Summary
אנו מתארים שבאתר מעוצב במבחנה זרימה קאמרית מודל, אשר מאפשר החקירה של חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות.
Abstract
תעלות valved שונים ושסתומים רכוב סטנט משמשים עבור יצוא נכון חדרית בדרכי (RVOT) החלפת שסתום בחולים עם מחלת לב מולדת. בעת השימוש בחומרים תותבת עם זאת, אלה שתלי רגישים זיהומים חיידקיים ותגובות מארח שונים.
זיהוי גורמים בקטריאלי, המארח לשחק תפקיד חיוני endovascular הדבקות של מיקרואורגניזמים, יש חשיבות כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של תחילת זיהומים כמו אנדוקרדיטיס זיהומית (IE) וכדי לפתח מניעתי אסטרטגיות. לפיכך, פיתוח מודלים המוסמכת לחקור אדהזיה חיידקי בתנאים הטיה פיזיולוגית נחוצה. כאן, אנו מתארים את השימוש החדש תוכנן במבחנה זלוף תא בהתבסס על לוחות מקבילים המאפשר שהמחקר של חיידקי ההקפדה מרכיבים שונים של השתלת רקמות כגון חשוף מטריצה חוץ-תאית, תאי אנדותל ואזורי אינרטי . שיטה זו בשילוב עם המושבה יוצרי יחידה (CFU) סופר מספיקה להעריך של הנטייה של שתל חומרים לקראת הדבקה חיידקית תחת זרימה. בהמשך, מערכת קאמרית הזרימה עשויה לשמש כדי לחקור את התפקיד של רכיבי הדם אדהזיה חיידקי בתנאים הטיה. להדגים כי המקור של רקמות, שלהם מורפולוגיה משטח וספציפיות חיידקים אינם היזע הגדולות בחיידקיים ההקפדה להשתיל רקמות באמצעות מודלי שלנו ללא צורך במיקור חוץ מעוצב במבחנה זלוף.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) מעסיקה במגוון אסטרטגיות התקפה אלימה כדי לעקוף את מערכת ההגנה החיסונית המארח להמדינות משטחים ביולוגי או הלא-ביולוגיים מושתלים במחזור האנושי, אשר מוביל לזיהומים קרישה תוך-כלית חמורות כגון אלח דם, IE1,2,3,4,5. שרידים IE לטיפול חשוב הקשורים סיבוך בחולים לאחר ההשתלה של מסתמי לב תותב תוך בודדים גורמים התורמים תחילתה של IEare לא אך מובן לחלוטין6,7. תחת תנאי זרימה, חיידקים מפגש כוחות גזירה, אשר הם צריכים להתגבר על מנת לדבוק קיר הספינה8. מודלים, אשר מאפשרים לימוד יחסי הגומלין בין חיידקים לבין רקמת שסתום תותבת או אנדותל תחת זרימה, הן עניין הם משקפים ויוו המצב יותר.
מספר מנגנונים מסוימים להקל על הדבקות חיידקים לתאי אנדותל (ECs) וכדי חשוף subendothelial המטריקס (ECM) המוביל קולוניזציה רקמת ההבשלה של גידולים, להיות צעדים חיוניים מוקדם ב- IE9. Staphylococcal פני שטח חלבונים שונים או MSCRAMMs (חיידקים משטח רכיבי זיהוי מולקולות מטריקס דבק) תוארו כמתווכים של אדהזיה לתאי המארח, ECM חלבונים על ידי אינטראקציה עם מולקולות כגון fibronectin, פיברינוגן, קולגן, Willebrand פון פקטור (VWF)8,10,11. עם זאת, על רקע קיפול אינטרה-מולקולרית של כמה גורמים התקפה אלימה, למד בעיקר בתנאים סטטי, רבים של אינטראקציות אלה ייתכן רלוונטיות שונים זיהומים endovascular במחזור הדם.
