (2018)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: S. sanguinis 흐름 조건 하에서 조직 이식에 접착. 붙일 레이블된 박테리아 했다 끼얹는다 이상 5 이식 조직 (도관 벽 이나 판 막 병 전단지) PBS에. 박테리아는 쥡니다에 의해 감염 된 조직 조각에서 분리 했다. 세균성 접착 CFU 계산 메서드를 사용 하 여 직렬 희석에 의해 평가 되었고 CFU/c m2으로 표시. 모든 결과 ± sem의 뜻으로 표현 됩니다 (n = 3; 자료의 제한으로 인해 판 막 병 전단지에 대 한 n > 5 도관 벽). CFU: 콜로 니 형성 단위; 혈압: 소 심장; BJV: 소 경 정 맥; 채널: cryopreserved homograft. 이 그림 Veloso 외 에서 수정 되었습니다. (흉부 및 심장 혈관 수술의 전표 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 형광 현미경 검사 법에 의하여 조직 이식에 S. 구 균 완 준수의 시각화. 왼쪽에서 오른쪽: BJV 도관 벽, BJV 전단지, 채널 벽 및 채널 전단지. 이 그림 Veloso 외 에서 수정 되었습니다. (흉부 및 심장 혈관 수술의 전표 155 (1), 325-332 (2018)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 조직 이식에 S. epidermidis 준수의 시각화. 왼쪽에서 오른쪽: BJV 도관 벽, BJV 전단지, 채널 벽 및 채널 전단지. 이 그림 Veloso 외 에서 수정 되었습니다. (흉부 및 심장 혈관 수술의 전표 155 (1), 325-332 (2018)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 조직 이식에 S. sanguinis 준수의 시각화. 왼쪽에서 오른쪽: BJV 도관 벽, BJV 전단지, 채널 벽 및 채널 전단지. 이 그림 Veloso 외 에서 수정 되었습니다. (흉부 및 심장 혈관 수술의 전표 155 (1), 325-332 (2018)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
최근 임상 관측 게 IE의 특별 한의 식을 사용 하 여 RVOT6,13의 밸브 교체 받은 것 환자에서 합병증으로. IE에서 이식된 밸브의 부전 광범위 한 염증 및 procoagulant 반응1,14로 이어지는 혈관 내 수술 이식와 세균 상호 작용의 결과 이다. 모델 제시 소설 체 외에서 를 사용 하 여 조직 구조와 세균 요소에 차이 비보에 사용 된 이식15의 감염 민감성을 변조 가능성이 있다면 조사 수 있었습니다. BJV 및 채널 이식 조직 흐름 조건에서 세균성 모집으로 비슷한 성향을 보였다. 따라서 데이터에 일반적 조직 및 그것의 표면 구조 뿐만 아니라 특정 세균성 접착 단백질 본질적 의 소스는 초기 세균 부착에서 주요 결정 요인 것이 좋습니다.
일반적으로 경로 evoking 염증, 감염 된 혈관 내 수술 사이트에 조직 손상, 혈소판 및 섬유 소 증 착 여러 선수1,16에 의해 활성화 됩니다. 개발 된 생체 외에서 모델의 주요 장점은 stepwise 참여 선수의 기여를 분석할 기회입니다. 단일 세균 요인 세균성 돌연변이 체 긴장 또는 그들의 표면14에 단일 접착 단백질을 표현 하는 유전자 변형된 박테리아를 사용 하 여 조사 될 수 있습니다. 선택 하 여 다른 관류 미디어, 플라즈마 또는 혈액, 혈장 단백질과 혈액 세포의 참여를 평가할 수 있습니다. 더 연구 조직에 초점을 것입니다 관련 요소는 조직 될 것입니다 전에 예를 들어 플라스마 단백질 미리 incubated 후속 관류 흐름 챔버에 장착. 보 철 밸브의 발병에 기여 하는 선수부터 즉 불분명 남아, 미래 연구 더 복잡 한 실험적인 체제까지 구축 하 여 잠재적인 요소를 푸는 수 있습니다. 또한,이 실험적인 체제 조직 전단 종속 EC 유전자 발현을 분석 하는 EC 레이어와 시드할 수 있습니다 가능성을 상속 합니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버는 또한 관류 챔버의 유연한 내부 높이로 인해 EC 덮여 현미경 슬라이드 위에 관류를 수 있습니다. 다양 한 세포 외 기질 단백질을 사용 하 여 커버 전표의 다른 코팅은 또한 subendothelial 매트릭스와 함께 중요 한 상호 작용을 평가 하기 위해 가능한 옵션. 또한, 약리학 적인 억제제 또는 기능 항 체 우리의 흐름 상공에서 각각에서 그들의 효과 대 한 조사 수 있습니다. 요약 하자면, 다양 한 조건 복잡성을 증가 의해 공부 될 수 있다.
감염된 된 지역에는 이식의 염증 성 활성화 활성화 된 혈소판 및 monocytes의 애 용 전단 제어, 중요 한 단계 이다. 전단의 영향의 주요 관심사는 표면 조직에 세균 부착에 강요 합니다. 이 문제를 해결 하려면 제시 체 외에 시스템의 참신은 조직 흐름 챔버에 탑재 가능성에 중점을 둡니다. 이는 일반적으로 박테리아와 내부 조직 간의 정적 상호 작용 되었습니다 조사, 기존 대안 넘어 방법의 중요성을 강화. 전단 응력 동요 또는 다른 외부 세력에 의해 복종 되었다, 비록 그것은 하지 되었습니다 표준화 동일한 수준으로 우리가 우리의 유니폼 흐름 모델에서 얻을 수 있습니다.
