Summary
We beschrijven een in-house ontworpen in vitro flow kamer model, waardoor het onderzoek naar bacteriële aanhankelijkheid aan het enten van de weefsels.
Abstract
Verschillende ventielen leidingen en kleppen stent gemonteerde worden gebruikt voor de vervanging van de klep van rechts-ventriculaire uitstroom tractus (RVOT) bij patiënten met aangeboren hartafwijkingen. Wanneer using prothetische materialen toch, zijn deze protheses gevoelig voor bacteriële infecties en verschillende antwoorden van de gastheer.
Identificatie van bacteriële en gastheer factoren die een vitale rol in de endovasculaire hechting van micro-organismen spelen is van belang om de pathofysiologie van het intreden van infecties zoals infectieuze endocarditis (IE) beter te begrijpen en om preventieve strategieën. Daarom is de ontwikkeling van bevoegde modellen te onderzoeken van bacteriële hechting fysiologische schuintrekken omstandigheden noodzakelijk. Hier beschrijven we het gebruik van een nieuw ontworpen in vitro perfusie kamer op basis van parallelle platen waarmee dat de studie van bacteriële aanhankelijkheid aan verschillende onderdelen van graft weefsels zoals blootgesteld extracellulaire matrix, endotheliale cellen en inerte gebieden . Deze methode in combinatie met de kolonie-vormende eenheid (CFU) tellen is voldoende om te evalueren van de neiging van graft materialen naar bacteriële hechting onder stroom. Verder kan, de stroomsysteem van de kamer worden gebruikt om te onderzoeken van de rol van bloedbestanddelen in bacteriële hechting schuintrekken omstandigheden. We toonden aan dat de bron van weefsel, hun bovengrondse morfologie en bacteriesoorten specificiteit zijn niet de belangrijkste bepalende factoren in bacteriële aanhankelijkheid aan weefsels met behulp van onze in-house ontworpen in vitro perfusie model enten.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) maakt gebruik van een verscheidenheid van virulentie strategieën te omzeilen het immuunsysteem verdediging hostsysteem koloniseren van biologische of niet-biologische oppervlakken geïmplanteerd in de menselijke circulatie, hetgeen tot ernstige intravasculaire infecties zoals sepsis leidt en IE1,2,3,4,5. IE blijft een belangrijke behandeling verbonden complicatie bij patiënten na implantatie van prothetische hartkleppen terwijl individuele factoren die bijdragen aan het begin van de IEare niet nog volledig begrepen6,7. Onder stromingscondities tegenkomen bacteriën schuintrekken krachten, die ze moeten overwinnen om te voldoen aan het vaartuig muur8. Modellen, waarmee het samenspel tussen bacteriën en prothetische ventiel weefsel of endotheel onder stroom te bestuderen, zijn van belang als zij de in vivo situatie meer weerspiegelen.
Verschillende specifieke mechanismen vergemakkelijken bacteriële aanhankelijkheid naar endotheliale cellen (ECs) en naar de blootgestelde subendothelial matrix (ECM) leiden tot weefsel kolonisatie en rijping van vegetaties, essentiële eerste stappen in IE9wordt. Diverse Staphylococcus oppervlakte-eiwitten of MSCRAMMs (microbiële oppervlakte componenten herkennen adhesieve matrix moleculen) worden omschreven als bemiddelaars wrijvingscoëfficiënt naar host cellen en aan ECM eiwitten door interactie met moleculen zoals fibronectin, fibrinogeen, collageen en von Willebrand factor (VWF)8,10,11. Echter met het oog op de intra moleculaire vouwen van sommige virulentiefactoren, meestal studeerde in statische toestand, kunnen veel van deze interacties hebben verschillende relevantie in endovasculair infecties in het bloed circuleren.