לכן, אנו מציגים ללא צורך במיקור חוץ מעוצב במבחנה במקביל-plate זרימה קאמרית מודל, אשר מאפשר את ההערכה של חיידקי ההקפדה מרכיבים שונים של ECM ו ECs בהקשר של רקמות השתלים מושתלים התנוחה RVOT. המטרה הכללית של השיטה המתוארת בעבודה זו היא ללמוד מנגנונים של האינטראקציה בין חיידקים ורקמות הבסיסית endovascular בתנאים זרימה, אשר קשורה קשר הדוק הסביבה ויוו של פתוגנים למחזור הדם כגון S. aureus. גישה חדשנית זו מתמקדת הרגישות של שתל משטחי רקמות כדי הדבקות חיידקים כדי לזהות גורמי סיכון פוטנציאלי לפיתוח של IE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכינים את השתלת רקמות ללימודי במבחנה
הערה: שלושה סוגים של רקמות שימשו: תיקון קרום הלב שור (BP), שתלי מאותו מין Cryopreserved (CH), ומוחלף שור (BJV). במקרה של צינור BJV ושר (רקמות מעובד על ידי הבנק האירופי מאותו מין (אב) ומאוחסנים לפני השימוש בחנקן נוזלי), שימשו קיר והן valvular פליירים. BP תיקון של צינור BJV נרכשו מן היצרנים. לפני השימוש, יש להפשיר CH בעקבות ההוראות אב12.
- שוטפים לכל רקמות עם 0.9% NaCl לפני השימוש.
- להכין ביופסיות רקמות באמצעות ביופסיה העור חד פעמי ניקוב לחתוך חתיכות רקמה מעגלית (10 מ מ קוטר).
- חותכים כל רקמת טלאים לאותו גובה שימוש חד פעמי סטרילי ואזמלי מנתחים.
- בשביל לרקמות קבוע עם גלוטראלדהיד (לדוגמה BJV conduit), דגירה שתל חתיכות בן לילה 4 ° C עם 200 גרם/ליטר של אלבומין האדם לנטרל את מקבע.
- תשטוף את שאריות גלוטראלדהיד עם 0.9% NaCl בצלחת microtiter. חזור על 3 פעמים במשך דקה אחת.
2. הכנת את החיידקים לניסויים זלוף
הערה: שלושה מבודד חיידקי שימשו: S. aureus קאוון (בקרת האוויר 12598), ס' epidermidis בקרת האוויר 149900, ס sanguinis NCTC 7864. S. aureus ו ס epidermidis גדלו ב- 37 מעלות צלזיוס ב ציר סויה tryptic (TSB), ס' sanguinis גדל ב 37 ° C עם 5% CO2 בהמוח הלב אינפוזיה מרק (BHI).
- מכינים לילה התרבות של חיידקים על צלחת אגר דם מוצק.
- השתמש לולאה סטרילי שתגרד את החיידקים קפוא לחסן על צלחת אגר דם מולר-הינטון לתרבות לילה ב 37 º C.
- השתמש לולאה חיסון סטרילי כדי לאסוף מושבה בודדת מתרבות אגר דם לילה לחסן לתוך 10 מ"ל של TSB או BHI מ 14 ל צינור ותרבות בין לילה ב 37 º C.
- צנטריפוגה תרבויות לילה (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות), resuspend כדורי ב- 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS). במקום 14 מ"ל צינורות על קרח.
- להכין את aliquot של 3.7 מ"ג/מ"ל תמיסת 5 (6) - carboxy - fluorescein N-הידרוקסי-succinimidyl אסתר (CF) אתנול ולאחסן ב-20 ° C. בהמשך לדלל את המניה של CF 150 µg/mL באמצעות מים 'הנדסה גנטית'.
הערה: להגן על צינורות מן האור באמצעות נייר אלומיניום ולאחסן ב-20 ° C. - Centrifuge החיידק (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות), resuspend כדורי ב- 800 µL ל- PBS ולהוסיף 200 µL של הפתרון CF µg 150/mL (סופי ריכוז של 30 µg/mL המשמש זלוף ניסויים). להגן על צינורות מפני אור עם רדיד אלומיניום, תקופת דגירה של 30 דקות באמצעות של תפקודי לב / נשימה.
- לאחר תיוג, לחסום עם 2% של אלבומין שור (BSA) פתרון PBS, ספין (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות). בצע בצעד לשטוף באמצעות 10 מ"ל של PBS צניפה חיידקים על ידי צנטריפוגה (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות).
- לדלל חיידקים עם PBS להשיג 107 המושבה יוצרי יחידות (CFU) /mL (נבדק על ידי CFU סומך על פלטות אגר דם מולר-הינטון), המתאים יתר600 (צפיפות אופטית) של 0.65. לשמור על הצינורות בחושך על הקרח לפני ניסויים זלוף.
