Summary
私たちは、社内に設計された体外流れ商工会議所モデル、移植組織の細菌付着の検討を可能にするについて説明します。
Abstract
様々 なバルブ付き導管とステントに取り付けられたバルブは、先天性心疾患患者における右室流出路 (慢性) 弁置換に使用されます。しかし補綴用材料を使用して、これらの移植が細菌感染と様々 な宿主反応を受けやすいです。
重要な役割を果たす微生物の血管内付着細菌とホスト因子の同定が重要である感染性心内膜炎 (IE) などの感染症の発症の病態生理を理解し、予防を開発するには戦略。そのため、生理学的せん断条件下で細菌の付着を調査する有能なモデルの開発が必要です。ここでは、新しく設計された体外灌流チャンバー平行平板に基づく移植組織のさまざまなコンポーネントへの細菌付着に関する研究など細胞外マトリックス、内皮細胞および不活性領域を公開することができますの使用について述べる.このメソッドはコロニー形成と組み合わせるユニット (CFU) カウントは移植材の流れの下で細菌の粘着の方の傾向を評価する適切な。さらに、流れ溜まりされる可能性がありますせん断条件下で細菌の付着の血液成分の役割を調査するため。我々 は、組織、形態、および菌種特異性のソースは当社社内に設計された体外灌流モデルを用いた組織を移植への細菌付着の主要な決定要因ではないことを示した。
Introduction
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) は、さまざまな病原性敗血症など重症の血管内感染につながる人間の循環注入生物や非生物の表面を植民地化ホストの免疫の防衛システムを回避する戦略を採用していて、IE1,2,3,4,5。IE のまま患者の IEare の発症に貢献することの個々 の要因がまだ完全に理解6,7人工心臓弁の移植後合併症が重要な治療に関連付けられています。流れの条件の下で細菌が発生せん断力容器壁8に準拠するために克服する必要があります。彼らはより多くの体内の状況を反映して、流れの下で血管内皮細胞や人工弁組織細菌間の相互作用を研究することで、モデル、関心です。
いくつかの特定のメカニズムは、血管内皮細胞 (Ec) へと組織の植民地化と植生、IE9の重要な初期の手順の中の成熟に至る露出内皮下マトリックス (ECM) に細菌の付着を促進します。様々 なブドウ球菌表面蛋白または MSCRAMMs (認識性接着剤マトリックス分子微生物表面部材) が, フィブロネクチンなどの分子との相互作用によって宿主細胞と ECM タンパク質の付着仲介人として記載されています。フィブリノーゲン、コラーゲン、フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF)8,10,11。ただし、大抵静的な条件で研究のいくつかの病原因子の分子内折りたたみの観点からこれらの相互作用の多くは循環血液中血管内感染の異なる関連性にあります。
本稿で、社内に設計された体外平行平板流チャンバー モデル、慢性位置に注入する組織移植のコンテキストで ECM と ECs のさまざまなコンポーネントへの細菌付着の評価を可能にします。この作品で説明されているメソッドの全体的な目的は細菌やよう血液中の病原体の生体内環境に密接に関連の流れの条件の基になる血管内の組織間の相互作用のメカニズムを研究するには黄色ブドウ球菌。この斬新なアプローチは、IE の開発のための潜在的なリスク要因を識別するために細菌の付着を移植組織表面の感受性に焦点を当てています。
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Protocol
1.体外研究移植組織の準備
注: 組織の 3 つのタイプは使用された: ウシ心膜パッチ (BP)、凍結保存同種 (CH) および牛の頚静脈移植 (BJV)。BJV 導管、CH (組織処理欧州同種銀行 (エッブ) によって、液体窒素を使用する前に格納されている) の場合は、壁と弁のリーフレットの両方が使用されました。BP パッチと BJV 電線管は、メーカーから購入しました。使用前に次のエッブ指示12CH を解凍します。
- 0.9 %nacl 前に使用すると、すべての組織をすすいでください。