Daarom presenteren we een in-house ontworpen in vitro parallel-plaat flow kamer model, waarmee de beoordelingvan bacteriële aanhankelijkheid aan verschillende onderdelen van ECM en ECs in het kader van weefsel transplantaten geïmplanteerd in de positie van de RVOT. Het algemene doel van de in dit werk beschreven methode is om te studeren van mechanismen van interactie tussen bacteriën en onderliggende endovasculair weefsels in stromingscondities, die nauw verband houden met het milieu in vivo van bloedbaan ziekteverwekkers zoals S. aureus. Deze nieuwe aanpak richt zich op de gevoeligheid van graft weefsel oppervlakken om bacteriële aanhankelijkheid aan het identificeren van mogelijke risicofactoren voor de ontwikkeling van IE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding Graft weefsels van In Vitro Studies
Opmerking: Drie soorten weefsels werden gebruikt: boviene hartzakje patch (BP), Cryopreserved Homograft (CH) en boviene halsslagader transplantaties (BJV). In het geval van BJV conduit en CH (weefsel door de Europese Bank voor Homograft (EHB) verwerkt en opgeslagen in vloeibare stikstof voorafgaand aan het gebruiken), werden zowel de muur en de terugstroming folders gebruikt. BP patch en BJV conduit werden gekocht van de fabrikanten. Ontdooi de CH na de EHB instructies12vóór gebruik.
- Spoel alle weefsels met 0,9% NaCl vóór gebruik.
- Bereiden weefsel biopsieën met behulp van een wegwerp Huidbiopt stoot op knip circulaire weefsel stukken (10 mm diameter).
- Alle weefsel patches op dezelfde hoogte met behulp van wegwerp steriele scalpels gesneden.
- Voor weefsels met Glutaaraldehyde (bijvoorbeeld BJV conduit) bevestigd, incubeer stukken van de prothese 's nachts bij 4 ° C met 200 g/L van menselijke albumine te neutraliseren de fixeerspray.
- Wassen uit residuen van Glutaaraldehyde met 0,9% NaCl in een plaat van de microtiterplaat. Herhaal 3 keer gedurende 1 minuut.
2. voorbereiding van de bacteriën van de perfusie experimenten
Opmerking: Drie bacteriële isolaten werden gebruikt: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 en S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus en S. epidermidis werden gekweekt bij 37 ° C in al soja Bouillon (TSB) en S. sanguinis werd gekweekt bij 37 ° C met 5% CO2 in hersenen hart infusie Bouillon (BHI).
- Bereiden overnachting cultuur van bacteriën op een solide bloed agarplaat.
- Gebruik een steriele lus de bevroren bacteriën Schraap te enten op een bord bloed agar Mueller-Hinton voor overnachting cultuur bij 37 ° C.
- Gebruik een steriele inoculatie lus te halen een één kolonie van de overnachting bloed agar cultuur en enten in 10 mL van de TSB of BHI in een tube 14 mL en cultuur 's nachts bij 37 ° C.
- Centrifugeer overnachting culturen (3000 x g, 4 ° C, 10 min) en resuspendeer de pellets in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Plaats 14 mL buizen op ijs.
- Bereiden van een aliquoot deel van 3.7 mg/mL oplossing van 5 (6) - carboxy - fluoresceïne N-hydroxy-succinimidyl ester (CF) in ethanol en opgeslagen bij-20 ° C. Verder verdunnen de voorraad voor CF 150 µg/mL met behulp van 'ultrazuiver' water.
Opmerking: Buizen beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie en opgeslagen bij-20 ° C. - Centrifugeer de bacteriën (3000 x g, 4 ° C, 10 min) en resuspendeer de pellets in 800 µL van PBS en voeg 200 µL van de 150 µg/mL CF oplossing (eindconcentratie van 30 µg/mL gebruikt voor perfusie experimenten). Buizen beschermen tegen licht met aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 min met behulp van een roteerschudapparaat.
- Na het labelen, blokkeren met 2% bovien serumalbumine (BSA) oplossing in PBS en spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Volg met een wassen stap met behulp van 10 mL PBS en pellet bacteriën door middel van centrifugeren (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
- Verdun bacteriën met PBS te verkrijgen 107 kolonie-vormende eenheden (kve) /mL (gecontroleerd door CFU tellen op Mueller-Hinton bloed agar platen), hetgeen overeenkomt met een OD600 (extinctie) van 0,65. Houd de buizen in het donker op het ijs voorafgaand aan perfusie experimenten.
Opmerking. Houd in gedachten dat OD600 metingen het benaderende aantal bacteriën weerspiegelen. Als u wilt tellen de inoculatie van de effectieve dosis, is de seriële verdunning-methode een extra noodzakelijke stap om te controleren of de OD gebaseerd nummers, zoals beschreven in paragraaf 3.8.