שימו לב. זכור כי יתר600 מדידות ישקפו את המספר המשוער של חיידקים. כדי לספור את המינון חיסון יעיל, השיטה דילול טורי היא צעד הכרחי נוסף כדי לוודא OD המבוסס מספרים כמתואר בסעיף 3.8.
3. במבחנה זלוף ניסויים באמצעות תא לזרום במקביל-צלחת
- הר ביופסיות רקמות 10 מ מ קוטר, עובי אותה (להכין בשלבים 1.1-1.5) לתוך מערכת קאמרית זרימה עם השטח הפנימי כלפי מעלה ליצור קשר עם המתלה חיידקי.
הערה: עובי רקמת אותה על פני שתלים שונים מבטיח כי באותו גובה רקמות מתמלאת בערוץ ומאפשר זרימה שכבתית בכל תנאי. כל מרכיבי התא זרימה שהוצגו, המתוארת באיור1.- כדי להתחיל את הפרוטוקול, מקם את פיסת רקמה עגול בין שקופית מיקרוסקופ עם מחורר מעגלית 8 מ"מ אטם גומי.
הערה: השקופית מיקרוסקופ בעל הסרט תחתון דק במיוחד כדי לאפשר את הדור של החור 8 מ מ. יחד עם הגיליון גומי, הוא מתקן את הרקמה כדי לאפשר את מגע ישיר בין הדגימה המדיום זורם, גם מונע שיבוש הביופסיה במהלך הניסוי. פני השטח של רקמת ובדוקים, אשר חשוף לזרימה (קוטר קטן יותר) לא יכול להיות המניפולציה של המלקחיים. - הכנס בעל עם רקמת הגיליון אטם המוטבע במסגרת מתכת התחתון של החדר.
- לצרף את מסגרת מתכת עליון עם הסדין אטם המתאימים על החלק התחתון של התא עם בעל רקמות שהוספת קודם לכן. לאחר מכן לטעון את התא כולו עם שמונת הברגים ולעזאזל עם אגוזים. ודא כי הגובה קאמרית הוא תמיד אותו על פני שתלים.
הערה: גובה החדר צריך להיות נחוש תמיד על הידוק הברגים. השתמש caliper או הסרגל.
- כדי להתחיל את הפרוטוקול, מקם את פיסת רקמה עגול בין שקופית מיקרוסקופ עם מחורר מעגלית 8 מ"מ אטם גומי.
- חבר תא זרימה עם משאבה סחרור, המאגר נוזלים עם הצינורות.
- Perfuse הרקמות עם השעיה של 107 CFU/mL (נבדק על ידי CFU סופר וכל הקשור OD600 מדידות) fluorescently התווית על-ידי חיידקים ב- PBS תוך מתן דגש הטיה של דיין 3/cm2 (דיין ליחידה הלחץ סנטימטר מרובע) על ידי אמצעים משאבת סחרור (תזרים שיעור 4 mL/min) עבור h 1 באמצעות 400 מ ל חיידקי מאגר (בתוך הבית עיצוב, איור 1) ממוזגים ב 37 ° C באמצעות תרמוסטט צלחת (טבלה של חומרים).
- Recirculate ברציפות המתלה חיידקי 100 מ ל באמצעות המאגר אוסף אותו.
- לאחר זלוף, לפרק את התא לשחרר את השתל. ולשטוף את היצירה רקמות פעמיים עם 4 מ"ל של PBS בצלחת 12-ובכן באמצעות ניעור מסלולית מעבדה במשך 3 דקות כל אחד. לאחר מכן חותכים החלק הפנימי של השתל באמצעות ביופסיה העור אגרוף של קוטר קטן יותר.
- מניחים כל ביופסיה רקמות לתוך צינור mL 14 נפרד המכיל 1 מ"ל של סטרילי 0.9% NaCl. תווית את הצינור כמו #1.
- לנתק את החיידקים מן הרקמה באמצעות אמבט sonication 10 דקות (משרעת = 100% ותדירות = 45 קילו-הרץ).
הערה: ניתוק מלא של חיידקים מן הרקמה שתלי צריך להיות מוערך על דגירה של תיקונים בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס במדיום נוזלי TSB ואחריו OD600 מדידות לעומת לשלוט תיקונים מטופלים עם פתרון ללא חיידקים. - להשתמש בשיטה הטורית דילול על פלטות אגר דם מולר-הינטון לספור CFUs.
- הכן צינור יחיד mL 14 עם 10 מ ל תמיסת סטרילית כדי להפוך דילולים טורי של ההשעיה חיידקי שהושג לאחר sonication. תווית הצינורית הזאת כמו #2.