Vivo에서, 비 생리 흐름 패턴 이식된 도관의 밸브 수준에서 IE의 발병으로 세균성 접착을 부탁 수 있습니다. 전단 응력은 최대 조절 내 피 염증 매개 사이토카인 분 비 조직 요소를 증가 하 고 중재 응고17발견 됐다. 기본 조직 밸브 prostheses 박테리아와 EC 유전자 발현 전단 응력의 밑에 그들의 영향에 대 한 사용의 상호 작용은 덜 수 있는 세균성 접착 및 만성 염증의 밸브를 구성 하는 것이 중요.
조작된 챔버의 기초 기술 문제18층 류 표준화 된 조건 하에서 조사를 허용합니다. 조사 조직 사이트에 완전히 개발 된 층 류 되도록 챔버 탑재 중간 입구 로부터 일정 한 거리에 이식 하는 생성 (크게 계산된 입구 길이 보다는 더 이상 결과 및 참조 그림 1). 시스템에서 다른 펌프를 사용 하 여 미래에 타악기 또는 난 류 흐름 조건 하에서 실험을 수행 하는 것을 허용할 것입니다.
유출에서 챔버의 유연한 프레임 챔버를 효과적으로 방지 하 고는 프레임의 내부 높이 조직 두께 대 한 적응 수 있습니다. 전체 시스템의 건설에 오래 견 딘 perfusions 매체의 해당 금액을 사용 하 여 수행 하는 중요 한 순환 흐름 수 있습니다. 이전의 연구에 따라 우리의 접착 프로토콜 가정 10의 세균 접종 복용량 1 시간 보육4,197 CFU/mL. 이러한 설정을 사용 하 여 접착 레벨 이라도 낮은 조직 이식의 채도 없이 세균성 준수의 중요 한 향상을 관찰할 수 있을 만큼 감지, 했다. 또한,이 기간에 그건 긴장이이 연구에 걸쳐 바인딩 잠재적인 차이 느낄 수 있습니다. 여기 해결 전단 매개 변수 생리 범위에 있었고 우리의 목표는 RVOT에는 혈관에 대 한 최적화.
방법의 추가 수정 절차 동안 매체의 더 효율적인 소비에 물론 탑재 하는 셋업 단순화에 집중할 것 이다. 또한, 조직 어셈블리에 대 한 여러 슬롯을 포함 한 새로운 디자인 효율 같은 측면에서 전체 실험을 쉽게 것입니다.
이 단계에서 우리의 방법은 최종 결과에 초점을 맞추고 그리고 조직 표면에 발생 하는 동적 이벤트의 시간 과정 같은 실시간 응용 프로그램에 대 한 테스트 하지 되었습니다. 따라서,이 광범위 한 응용 프로그램에 남아 있다 고려; 그러나, 조직 autofluorescence, 적절 한 형광 현미경 프로토콜의 최적화는 챔버의 적응 등의 문제는 해결 될 필요가 있다. 더욱, 현재 상태에서 메서드 수 있습니다 적응 시킬 현미경 슬라이드에 EC 레이어 세균성 바인딩의 실시간 모니터링을 똑바로 형광 현미경에 의해. 현재, 우리는 박테리아를 시각화 수 및 다른 구성 요소/혈 confocal 현미경 검사 법에 의해 흐름에서 실시간 시각화를 위한 predisposing 게시물 실험 조직 처리를 위한 필요 없이 조직에 준수할 반전 형광으로 현미경
이 연구에서 세균성 접착의 정량화는 형광 현미경 검사 법 지원, 비 정량적 도구 동안 CFU 계산에 의해 제공 되었다. 해상도 문제로 인해 적절 한 현미경 렌즈의 부족에서 발생, 형광 이미징 직렬 희석 보다 우리의 손에 덜 재현할 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구 하 고, 형광 때 적합 한 렌즈는 안정적인 foci 정량화에 대 한 직경 8 m m의 전체 이식 크기를 밝히는 수 정량화에 대 한 검색을 사용 하 여 가능 하다. (예: ImageJ) 이미지 처리 프로그램을 사용 하 여, 수도 절대 형광 단위 조사 조직 표본에 대 한 계량 수 합니다 및 세균성 접착으로 표현 되는데 예 (이식 함께 끼얹는다 내부 컨트롤에 상대적인 신호 비 라는 박테리아).
이 실험의 주요 한계는 일반적으로 체 외에서 연구와 관련 된 문제. 모델 사용 하 여이 생체 외에서 흐름 챔버에 도달 하는 결과 확인 vivo에서 동물 모델에 전송 될 수 있습니다.
결론적으로,이 생체 외에서 모델에는 단일 박테리아, 조직 및 stepwise 방식으로 조직에 세균성 접착의 발병에 기여 하는 전단 기반 요인의 조사 수 있습니다. 본인 사용된 기술 더 효과적인 예방의 개발 및 IE의 치료에 기여할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
없음입니다.
Acknowledgments
이 연구는 rh 주어진 연구 기금 구 루벤 (OT/14/097)의 교부 금에 의해 후 원했다. 수속은 FWO 연구 재단-플랑드르 (벨기에; 박사 후 연구원 번호-12K0916N 부여) RH UZ 루벤의 임상 연구 기금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P.
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A.
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