- 使用して使い捨ての皮膚生検組織生検循環組織部分 (直径 10 mm) をカットするパンチを準備します。
- 組織のすべてのパッチを使い捨て滅菌メスを使用して同じ高さにカットします。
- グルタルアルデヒド (たとえばBJV 導管) 固定した組織、定着剤を中和するためにアルブミン 200 g/L と 4 ° C で一晩移植作品を孵化させなさい。
- 0.9% グルタルアルデヒドの残渣を洗浄マイクロタイター プレートにおける塩化ナトリウム。 1分間に 3 回繰り返します。
2. 灌流実験用細菌の準備
注: 3 つの細菌分離株を用いて:黄色ブドウ球菌コーワン (ATCC 12598)、ATCC 149900 をS の表皮を、 s. 血統NCTC 7864。黄色ブドウ球菌とsトリプシン大豆スープ (TSB) で 37 ° C で栽培し、, S. 血統ブレインハートインフュー ジョン (BHI) で 5% CO2で 37 ° C で育った。
- 一晩培養中固体血液寒天培地プレート上を準備します。
- 滅菌ループを使用して、冷凍の細菌をこすり、37 ° C で一晩かけて培養のミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレート上に接種します。
- 一晩かけて血液寒天培地培養からシングル コロニーをピックアップし、37 ° C で一晩 14 mL チューブ文化で TSB の BHI 10 mL に接種する滅菌接種ループを使用してください。
- 一晩文化 (g, 4 ° C, 10 分 x 3000) を遠心し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL にペレットを再懸濁します。氷の上 14 mL の管を配置します。
- 5 (6) - カルボキシ - フルオレセイン N-ヒドロキシ - サクシニミジルエステル (CF) エタノールの 3.7 mg/mL の溶液の因数を準備し、-20 ° C で保存さらに「純水」を使用して 150 μ g/mL CF 株式を希釈します。
注: アルミ箔を使用して光から管を保護し、-20 ° C で保存 - 遠心分離機の細菌 (g, 4 ° C, 10 分 x 3000) と 800 μ L の PBS でペレットを再懸濁します 150 μ g/mL CF ソリューション (30 μ G/ml 灌流実験用の最終濃度) を 200 μ l 添加します。アルミ箔を光から保護して管と軌道のシェーカーを使用して 30 分間インキュベートします。
- ラベル付け後に PBS のウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションの 2% をブロックし、スピン (3000 x の g, 4 ° C, 10 分間)。10 mL の PBS とペレットの細菌を用いた遠心分離 (3000 x の g, 4 ° C, 10 分) 洗浄ステップに従ってください。
- PBS (CFU)/mL (CFU を頼りにミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレートによって確認される)、107コロニー形成単位を取得する、外径 φ600 (光密度) 0.65 に対応する細菌を希釈します。灌流実験前に氷に暗闇の中にチューブを維持します。
注意してください。外径600測定が細菌のおおよその数を反映して覚えておいてください。効果的な接種量をカウントするには、シリアル希釈法は 3.8 項で説明したように OD を確認する追加の必要なステップが番号をベースです。
3 平行平板流チャンバーを用いた灌流実験体外。
- 内面の細菌懸濁液との接触を取得する上向き流れ溜まりに 10 mm の直径と同じ厚さ (1.1 〜 1.5 の手順で準備) の組織生検をマウントします。
メモ: 様々 な移植で同じ組織の厚さは、すべての条件で層流をできるようにチャネルで同じ組織高さに達することを確認します。流れ区域のすべての要素を提示し、図 1に示した。- プロトコルを開始するには、8 mm 円形穿孔顕微鏡スライドとゴム製のガスケットの間ラウンド組織片を配置します。