הערה: לכל רקמות ניסוי שפופרת אחת עם 10 מ"ל של 0.9% NaCl הוא הכרחי. - הכינו שלושה צינורות 14 מ עם 10 מ"ל של סטרילי 0.9% NaCl עבור דילולים טורי של השעיה חיידקי הראשוני מהשלב 2.7. תווית הצינורות כדלקמן #3, #4, #5.
הערה: השלב זה נחוץ לדעת המספר CFU אמיתי ההשעיה חיידקי המשמש את הניסוי זלוף. - מערבולת מערבבים כל שפופרת של מערבולת ס' 15 הצינורות עם ביופסיה רקמות, כמו גם ההשעיה חיידקי ראשוני כדי להפוך דילולים טורי.
- להכין שלוש צלחות אגר, שתיים לניסוי רקמות (זלוף של חיידקים זלוף שליטה של PBS), והשלישי על ההשעיה חיידקי ראשוני המשמש perfusions.
- תווית שלוש סקטורים צלחת לניסוי רקמת את האופן 10 הבאים-1, 10-3 , 10-4. כדי לספור את מספר CFUs ב perfusates חיידקי, לתייג את הצלחת כדלקמן: 10-1, 10-3, 10-5 ו- 10-7.
הערה: כל הסימנים על אגר צלחות כגון 10-1, 10-3 וכן הלאה להפנות המספר הסופי של CFU/mL מחושב ביום הבא. לוח הבקרה אינו דורש כל המגזרים. לפני השימוש, פלטות אגר הדם צריך להיות ממוקם מתחת למכסה המנוע למינריות ופתח להוצאת עודפי הרטיבות. - כדי להמשיך מכין את טורי דילולים, להעביר µL 100 צינור #1 שפופרת #2, מערבבים היטב עם מערבולת.
- מורחים µL 100 של התוכן של שפופרת #1 ו #2 על מגזרים 10 המקביל-1 ו- 10-3 של צלחת אגר. באופן דומה, להפיץ את µL 10 צינור #2-סקטור 10-4, חזור על שלב זה 4 פעמים להשיג 4 גידולים נפרדים של כל אמצעי אחסון של 10 µL.
הערה: עקב אמצעי האחסון קטן המשמש עבור ציפוי על גבי סקטור 10-4, מומלץ לקיים מספר מספר טיפות כדי להפוך מספר ממוצע של מבוגר CFUs. - כדי להכין את דילולים טורי של התרבות הראשונית, להעביר µL 100 חיידקי השעיה שלב 2.7 צינור #3, מערבבים היטב עם מערבולת. להוסיף 100 µL צינור #3 צינור #4, מערבבים היטב, חזור על הפעולות לכל העוקבים צינור #5.
- מורחים µL 100 של התוכן של צינורות #3, #4, #5, ההשעיה חיידקי מנוכי עונתיות (שלב 2.7), בהתאמה, על מגזרים 10-3, 10-5, 10-7 ו 10-1 של צלחת אגר דם.
- להשאיר הצלחות אגר דם בשכונה למינריות מהאוויר יבש בכפולות חיידקי, בדרך כלל למשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך לילה הדגירה.
- לאחר דגירה לילה, לספור מושבות חיידקים כדי להשיג את המספר של CFUs הנובע הידבקות רקמות ביופסיות, כמו גם CFUs/mL ההשעיה חיידקי ההתחלה המשמש את זלוף. תוצאות אקספרס כמו CFU/ס מ2.
- הכן צינור יחיד mL 14 עם 10 מ ל תמיסת סטרילית כדי להפוך דילולים טורי של ההשעיה חיידקי שהושג לאחר sonication. תווית הצינורית הזאת כמו #2.
4. זריחה מיקרוסקופיה של חיידקים מודבקת כדי להשתיל רקמות על זלוף
- לאחר זלוף, לשטוף את חתיכות רקמה עם PBS (ראה שלב 3.5) וחותכים את החלק הפנימי של השתלה באמצעות אגרוף של קוטר קטן יותר.
- להכין צלחת 6-ובכן ולמקם טיפות של הרכבה בינונית (טבלה של חומרים).
- במקום כל פיסת רקמה עם משטח perfused כלפי מטה על טיפת הרכבה בינונית.