3. in vitro perfusie experimenten met behulp van een Parallel-plaat Flow kamer
- Mount weefsel Biopten van 10 mm in diameter en dezelfde dikte (bereid in de stappen 1.1-1.5) in een kamer-stroomsysteem met de binnenzijde naar boven om contact met de bacteriële suspensie.
Opmerking: De dezelfde dikte van het weefsel over verschillende transplantaten zorgt ervoor dat het dezelfde hoogte van het weefsel wordt bereikt in het kanaal waardoor de laminaire flow in alle omstandigheden. Alle elementen van de stroom kamer zijn gepresenteerd en beschreven in Figuur 1.- Om te beginnen met het protocol, plaatst u de ronde weefsel stuk tussen een microscoopglaasje met een 8 mm ronde perforatie en een rubberen afdichting.
Opmerking: Het microscoopglaasje bezit de film van de ultra-dunne bodem zodat de generatie van het gat van 8 mm. Samen met de rubberen vel, het bevestigt het weefsel zodat het rechtstreekse contact tussen het model en het stromend medium en voorkomt ook de dislocatie van de biopsie tijdens het experiment. Het oppervlak van het onderzochte weefsel, die is blootgesteld aan de stroom (kleinere diameter) kan niet worden gemanipuleerd door de verlostang. - Plaats de houder met het weefsel in de pakking-werkblad dat is ingesloten in het metalen frame van de bodem van de kamer.
- Bevestig het bovenste metalen frame met het bijbehorende blad van de pakking op het onderste gedeelte van de kamer met het eerder ingevoegde weefsel houder. Vervolgens monteren van de hele kamer met acht schroeven en moeren schroef. Zorg ervoor dat de hoogte van de kamer altijd hetzelfde over transplantaties is.
Opmerking: De hoogte van de kamer moet worden bepaald altijd op aanscherping van de schroeven. Gebruik een schuifmaat of liniaal.
- Om te beginnen met het protocol, plaatst u de ronde weefsel stuk tussen een microscoopglaasje met een 8 mm ronde perforatie en een rubberen afdichting.
- Sluit de stroom zaal met een peristaltische pomp en de vloeistof reservoir met de buizen.
- De weefsels met schorsingen van 107 CFU/mL (gecontroleerd door CFU tellen en in verband met OD600 metingen) fluorescently-geëtiketteerden bacteriën in PBS met een schuifspanning van 3 dyne/cm2 (dyne per vierkante centimeter druk eenheid) door perfuse middelen van de peristaltische pomp (stroom tarief 4 mL/min) voor 1 h met gebruikmaking van een 400 mL bacteriële reservoir (In-house ontwerp, Figuur 1) geconditioneerd bij 37 ° C met behulp van een plaat thermostaat (Tabel van materialen).
- Recirculate continu de bacteriële schorsing van 100 mL met behulp van het dezelfde collectie reservoir.
- Na perfusie, ontmanteling van de kamer om te kunnen de prothese en het weefsel stukje twee keer met 4 mL PBS in een 12-well-plate met behulp van het laboratorium roteerschudapparaat gedurende 3 minuten elke wassen. Vervolgens knip het binnenste deel van de prothese met behulp van een Huidbiopt punch van een kleinere diameter.
- Plaats elke biopsie van weefsel in een aparte 14 mL-buis met 1 mL steriele 0.9% NaCl. Label de buis als #1.
- Loskoppelen van de bacteriën uit het weefsel met behulp van een ultrasoonapparaat bad voor 10 min (amplitude = 100% en frequentie = 45 kHz).
Opmerking: Volledige detachement van bacteriën uit het weefsel protheses dienen te worden geëvalueerd op de incubatie van patches's nachts bij 37 ° C in TSB opgietvloeistof gevolgd door OD600 metingen ten opzichte van patches die zijn behandeld met een gratis oplossing van bacteriën te beheersen. - Gebruik een seriële verdunning methode op Mueller-Hinton bloed agar platen wilt tellen CFUs.
- Voorbereiden van een enkele 14 mL-buis met 10 mL steriele zoutoplossing te maken van de seriële verdunningen van de bacteriële suspensie verkregen na ultrasoonapparaat. Label deze buis als #2.