注: 顕微鏡のスライドは 8 mm の穴の生成を許可する極薄底フィルムを所有しています。ゴム シートと共にそれは標本と流れる媒体との間の直接の接触を有効に組織を修正し、また実験中に、生検の転位を防ぐ。(小径) の流れにさらされている調査の組織の表面は、鉗子で操作できません。 - 商工会議所の下の金属フレームに埋め込まれているガスケット シートに組織のホルダーを挿入します。
- 商工会議所の下の部分に対応するガスケット シート上部の金属フレームの以前に挿入されたティッシュ ホルダー付します。その後 8 本のネジで全体の部屋をマウントし、ナットをネジします。商工会議所の高さが常に同じである移植全体を確認します。
注: 商工会議所の高さは、ネジを締める時に常に決まる必要があります。ノギスや定規を使用します。
- プロトコルを開始するには、8 mm 円形穿孔顕微鏡スライドとゴム製のガスケットの間ラウンド組織片を配置します。
- 蠕動ポンプとチューブ流体流れ区域を接続します。
- 3 ダイン/cm2 (平方センチメートルの圧力単位ダイン) のせん断応力 107 CFU/mL (CFU カウントと OD600測定に関連によって確認される) の蛍光標識した細菌は PBS での懸濁液と組織を灌流して蠕動ポンプの手段 (流量 4 mL/分) プレート サーモスタット (材料表) を使用して 37 ° C でエアコン 400 mL 細菌貯水池 (社内設計図 1) を使用して 1 時間。
- 同じコレクション リザーバーを使用して 100 mL の細菌懸濁液を連続的に循環させます。
- 後、グラフトを解放し、3 分間研究所軌道シェーカーを使用して 12 ウェル プレートで PBS の 4 mL で 2 回組織部分を洗浄室を解体します。その後より小さい直径のパンチ皮膚生検を使用して移植片の内側の部分をカットします。
- 滅菌の 0.9 %1 mL を含む独立した 14 mL チューブに各組織生検を配置塩化ナトリウム。#1 としてチューブ ラベルを付けます。
- 10 分間超音波処理浴を用いた組織から細菌をデタッチ (振幅 = 100% と周波数 = 45 kHz)。
注: パッチ OD600測定に続いて TSB 液体培地で 37 ° C で一晩の培養移植が評価されるべき組織から細菌の完全剥離に比べてパッチ細菌無料溶液で処理を制御します。 - ミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレート上 CFUs をカウントするのにシリアル希釈法を使用します。
- 超音波処理後に得られた細菌懸濁液のシリアル希薄を滅菌生理食塩水 10 mL で単一 14 mL のチューブを準備します。第 2 位このチューブ ラベルを付けます。
注: 各組織の実験の 1 つの管 10 ml の 0.9% の塩化ナトリウムは必要です。 - 10 mL 滅菌 0.9 %3 14 mL チューブの準備手順 2.7 から初期の細菌懸濁液のシリアル希薄を塩化ナトリウム。チューブ 3 #、4 #、#5 を次のようにラベルを付けます。
注: この手順は、灌流実験用細菌懸濁液に CFU 実数を知っておく必要です。 - 渦は、15 s. 渦管にシリアル希薄にする初期の細菌懸濁液と同様、組織生検で各チューブをミックスします。
- 3 寒天、組織実験 (細菌の灌流および PBS のコントロール灌流) の 2 つと 3 つ目初期細菌懸濁液 perfusions の使用のための準備します。
- 10-410-3次方法 10-1組織実験用プレートごと 3 つのセクターにラベルを付けます。細菌の perfusates で CFUs の数をカウント、する次のようにプレートをラベル: 10-710-5 10-310-1。
注: すべての兆候の寒天プレートなど 10-1, 10-3 CFU/mL の次の日に計算の最後の番号を参照してください。制御板の任意のセクターを必要はありません。使用前に血液寒天培地プレートを層流フードの下に配置し、余分な水分を削除するを開くください。 - シリアルの希薄の準備を続行するには、#2 管にチューブ #1 の 100 μ L を転送し、渦と精力的にミックスします。