- קרא צלחת משתמש בסורק קרינה פלואורסצנטית (טבלה של חומרים). להגדיר פרמטרים של אורכי גל עירור, פליטה לפי fluorophore המשמש עבור תיוג חיידקי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי IE פיתוח, מודל זה מאפשר הערכת בקטריאלי ולהציג גורמים רקמות הקשורים במצב ויוו תחילת הזיהום.
בפירוט, הגישה הרומן במבחנה מאפשר לכמת אדהזיה חיידקי בתנאי זרימה לרקמות שונות השתל על ידי פרפוזיה חיידקים fluorescently שכותרתו על הרקמות הפעלת הלחצים הטיה בטווח פיזיולוגיים של דיין 3-10 / ס מ2 עבור RVOT. בעבודה זו, השתמשנו קצב זרימה של 4 mL/min שמשקף דיין 3/ס מ2. לוקחים בחשבון את גובה ערוץ של 0.3 מ מ על פני כל רקמת טלאים, המרחק בין השתל הנטען לים בינוני כ- 39 מ מ, תא זלוף (המוצג באיור1) מבטיח זרימה שכבתית מפותחת (Re = 3.89 הוא נמוכות בהרבה מאלה 2000; אורך הכניסה = 0.05 מ"מ הוא קטן באופן משמעותי יותר המרחק 'כניסת-השתל', הפרמטרים הנחוצים בהנחה תבנית הזרימה המתאימה).
בתנאים גזירה, קובץ מצורף חיידקי דומה לאורך הרקמות שתל שונים נצפתה זיהום S. aureus וס' epidermidis (איור 2 , איור 3). למרות לא משמעותי, מגמת הדבקה גבוה יותר של S. aureus על העלעלים CH היה מורגש.
עבור sanguinis ס הפחתה משמעותית של הדבקות הקיר BJV נמצאה בהשוואה התיקון BP (איור 4; P < 0.05). כאשר משווים את 3 מינים של חיידקיםס sanguinis מציג אדהזיה נמוך משמעותית לקיר BJV ביחס S. aureus ו ס epidermidis (P < 0.01 ו- P < 0.05 בהתאמה, לראות את הוידאו). באופן כללי, הבחנו אדהזיה חיידקי דומה לכל רקמות נחקר תחת גזירה.
הנתונים שלנו מ- CFU לספור (איור 2, איור 3, איור 4) נתמכים על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ משתמש בסורק תפוקה גבוהה (איור 5, 6 איור, איור 7). תמונות מציגים foci בולטת של חיידקים שכותרתו הקפדה על להשתיל רקמות. בשל גישה זו, היינו יכולים לדמיין ישירות רקמות על זלוף ללא כל פוסט נסיוני עיבוד להמחשה.
תוצאות להדגים כי המקור של רקמה השתל, הבדלים מורפולוגיים פני השטח, כמו גם adhesins חיידקי אינם הגורמים העיקריים של הדבקות חיידקיםלחומרים ביולוגיים אלה.
איור 1: תמונה של מערכת הקאמרית החדשה שפותחה זרימה (דיזיין מאת המחלקה של Biohybrid & טקסטיל רפואי, AME - הלמהולץ מכון הנדסה ביו-רפואית, אאכן, גרמניה). א תא זרימה (1) רכוב מערכת זרימה של מידות LxWxH: 125 מ מ x 55 מ"מ x 18 מ"מ (ברגים בשילוב עם אגוזים להחזיק הלשכה חלקים לחץ יחד ולשים באמצעות מסגרת המתכת על אטמים למניעת זליגת); (2) החלק העליון של העמודה; (3) גליון אטם עליון עם שני חורים לתקן מחברים לצנרת, אשר מחברים תא זרימה עם המשאבה ואת המאגר נוזלים באמצעות מערכת צינורות; (4) המרחק בין הים בינונית הרקמה (אורך הכניסה); (5) שקופית רדיד דק (עם 8 מ"מ מעגליות מחורר כדי לאפשר את חשיפת הרקמה ההשעיה חיידקי) (הפסקה של השקופית יש השטח אטם גומי B9, לשתק את פיסת רקמה במהלך זלוף); (6) הגיליון אטם התחתון עם הפסקה ייעודי כדי למקם את השתל רקמת רכוב בין השקופית מיקרוסקופ את אטם גומי; (7) בחלק התחתון של תא זרימה; ב' הסידור המלא (8) השקופית רדיד דק; (9) אטם גומי; (10) 8 ברגים עם המקביל (11) שמונה אגוזים; (12) המאגר נוזלים (400 מ ל); מערכת צינורות (13) ; יחידה ג זלוף (14) משאבת סחרור; (15) מוקדש אבובים זה מתמודד עם הקשיים של ניעת השאיבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הידבקות של S. aureus קאוון כדי להשתיל רקמות תחת תנאי זרימה. Fluorescently שכותרתו חיידקים היו perfused יותר מ-5 שתל רקמות (conduit קירות או פליירים valvular) ב- PBS. חיידקים היו מנותק מן הרקמה הנגועה יצירות מאת sonication. אדהזיה חיידקי היה מוערך על ידי טורי דילולים בשיטת הספירה CFU, המצוין כ- CFU/ס מ2. כל התוצאות באים לידי ביטוי אומר SEM ± (n > 3 עבור עלונים valvular עקב מגבלה של חומר; n > 5 לקירות conduit). CFU: המושבה יוצרי יחידה; BP: קרום הלב שור; BJV: שור ומוחלף; CH: cryopreserved מאותו מין. דמות זו שונתה מ ולוזו. et al. (יומן של ניתוח לב וכלי דם, מותניים 155 (1), (2018) 332-325). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הידבקות של epidermidis ס כדי להשתיל רקמות תחת תנאי זרימה. Fluorescently שכותרתו חיידקים היו perfused יותר מ-5 שתל רקמות (conduit קירות או פליירים valvular) ב- PBS. חיידקים היו מנותק מן הרקמה הנגועה יצירות מאת sonication. אדהזיה חיידקי היה מוערך על ידי טורי דילולים בשיטת הספירה CFU, המצוין כ- CFU/ס מ2. כל התוצאות באים לידי ביטוי אומר SEM ± (n > 3 עבור עלונים valvular עקב מגבלה של חומר; n > 5 לקירות conduit). CFU: המושבה יוצרי יחידה; BP: קרום הלב שור; BJV: שור ומוחלף; CH: cryopreserved מאותו מין. דמות זו שונתה מ ולוזו. et al. (יומן של ניתוח לב וכלי דם, מותניים 155 (1), (2018) 332-325). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הידבקות של sanguinis ס כדי להשתיל רקמות תחת תנאי זרימה. Fluorescently שכותרתו חיידקים היו perfused יותר מ-5 שתל רקמות (conduit קירות או פליירים valvular) ב- PBS. חיידקים היו מנותק מן הרקמה הנגועה יצירות מאת sonication. אדהזיה חיידקי היה מוערך על ידי טורי דילולים בשיטת הספירה CFU, המצוין כ- CFU/ס מ2. כל התוצאות באים לידי ביטוי אומר ± SEM (n = 3 עבור עלונים valvular עקב מגבלה של חומר; n > 5 לקירות conduit). CFU: המושבה יוצרי יחידה; BP: קרום הלב שור; BJV: שור ומוחלף; CH: cryopreserved מאותו מין. דמות זו שונתה מ ולוזו. et al. (יומן של ניתוח לב וכלי דם, מותניים 155 (1), (2018) 332-325). * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ויזואליזציה של S. aureus קאוון הדבקות כדי להשתיל רקמות על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. משמאל לימין: BJV צינור קיר, עלעל BJV, קיר CH ו- CH עלון. דמות זו שונתה מ ולוזו. et al. (יומן של ניתוח לב וכלי דם, מותניים 155 (1), (2018) 332-325). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: ויזואליזציה של הדבקות epidermidis ס כדי להשתיל רקמות באמצעות מיקרוסקופ זריחה. משמאל לימין: BJV צינור קיר, עלעל BJV, קיר CH ו- CH עלון. דמות זו שונתה מ ולוזו. et al. (יומן של ניתוח לב וכלי דם, מותניים 155 (1), (2018) 332-325). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: ויזואליזציה של הדבקות sanguinis ס כדי להשתיל רקמות באמצעות מיקרוסקופ זריחה. משמאל לימין: BJV צינור קיר, עלעל BJV, קיר CH ו- CH עלון. דמות זו שונתה מ ולוזו. et al. (יומן של ניתוח לב וכלי דם, מותניים 155 (1), (2018) 332-325). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תצפיות קליניות האחרונות נותן מודעות מיוחדת IE כמו סיבוך בחולים שעברו החלפת שסתום של6,RVOT13. תפקוד לקוי של השסתום מושתל ב- IE הוא התוצאה של חיידקי אינטראקציה עם השתל endovascular שמוביל נרחב דלקתיות ו procoagulant תגובות1,14. המודל הציג הרומן במבחנה אפשר לנו לחקור אם הבדלים רקמות מבנים וגורמים חיידקי סביר לווסת את הרגישות לזיהומים ויוו בשימוש שתלי15. BJV ורקמות שתל CH הראו נטיה דומה לקראת גיוס חיידקי תנאי הזרימה. לכן, הנתונים מראים כי באופן כללי המקור של הרקמה שלה מבנה פני השטח וכן חלבונים ספציפיים חיידקי דביק כשלעצמם אינם גורמים הקובע העיקריים בהדבקות חיידקים הראשונית.