Opmerking: Voor elk weefsel experiment één buis met 10 mL van 0.9% NaCl is nodig. - Bereiden van drie 14 mL buisjes met 10 mL steriele 0.9% NaCl voor seriële verdunningen van het eerste bacteriële suspensie in stap 2.7. Label de buizen als volgt #3, #4, #5.
Opmerking: Deze stap is noodzakelijk om te weten van het echte CFU nummer in bacteriële suspensie gebruikt voor de perfusie-experiment. - Vortex Meng elke buis voor 15 s. Vortex de buizen met de biopsie van weefsel, alsmede de eerste bacteriële suspensie te maken van de seriële verdunningen.
- Bereiden drie agar platen, twee voor het weefsel experiment (perfusie van bacteriën en controle perfusie van PBS) en de derde een voor de eerste bacteriële suspensie gebruikt voor perfusions.
- Label drie sectoren per plaat voor het weefsel experiment in de volgende manier 10-1, 10-3 en 10-4. Als u wilt tellen het aantal CFUs in de bacteriële perfusates, label de plaat als volgt: 10-1, 10-3, 10-5 en 10-7.
Opmerking: Alle indicaties op de agar platen zoals 10-1, 10-3 , enzovoort verwijzen naar het definitieve aantal CFU/mL berekend op de volgende dag. Controle plaat is niet vereist voor alle sectoren. Vóór gebruik, moeten bloed agar platen worden geplaatst onder de motorkap van laminaire en geopend om overtollig vocht te verwijderen. - Blijven de seriële verdunningen voorbereiden, Breng 100 µL van buis #1 aan buis #2 en meng krachtig met vortex.
- Verspreid 100 µL van de inhoud van buis #1 en #2 op de overeenkomstige sectoren 10-1 en 10-3 van de agarplaat. Ook verspreiden van 10 µL van buis #2 op de sector 10-4, herhaalt u deze stap 4 keer te verkrijgen 4 aparte gezwellen van elk volume van 10 µL.
Opmerking: Als gevolg van het kleine volume dat wordt gebruikt voor beplating op de sector 10-4, is het raadzaam om meerdere aantal druppels te maken van een gemiddeld aantal volwassen CFUs. - Ter voorbereiding van de seriële verdunningen van de oorspronkelijke cultuur, Breng 100 µL van bacteriële suspensie uit stap 2.7 aan buis #3 en meng krachtig met vortex. Voeg 100 µL van buis #3 aan buis #4 en meng goed, herhaal de procedure voor latere buis #5.
- Verspreid 100 µL van de inhoud van buizen #3, #4 en #5 de gecorrigeerde bacteriële suspensie (stap 2.7), respectievelijk naar sectoren 10-3, 10-5, 10-7 en 10-1 van het bloed agarplaat.
- Laat de bloed agar platen in de laminaire kap om lucht droog de bacteriële spreads, typisch voor 10 minuten. Daarna, plaats de platen bij 37 ° C voor overnachting incubatie.
- Na een incubatieperiode van overnachting, tellen de bacteriële kolonies te verkrijgen van het aantal CFUs die voortvloeien uit de hechting aan de weefsel biopsieën, alsmede CFUs/mL in de startende bacteriële suspensie gebruikt voor de perfusie. Uitdrukkelijke resultaat als kve/cm2.
- Voorbereiden van een enkele 14 mL-buis met 10 mL steriele zoutoplossing te maken van de seriële verdunningen van de bacteriële suspensie verkregen na ultrasoonapparaat. Label deze buis als #2.
4. fluorescentie microscopie van zelfklevend bacteriën te enten weefsels op perfusie
- Na perfusie, wassen weefsel stukken met PBS (zie stap 3.5) en knip het binnenste deel van een prothese met behulp van een punch van een kleinere diameter.
- Een plaat van 6-goed voor te bereiden en druppels van montage medium (Tabel of Materials) plaats.
- Plaats elk stukje weefsel met zijn perfused oppervlakte naar beneden op een enkele druppel van montage medium.
- Lees een plaat met behulp van een scanner van de fluorescentie (Tabel van materialen). Instellen van de parameters van excitatie en emissie golflengten volgens een fluorophore gebruikt voor het labelen van bacteriële.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om beter inzicht in de mechanismen achter IE ontwikkeling, dit model in staat stelt de evaluatie van bacteriële en weefsel verbonden factoren aanwezig is in de situatie in vivo van begin van de infectie.