- 1 と対応するセクター 10-1に #2 チューブの内容の 100 μ L と 10-3寒天プレートを します。同様に、拡散チューブ #2 セクター 10-410 μ L、10 μ L の各ボリュームから 4 別々 の成長を取得するこの手順を 4 回繰り返します。
注: セクター 10-4にめっきに使用される小さなボリューム、ためお勧め栽培 CFUs の平均数を作成する液滴の複数の数を持っています。 - 初期の文化のシリアル希薄を準備するには、チューブ #3 ステップ 2.7 からの細菌懸濁液 100 μ L を転送し、渦と精力的にミックスします。#4 管にチューブ #3 の 100 μ L を追加しよく混ぜて、後続管 #5 の手順を繰り返します。
- 血液寒天培地プレート 10-1 10-7 10-5セクター 10-3にチューブ #3 #4 #5、調整細菌懸濁液 (ステップ 2.7) の内容の 100 μ L をそれぞれ、 します。
- 空気層流フードの血液寒天培地プレートにドライな細菌のスプレッドは、通常は 10 分のために残します。その後、一晩インキュベートの 37 ° C でプレートを配置します。
- 一晩インキュベートした後開始細菌懸濁液灌流用 CFUs/mL と同様、組織生検に密着性から生じる CFUs の番号を取得する細菌のコロニーをカウントします。CFU/cm2結果を表現します。
- 超音波処理後に得られた細菌懸濁液のシリアル希薄を滅菌生理食塩水 10 mL で単一 14 mL のチューブを準備します。第 2 位このチューブ ラベルを付けます。
4. 蛍光顕微鏡組織灌流を移植する付着細菌の
- 灌流、洗い流してティッシュ入りの PBS (ステップ 3.5 を参照) より小さい直径のパンチを使用して移植片の内側の部分をカットします。
- 6 ウェル プレートを準備し、メディアをマウント (材料表) の滴を配置します。
- メディアをマウントの一滴に組織灌流表面下方の各部分を置きます。
- 蛍光スキャナー (資材表) を使用して板をお読みください。細菌の分類のために使用される蛍光体によると励起と放射の波長のパラメーターを設定します。
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Representative Results
背後にあるメカニズムを理解するIE の開発、このモデルにより、細菌の評価と感染症発症の体内状況に存在する関連付けられた組織因子。
詳しくは、新規体外アプローチにより、3-10 ダインの生理的な範囲でせん断応力を発揮する組織に蛍光に分類された細菌を灌によって異なる移植組織へのフロー条件で細菌の付着を定量化する/cm2慢性。この作業で 3 ダイン/cm2に相当する 4 mL/min の流量を使用しました。(図 1に示すように) 灌流チェンバ組織のすべてのパッチは、マウントされている接ぎ木と約 39 mm の中型の入口間の距離 0.3 mm の高さを考慮して、十分に発達した層流を保証 (Re = 3.89 です2000 より有意に減少します。入り口の長さ = 0.05 mm が ' 入口-移植 '、適切なフロー パターンを想定して必要なパラメーターの距離よりも大幅に小さい)。
せん断応力の条件下で (図 2および図 3)黄色ブドウ球菌とsの両方の感染症の様々 な移植組織全体と同様の細菌の付着が観察されました。重要ではない、黄色ブドウ球菌の CH リーフレットにも高い密着性傾向は顕著でした。
BP パッチ (図 4と比較して発見されたs. 血統BJV 壁への付着の大幅な削減のためP < 0.05)。黄色ブドウ球菌とsに関連して BJV 壁に有意に低い接着を提示する細菌、S. 血統の 3 種を比較する (P 0.01 < と P < 0.05 はそれぞれ、ビデオを参照してください)。一般に、すべての組織が剪断応力の下で調査すると同様の細菌の付着を見ました。
(図 2図 3図 4) を数える CFU から我々 のデータは、(図 5図 6図 7) 高速スキャナーを使用して蛍光顕微鏡によってサポートされます。画像は、移植組織に付着したラベルの付いた細菌の顕著な巣が提示されます。このアプローチにより灌流実験説明のため処理の任意のポストなしに組織を直接可視化することができました。
結果は移植組織表面の形態学的差異、細菌アドヘシンのソースが細菌付着の主要な決定要因ではないことを示すこれらの生物学的材料にします。