באופן כללי, מסלולים לעורר דלקת, רקמת נזק, טסיות, פיברין התצהיר באתר נגוע endovascular מופעלים על ידי שחקנים מספר1,16. היתרון העיקרי של המודל מפותחת במבחנה הוא ההזדמנות לנתח stepwise התרומה של השחקנים המעורבים. גורמים חיידקי יחיד יכול ייחקרו באמצעות זני חיידקים מוטנטים או חיידקים מהונדסים המבטאים חלבונים אדהזיה בודד על פני השטח שלהם,14. על ידי בחירת מדיה שונים זלוף, פלזמה או דם, המעורבות של פלזמה חלבונים בתאי הדם ניתן להעריך. מחקרים נוספים יתמקדו רקמות הקשורים גורמים שעבורם רקמות יהיה מראש incubated לדוגמה פלזמה חלבונים לפני רכוב בבית הבליעה זרימה עבור זלוף עוקבות. מאז שחקנים לתרום התחלתה של מסתם תותב כלומר אינן ברורות, מחקרים עתידיים עשויים לפענח הגורמים הפוטנציאליים על-ידי בנייה עד מלכודת ניסיוני מורכבים יותר. יתר על כן, הגדרת הניסוי הזה יירש את האפשרות כי רקמות יכול להיות נזרע עם שכבת EC לנתח הטיה תלויית EC גנים. תא זרימה פלייט-במקביל מאפשרת גם זלוף שקופיות מיקרוסקופ מכוסי EC בשל גובה פנימי גמיש תא זלוף. ציפויים שונים של שער גולשת באמצעות חלבונים מטריצה חוץ-תאית שונים גם הם אופציה אפשרית להעריך חשוב אינטראקציות עם המטריצה subendothelial. בנוסף, מעכבי תרופתי או נוגדנים פונקציונלי יכול ייחקרו על השפעתם במצב המתאים בתא שלנו זרימה. לסיכום, התנאים השונים ניתן יהיה ללמוד על-ידי המורכבות הגוברת.
הפעלת דלקתית באזור הנגוע של השתל היא צעד מכריע, מבוקר הטיה העדפה בתצהיר של טסיות מופעל ומונוציטים. ההשפעה של הטיה כוחות על הדבקות חיידקים רקמות משטחים הם של הדאגה העיקרית. כדי לטפל בבעיה זו, מתמקדת החידוש של מערכת הציג במבחנה האפשרות לטעון רקמות בתוך תא זרימה. זה מחזקת את החשיבות של השיטה מעבר האלטרנטיבות הקיימות, שבו בדרך כלל האינטראקציות סטטי בין חיידקים ורקמות הבסיסית נחקרו. אף-על-פי גזירה הוגשה על ידי טלטול או כוחות חיצוניים אחרים, זה לא בוצע שעבר סטנדרטיזציה תהיה באותה הרמה כמו שאנחנו יכולים להרוויח שלנו מודל זרימת אחיד.
אין ויוו, שאינם הפיזיולוגיות תבנית זרימה יכול טובה אדהזיה חיידקי כמו תחילתה של IE ברמה שסתום של תעלות מושתל. מאמץ גזירה נמצא למעלה-לווסת אנדותל פרמטרים דלקתיות כגון הפרשת ציטוקינים וכדי להגדיל רקמות גורם מתווך קרישה17. האינטראקציה של הרקמה הבסיסית משמש שסתום תותבות עם חיידקים והשפעתם על ביטוי גנים EC תחת גזירה חשוב לבנות שסתום פחות מסוגל אדהזיה חיידקי ודלקת כרונית.