In detail, de aanpak van nieuwe in vitro toestaat te kwantificeren van bacteriële hechting in stromingscondities aan verschillende graft weefsels door zoogdierlevercellen fluorescently geëtiketteerde bacteriën over de weefsels uit te oefenen de schuifspanningen in de fysiologische bereik van 3-10 dyne / cm2 voor de RVOT. In dit werk gebruikten we een debiet van 4 mL/min die overeenkwam met 3 dyne/cm2. Rekening houdend met de hoogte van het kanaal van 0.3 mm over alle weefsel patches, de afstand tussen de gekoppelde graft en de middellange inlaat van ongeveer 39 mm, de kamer van de perfusie (afgebeeld in Figuur 1) garandeert volledig ontwikkelde laminaire flow (Re = 3,89 is aanzienlijk lager dan 2000; de ingang-lengte = 0.05 mm is aanzienlijk kleiner dan de afstand 'inlaat-graft', parameters nodig zijn voor het verstrekken van passende stroom patroon).
Shear stress omstandigheden, werd een soortgelijke bacteriële bijlage over de verschillende weefsels van de prothese waargenomen voor zowel S. aureus en S. epidermidis infectie (Figuur 2 en Figuur 3). Hoewel niet significant, was een trend naar hogere hechting van S. aureus op de CH-folders merkbaar.
Voor S. sanguinis een aanzienlijke vermindering van de naleving van de muur BJV werd gevonden in vergelijking met de BP patch (Figuur 4; P < 0,05). Wanneer het vergelijken van de 3 soorten bacteriënS. sanguinis presenteert aanzienlijk lager hechting op de muur BJV ten opzichte van S. aureus en S. epidermidis (P < 0,01 en P < 0.05 respectievelijk, zie de video). In het algemeen zien we een soortgelijke bacteriële hechting op alle weefsel onderzocht onder schuifspanning.
Onze gegevens uit CFU tellen (Figuur 2 Figuur 3, Figuur 4) worden ondersteund door fluorescentie microscopie met behulp van een scanner van hoge-doorvoer (Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7). Beelden presenteren uitgesproken foci van gelabelde bacteriën vast te houden om te enten weefsels. Als gevolg van deze aanpak konden we direct visualiseren weefsels op perfusie zonder enige post experimentele verwerking ter illustratie.
Resultaten tonen aan dat de bron is van een weefsel van de graft, oppervlakte morfologische verschillen evenals bacteriële Adhesines zijn niet belangrijke determinanten van de naleving van de bacteriëletot deze biologische materialen.
Figuur 1: foto van een nieuw ontwikkelde kamer-stroomsysteem (in-house ontwerp door het departement van Biohybrid & medisch textiel, AME - Helmholtz Instituut voor biomedische technologie, Aachen, Duitsland). A. de stroom kamer (1) bereden stroom set afmetingen LxBxH: 125 x 55 x 18 mm (schroeven in combinatie met schroef-noten houden van de kamer delen samen en zet druk via de metalen frame op de pakkingen ter voorkoming van lekkage); (2) het bovenste gedeelte van de kolom; (3) het bovenste pakking blad met twee gaten voor positiebepaling buis connectoren, die Verbind de stroom zaal met de pomp en de vloeistof reservoir via het buizen stelsel; (4) afstand tussen de inlaat van de middellange- en het weefsel (de ingang lengte); (5) dunne folie dia (met een 8 mm ronde perforatie om de blootstelling van het weefsel aan de bacteriële suspensie) (in een uitsparing van de dia is er de ruimte voor een rubberen pakking B9, te immobiliseren van het weefsel stuk tijdens de perfusie); (6) het blad onder pakking met een speciaal NIS te plaatsen van de weefseltransplantaat gemonteerd tussen de microscoopglaasje en de rubber pakking; (7) het onderste deel van de stroom-kamer; B. de volledige set-up (8) de dunne folie dia; (9) de rubberen afdichting; (10) acht schroeven met bijbehorende (11) acht schroef-noten; (12) het vloeistof reservoir (400 mL); (13) buis systeem; C. perfusie eenheid (14) de peristaltische pomp; (15) gewijd buizen die doorstaat de rillingen van de peristaltische pompwerking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Hechting van S. aureus Cowan te enten weefsels onder stromingscondities. Fluorescently geëtiketteerde bacteriën werden geperfundeerd meer dan 5 graft weefsels (conduit muren of probleem folders) in