図 1: 新開発フロー チャンバー システム (バイオ ハイブリッド部門・医療用繊維、雨 - 医用生体工学、アーヘン、ドイツのヘルムホルツの研究所で自社設計) のイメージ。A. 流れ区域 (1)マウント寸法 LxWxH のフロー セット: 125 mm × 55 × 18 mm (ネジとナットの組み合わせでつかまってチャンバーのパーツ一緒にいれ圧力を介して金属フレーム漏れを防ぐガスケット);(2)列の上部(3)フロー チャンバーをポンプと流体貯留層チューブ システムによる接続チューブ コネクタを修正する 2 つの穴と上部ガスケット シート媒体の入口と組織 (入り口の長さ); (4)距離(組織の細菌懸濁液への露出を許可する 8 mm 円形穿孔) と(5)薄膜スライド (スライドの凹部にあるゴム製のガスケットB9、灌流中に組織の部分を固定するためのスペース)。(6)組織移植を配置する専用陥凹で一番下のガスケット シート マウント顕微鏡スライドとゴム製のガスケットの間フローの部屋の下の部分(7)B. 完全セットアップ (8)薄箔スライド;ゴム製のガスケット(9)(10) 8 ネジを対応する(11) 8 ねじ-ナット;(12)流体貯留層 (400 mL);(13)管システム;C. 潅流単位 (14)蠕動性ポンプ;(15)専用配管は、蠕動ポンプ作用の厳しさを耐えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: フロー条件の下の組織を移植する黄色ブドウ球菌コーワンの接着。蛍光に分類された細菌が PBS での灌流の以上 5 移植組織 (導管壁や弁のリーフレット)。細菌が sonication によって感染した組織片から戸建。細菌の付着は CFU カウント メソッドを使用してシリアル希薄によって評価され、CFU/cm2として示されます。すべての結果は ± sem (n > 3 材料の制限のための弁のリーフレットの; 導管壁のため n > 5) として表されます。CFU:コロニー形成単位;BP:ウシ心膜;BJV:牛頚静脈;CH:凍結保存同種。この図は、ヴェローゾらから変更されています。(胸部および心血管の外科のジャーナル 155 (1)、325-332 (2018 年))。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: フロー条件の下の組織を移植するsの接着。蛍光に分類された細菌が PBS での灌流の以上 5 移植組織 (導管壁や弁のリーフレット)。細菌が sonication によって感染した組織片から戸建。細菌の付着は CFU カウント メソッドを使用してシリアル希薄によって評価され、CFU/cm2として示されます。すべての結果は ± sem (n > 3 材料の制限のための弁のリーフレットの; 導管壁のため n > 5) として表されます。CFU:コロニー形成単位;BP:ウシ心膜;BJV:牛頚静脈;CH:凍結保存同種。この図は、ヴェローゾらから変更されています。(胸部および心血管の外科のジャーナル 155 (1)、325-332 (2018 年))。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: フロー条件の下の組織を移植するs. 血統の接着。蛍光に分類された細菌が PBS での灌流の以上 5 移植組織 (導管壁や弁のリーフレット)。細菌が sonication によって感染した組織片から戸建。細菌の付着は CFU カウント メソッドを使用してシリアル希薄によって評価され、CFU/cm2として示されます。すべての結果は ± sem として表されます (n = 材料の制限のための弁のリーフレットの 3 導管壁のため n > 5)。CFU:コロニー形成単位;BP:ウシ心膜;BJV:牛頚静脈;CH:凍結保存同種。この図は、ヴェローゾらから変更されています。(胸部および心血管の外科のジャーナル 155 (1)、325-332 (2018 年))。* P < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 蛍光顕微鏡による組織を移植する黄色ブドウ球菌コーワン付着の可視化。左から右へ: CH、CH 壁 BJV リーフレット BJV 管壁面のチラシします。この図は、ヴェローゾらから変更されています。(胸部および心血管の外科のジャーナル 155 (1)、325-332 (2018 年))。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 蛍光顕微鏡を用いて組織を移植するsの付着の可視化。左から右へ: CH、CH 壁 BJV リーフレット BJV 管壁面のチラシします。この図は、ヴェローゾらから変更されています。(胸部および心血管の外科のジャーナル 155 (1)、325-332 (2018 年))。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 蛍光顕微鏡を用いて組織を移植するs. 血統主義遵守の可視化。左から右へ: CH、CH 壁 BJV リーフレット BJV 管壁面のチラシします。この図は、ヴェローゾらから変更されています。(胸部および心血管の外科のジャーナル 155 (1)、325-332 (2018 年))。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
最近の臨床所見は、慢性6,13の弁置換術を受けた患者における合併症として IE に特別な意識を与えます。IE で注入弁の機能不全は、広範な炎症と凝血促進反応1,14につながる血管グラフトと細菌の相互作用の結果です。提示された新規の in vitroモデルでは、組織構造および細菌性因子の相違が生体内で使用される移植15の感染症に対する感受性を調節する可能性が高い場合を調査することができました。BJV と CH 移植組織フロー条件下で細菌の募集の方と同様の傾向を示した。したがって、データは、一般に組織と表面構造と同様、特定の細菌の接着性タンパク質自体のソースは初期の細菌付着の主要な決定要因をお勧めします。
一般に、炎症を引き起こす経路、感染した血管内サイトで組織の損傷、血小板、フィブリン沈着が複数プレーヤー1,16によってアクティブ化されます。先進の in vitroモデルの主な利点は、段階的関与選手の貢献度を分析する機会です。細菌の突然変異系統または彼らの表面の14の 1 つ付着蛋白質を表現する遺伝子組み換え細菌を使用して単一の細菌の要因を調べることができます。選択すると異なる血流メディア、プラズマや血液、血漿蛋白と血液細胞の関与を評価できます。組織に焦点を当てるさらなる研究関連組織になる前に血漿蛋白などで後続の灌流の流れ区域でマウントされている要因です。人工弁の発症に貢献する選手以来不明のすなわち、将来の研究より複雑な実験のセットアップまで建物によって潜在的な要因を解明可能性があります。さらに、この実験のセットアップは、組織がずり EC 遺伝子発現を解析する EC 層でシードできるよう可能性を継承します。平行平板流室灌流チェンバの柔軟な内側の高さにより EC で覆われた顕微鏡スライド上血流ができます。様々 な細胞外マトリックス蛋白質を使用してカバー スリップの別のコーティング subendothelial マトリックスとの重要な相互作用を評価するために可能なオプションがあります。さらに、薬理学的阻害剤や機能性抗体は私たちの流れ区域のそれぞれの状態での影響について調べることができます。要約すると、複雑さを増やすことによって様々 な条件を学ぶことができます。
グラフトの感染部位における炎症性活性化、単球活性化した血小板の付着を支持、断制御の重要なステップです。せん断の衝撃荷重面が主要な関心事の組織に細菌付着。この問題に対処するため示された生体外でシステムの目新しさは流れ区域で組織をマウントする可能性に焦点を当てください。これは、通常細菌と基になる組織の静的な相互作用を行った既存の選択肢を超えて法の意義を強化します。にもかかわらず、せん断応力は、揺れやその他の外力によって堤出された、それが標準化されていない同じレベルに私たちの一様流モデルから得ることができます。
生体内で、非生理的なフロー パターンは、注入管の弁レベルで IE の発症として細菌の付着を支持できることができます。せん断応力は、凝固17が媒介するサイトカイン分泌などの内皮細胞の炎症性パラメーターを調整して組織率を高めるため発見されました。細菌とそのせん断応力下における EC の遺伝子発現に及ぼす影響弁プロテーゼに使用される基になる組織の相互作用は、細菌の付着や慢性炎症の少ないことができる弁を構築することが重要です。