PBS. Bacteriën werden losgemaakt van geïnfecteerd weefsel stukken met het ultrasoonapparaat. Bacteriële hechting was door seriële verdunningen tellen methode CFU geëvalueerd en aangegeven als CFU/cm2. Alle resultaten worden uitgedrukt als bedoel ± SEM (n > 3 voor terugstroming folders toe te schrijven aan beperking van materiaal; n > 5 voor conduit muren). CFU: kolonie-vormende eenheid; BP: runderen hartzakje; BJV: runderen halsslagader; CH: cryopreserved homograft. Dit cijfer is gewijzigd van Veloso et al. (Journal van thoracale en cardiovasculaire chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Hechting van S. epidermidis te enten weefsels onder stromingscondities. Fluorescently geëtiketteerde bacteriën werden geperfundeerd meer dan 5 graft weefsels (conduit muren of probleem folders) in PBS. Bacteriën werden losgemaakt van geïnfecteerd weefsel stukken met het ultrasoonapparaat. Bacteriële hechting was door seriële verdunningen tellen methode CFU geëvalueerd en aangegeven als CFU/cm2. Alle resultaten worden uitgedrukt als bedoel ± SEM (n > 3 voor terugstroming folders toe te schrijven aan beperking van materiaal; n > 5 voor conduit muren). CFU: kolonie-vormende eenheid; BP: runderen hartzakje; BJV: runderen halsslagader; CH: cryopreserved homograft. Dit cijfer is gewijzigd van Veloso et al. (Journal van thoracale en cardiovasculaire chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Hechting van S. sanguinis te enten weefsels onder stromingscondities. Fluorescently geëtiketteerde bacteriën werden geperfundeerd meer dan 5 graft weefsels (conduit muren of probleem folders) in PBS. Bacteriën werden losgemaakt van geïnfecteerd weefsel stukken met het ultrasoonapparaat. Bacteriële hechting was door seriële verdunningen tellen methode CFU geëvalueerd en aangegeven als CFU/cm2. Alle resultaten worden uitgedrukt als bedoel ± SEM (n = 3 voor terugstroming folders toe te schrijven aan beperking van materiaal; n > 5 voor conduit muren). CFU: kolonie-vormende eenheid; BP: runderen hartzakje; BJV: runderen halsslagader; CH: cryopreserved homograft. Dit cijfer is gewijzigd van Veloso et al. (Journal van thoracale en cardiovasculaire chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Visualisatie van S. aureus Cowan naleving te enten van weefsels door middel van fluorescentie microscopie. Van links naar rechts: BJV conduit muur, BJV bijsluiter, CH muur en CH bijsluiter. Dit cijfer is gewijzigd van Veloso et al. (Journal van thoracale en cardiovasculaire chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Visualisatie van S. epidermidis naleving te enten weefsels met behulp van fluorescentie microscopie. Van links naar rechts: BJV conduit muur, BJV bijsluiter, CH muur en CH bijsluiter. Dit cijfer is gewijzigd van Veloso et al. (Journal van thoracale en cardiovasculaire chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Visualisatie van S. sanguinis naleving te enten weefsels met behulp van fluorescentie microscopie. Van links naar rechts: BJV conduit muur, BJV bijsluiter, CH muur en CH bijsluiter. Dit cijfer is gewijzigd van Veloso et al. (Journal van thoracale en cardiovasculaire chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recente klinische waarnemingen geven speciale alertheid IE als een complicatie bij patiënten die klep vervanging van de RVOT6,13heeft ondergaan. Dysfunctie van de geïmplanteerde klep in IE is het gevolg van bacteriële interactie met de endovasculaire prothese leidt tot uitgebreide inflammatoire en procoagulatie reacties1,14. De gepresenteerde nieuwe in vitro model konden we onderzoeken als verschillen in weefsel structuren en bacteriële factoren kunnen de gevoeligheid voor infecties van in vivo gebruikt transplantaten15moduleren. BJV en CH graft weefsel tonen gelijkaardige neiging naar bacteriële werving in stromingscondities. Daarom blijkt gegevens dat in het algemeen is de bron van het weefsel en de oppervlakte structuur, alsmede specifieke bacteriële zelfklevende eiwitten per se zijn niet de belangrijkste bepalende factoren in het eerste bacteriële naleving.
In het algemeen, trajecten oproept ontsteking, weefsel schade, bloedplaatjes en fibrine depositie op de besmette endovasculair site worden geactiveerd door meerdere spelers1,16. Een groot voordeel van het ontwikkelde in vitro model is de mogelijkheid om te analyseren stapsgewijs de bijdrage van de betrokken spelers. Één bacteriële factoren kunnen worden onderzocht met behulp van mutant bacteriestammen of genetisch gemodificeerde bacteriën uiten van enkele adhesie-eiwitten op hun oppervlak14. Door te kiezen voor verschillende perfusie media, plasma of van bloed, kan de betrokkenheid van plasma-eiwitten en bloedcellen worden geëvalueerd. Verder onderzoek zal worden toegespitst op weefsel gerelateerde factoren waarvoor weefsels vooraf bebroede met bijvoorbeeld plasma-eiwitten voordat gemonteerd in de zaal van de stroom voor latere perfusie worden zal. Sinds de spelers bij te dragen aan het begin van de prothetische ventiel IE onduidelijk blijven, toekomstige studies misschien het ontrafelen van de potentiële factoren door bouwen tot een meer complexe experimentele opzet. Bovendien neemt deze experimentele opzet de mogelijkheid dat de weefsels kunnen worden bezaaid met een laag van de EG voor het analyseren van shear-afhankelijke EG genexpressie. De parallel-plaat flow kamer kunt ook perfusie via EG bedekte Microscoop dia's als gevolg van een flexibele binnenste hoogte van de perfusie-kamer. Verschillende coatings van cover slips met behulp van verschillende extracellulaire matrix eiwitten zijn ook een mogelijkheid om te beoordelen van belangrijke interacties met de subendothelial matrix. Daarnaast kunnen farmacologische remmers of functionele antilichamen worden onderzocht voor hun effect in de respectieve staat in onze zaal van de stroom. Kortom, kunnen verschillende omstandigheden worden bestudeerd door de toenemende complexiteit.
Inflammatoire activering op het besmette gebied van de prothese is een cruciale, schuintrekken-gecontroleerde stap ten gunste van de afzetting van geactiveerde bloedplaatjes en monocyten. De impact van shear krachten op bacteriële aanhankelijkheid aan weefsel oppervlakken van groot belang zijn. Om dit probleem te verhelpen, de nieuwheid van het systeem gepresenteerd in vitro richt zich op de mogelijkheid om te monteren van weefsels in een flow kamer. Dit versterkt de betekenis van de methode dan bestaande alternatieven, waarin meestal statische interacties tussen bacteriën en onderliggende weefsels zijn onderzocht. Hoewel de schuifspanning werd voorgelegd door schudden of andere externe krachten, is het niet gestandaardiseerd op hetzelfde niveau als we van onze uniforme stroming model profiteren kunnen.
In vivo een niet-fysiologische stroom patroon kan het voordeel van bacteriële hechting als het begin van IE op het niveau van de klep van de geïmplanteerde leidingen. Shear stress bleek up-reguleren endothelial inflammatoire parameters zoals cytokine secretie en het vergroten van weefsel factor gemedieerde coagulatie17. De interactie van het onderliggende weefsel gebruikt voor ventiel prothesen met bacteriën en hun invloed op de EG-genexpressie onder schuifspanning is belangrijk voor de bouw van een klep minder geschikt voor bacteriële hechting en chronische ontsteking.
De basale technische kwesties van de gefabriceerde kamer toestaan onderzoeken onder gestandaardiseerde condities in de laminaire flow18. Om ervoor te zorgen de volledig ontwikkelde laminaire flow op de site van het onderzochte weefsel de zaal is gebouwd om te monteren de prothese in een bepaalde afstand van de inlaat van de middellange (aanzienlijk langer dan de lengte van berekende ingang, zie resultaten en Figuur 1). Met behulp van verschillende pompen in het systeem zouden kunnen uitvoeren onder gepulseerde of turbulente stromingscondities experimenten in de toekomst.