加工室の基底の技術的な問題は、層流18の標準化された条件下で調査を許可します。調査の組織のサイトで十分に発達した層流を確保するため商工会議所中入口から一定の距離で移植をマウントを構築するは (大幅計算入り口の長さより長く参照結果と図 1)。システムに別のポンプを使用して、将来的に拍動または乱流流れの条件の下で実験を行うことになります。
商工会議所の柔軟なフレームは漏れから商工会議所を効果的に防止し、フレームの内部の高さにより、組織厚に適応。システム全体の建設中のそれぞれの量を使用して長期的な perfusions を実行する重要性のある循環流ができます。に基づいて従来接着方式と 10 の細菌の接種用量 1 h 潜伏4,197 CFU/mL。これらの設定を使用して、密着性レベルが検出、とはいえ十分に低い組織移植片表面の飽和せず細菌付着の重要な拡張機能を観察することができます。また、この時間帯では、本手法で株にバインディングに潜在的な相違点に注意することは不可能でした。ここで取り上げるせん断パラメーターは、生理的範囲内であったし、慢性に点で私たちの対象であった血管用に最適化します。
メソッドのさらなる変更はプロシージャの間に媒体のより効率的な消費だけでなく、セットアップを取付の簡素化に焦点を当てます。さらに、組織のアセンブリの複数のスロットを含む新しいデザインは、効率などの面で実験全体を緩和すると。
この段階で私たちのメソッド エンドポイントの結果に焦点を当て、組織表面で発生する動的イベントの経過などのリアルタイム アプリケーションにテストしていませんでした。従って、この広範なアプリケーションは考慮の下で残るただし、組織の自家蛍光、適切な蛍光顕微鏡のプロトコルの最適化だけでなく、商工会議所の適応などの問題に対処する必要があります。さらに、現在の状態のメソッド可能性がありますに適応する顕微鏡のスライドの EC レイヤーに細菌のバインディングのリアルタイム モニタ リング直立蛍光顕微鏡による。現在、我々 は細菌を視覚化することができる、共焦点顕微鏡による流下リアルタイム可視化用素因後処理実験的組織のための必要性なしで組織にバインドされる他の血液コンポーネント/セルが反転蛍光顕微鏡。
この研究では、細菌の付着の定量化は蛍光顕微鏡が支持、非定量的ツール間 CFU カウントによって提供されました。適切な顕微鏡レンズの欠如から生じる解決問題のため蛍光イメージングはシリアル希薄よりも私たちの手でより再現性のあることが判明。それにもかかわらず、適切な対物レンズが信頼性の高い巣定量化のため直径 8 mm の全体グラフトのサイズを照らすときに定量化のため走査型蛍光を使用することが可能です。(ImageJ) などの画像処理プログラムを使用して、絶対蛍光ユニット調査組織標本の定量化する可能性があります、内部統制 (移植を灌流する相対的な信号で細菌の付着はたとえば表現かもしれない非標識細菌)。
この実験的設定の主要な制限は、体外研究に一般的に関連付けられている問題です。体外フロー チャンバー モデルを用いて到達結果は、生体内で確認のための動物モデルに転送でした。
結論としては、この体外モデルで段階的に組織への細菌付着の発症に貢献せんベースの要因、組織細菌の単一の調査できます。ここに有効な知識より効果的な対策の開発と IE の治療に貢献できます。
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Disclosures
なし。
Acknowledgments
本研究は、RH に与えられた研究基金ルーヴェン (OT/14/097) の助成金によって後援されました。TRV は FWO 研究財団 - フランダース (ベルギー; 博士研究員許可番号 - 12K0916N) と RH は UZ ルーヴェン臨床研究基金でサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
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