Het flexibele frame van de kamer verhindert de zaal effectief van lekken en de interne hoogte van het frame staat aan te passen voor de dikte van het weefsel. De bouw van het hele systeem maakt het mogelijk een circulerende stroom, die van belang is voor het uitvoeren van langdurige perfusions met het gebruik van een respectieve hoeveelheid medium. Op basis van eerdere studies ons hechting protocol aangenomen dat een dosis van de bacteriële inoculatie van 107 CFU/mL voor een 1 uur incubatie4,19. Met behulp van deze instellingen, waren hechting niveaus waarneembaar, zij laag genoeg om het observeren van aanzienlijke verbetering van de naleving van de bacteriële zonder verzadiging van het oppervlak van de prothese weefsel te kunnen. Bovendien, in deze periode, het haalbaar was te merken potentiaalverschillen in bindende over spanningen genomen in deze studie. Schuintrekken parameters hier gericht waren in het bereik van fysiologische en geoptimaliseerd voor de bloedvaten, die onze doelstelling met betrekking tot de RVOT.
Verdere wijzigingen van de methode zal zich richten op efficiënter verbruik van medium tijdens de procedure, alsmede over de vereenvoudiging van de montage van de setup. Bovendien zou een nieuw ontwerp, met inbegrip van meerdere sleuven voor weefsel vergadering een hele experiment in aspecten zoals efficiëntie verlichten.
In dit stadium onze methode is gericht op de resultaten van het eindpunt en werd niet getest voor real-time toepassingen zoals het tijdsverloop van dynamische gebeurtenissen die zich op het oppervlak van het weefsel. Dus deze bredere toepassing nog steeds overwogen; kwesties zoals weefsel autofluorescence, optimalisatie van een passende fluorescentie Microscoop protocol en aanpassingen van de kamer moeten echter worden aangepakt. Verder kan, de methode in zijn huidige staat worden aangepast aan real-time bewaking van bacteriële binding aan EG lagen op Microscoop dia's door rechtop fluorescentie Microscoop. Op dit moment zijn wij in staat om te visualiseren van bacteriën en andere onderdelen/bloedcellen gebonden aan weefsels confocale microscopie zonder behoefte aan een experimentele weefsel nabewerking, die is voor de visualisatie in real time onder stroom door predisponerende ondersteboven fluorescentie microscopen.
In deze studie werd de kwantificering van bacteriële hechting verstrekt door CFU tellen terwijl fluorescentie microscopie een ondersteunende, niet-kwantitatieve tool was. Te wijten aan problemen met naamomzetting die voortvloeien uit het ontbreken van een adequaat Microscoop lens, bleek fluorescentie imaging minder reproduceerbare in onze handen dan seriële verdunningen. Het is echter mogelijk om te scannen voor kwantificering wanneer geschikt objectief de grootte van de volledige prothese van 8 mm diameter voor betrouwbare foci kwantificering verlichten kan fluorescentie gebruiken. Met behulp van een programma van de verwerking van het beeld (zoals ImageJ), absolute fluorescentie eenheden kunnen worden gekwantificeerd voor specimens van het onderzochte weefsel en de bacteriële hechting kan bijvoorbeeld worden uitgedrukt als een relatieve signaal naar de interne controle (transplantaten geperfundeerd met niet-geëtiketteerden bacteriën).
De belangrijkste beperking van deze experimentele instelling zijn de kwesties in verband met in vitro studies in het algemeen. Resultaten bereikt met behulp van deze in vitro -model van het stroom-kamer kunnen worden overgebracht naar een dierlijk model voor in vivo bevestiging.
Kortom, kunnen dit model in vitro onderzoek van één bacteriële-, weefsel- en schuintrekken gebaseerde factoren die bijdragen tot het ontstaan van bacteriële hechting op weefsels op een stapsgewijze manier. De hierbij ingeschakelde kennis kan bijdragen tot de ontwikkeling van meer doeltreffende preventie en behandeling van IE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesponsord door een subsidie van het onderzoek Fonds KU Leuven (OT/14/097) gegeven aan RH. TRV was Postdoctoral Fellow van de onderzoeksstichting FWO - Vlaanderen (België; Verlenen van nummer - 12K0916N) en RH wordt ondersteund door het klinische onderzoek Fonds van UZ Leuven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P.
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A.
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