בעיות טכניות הבזליים של תא מפוברק מאפשרים חקירות בתנאים מתוקננים זרימה שכבתית18. כדי להבטיח את זרימה שכבתית מפותחת באתר של הרקמה ובדוקים התא בנויה כדי לטעון השתל במרחק מסוים מן הים בינונית (משמעותית יותר מאשר אורך הכניסה מחושב, לראות תוצאות, איור 1). באמצעות משאבות שונות בתוך המערכת תאפשר ביצוע ניסויים תחת תנאי זרימה פועמת או הסוערת בעתיד.
המסגרת גמישה של התא מונעת התא ביעילות של דולף ומאפשר הגובה הפנימי של המסגרת הסתגלות עבור עובי רקמות. הקמת המערכת כולה מאפשר זרימה מחזורי, אשר יש חשיבות לבצע perfusions לאורך זמן באמצעות כמות בינוני בהתאמה. בהתבסס על מחקרים קודמים שלנו פרוטוקול אדהזיה הניחו מנה חיסון חיידקי של 107 CFU/mL עבור 1 h אינקובציה4,19. באמצעות הגדרות אלה, אדהזיה רמות היו לזיהוי, גם אם נמוכים מספיק כדי להיות מסוגל להתבונן שיפור משמעותי של הדבקות חיידקים ללא רוויה של פני השטח של השתל רקמת. יתר על כן, בתקופה זו של זמן, זה היה ישים לב פוטנציאלי הבדלים מחייב מעבר זנים נלקח במחקר זה. פרמטרים הטיה התייחס כאן היו בטווח הפיזיולוגיות, אופטימיזציה עבור כלי הדם, אשר היו המטרה שלנו בכל הנוגע RVOT.
שינויים ותיקונים נוספים של השיטה יתמקדו על צריכת יעיל יותר של מדיום במהלך ההליך, כמו גם על פישוט של הרכבה ההתקנה. בנוסף, עיצוב חדש כולל חריצים מרובים עבור הרכבה רקמות תקל ניסוי כולו בהיבטים כגון יעילות.
בשלב זה השיטה שלנו מתמקדת התוצאות מובילים, לא נבדקה עבור יישומים בזמן אמת כגון מסלול הזמן של אירועים דינמיים המתרחשים על פני הרקמה. לכן, יישום רחבה יותר נותר תחת שיקול; עם זאת, בנושאים כמו רקמת autofluorescence, אופטימיזציה של פרוטוקול מיקרוסקופ פלורסצנטיות המתאים וכן עיבודים של החדר צריכים להיות מופנית. בהמשך, השיטה במצבו הנוכחי שעשוי להיות מותאם ניטור בזמן אמת של איגוד חיידקי לשכבות EC על שקופיות מיקרוסקופ על-ידי קרינה פלואורסצנטית זקוף מיקרוסקופ. כיום, אנו מסוגלים לדמיין חיידקים, אחרים רכיבים/בתאי הדם לרקמות מחוייב מיקרוסקופיה קונפוקלית ללא צורך עיבוד רקמות ניסיוני פוסט, אשר הוא נטייה עבור הפריט החזותי בזמן אמת תחת הזרימה הפוכה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופים.
במחקר זה, כימות של חיידקי אדהזיה סופק על ידי ספירת CFU בזמן זריחה מיקרוסקופ היה כלי תומך, שאינם כמותיים. עקב בעיות רזולוציה הנובע של עדשת המיקרוסקופ נאותה, קרינה פלואורסצנטית הדמיה התברר להיות פחות לשחזור בידיים שלנו מאשר דילולים טורי. עם זאת, ניתן להשתמש פלורסצנטיות סריקה על כימות כאשר העדשה המטרה מתאים יכול להאיר כל שתל בגודל של 8 מ מ קוטר על כימות foci אמין. באמצעות תוכנית עיבוד תמונה (כגון ImageJ), יחידות קרינה פלואורסצנטית מוחלטת שאולי ניתן לכמת עבור דגימות רקמה ובדוקים, הדבקה חיידקית עשוי להתבטא למשל בתור אות היחסי בקרה פנימית (שתלי perfused עם ללא התווית על-ידי חיידקים).
המגבלה העיקרית של ההגדרה ניסיוני הינם הנושאים הקשורים מחקרים במבחנה באופן כללי. התוצאות הגיעו באמצעות במבחנה זרימה קאמרית מודל זה יכול להיות מועבר במודל חיה לאישור ויוו .
לסיכום, דגם זה במבחנה מאפשר חקירת בקטריאלי ליחיד, רקמות וגורמים מבוסס-הטיה לתרום התחלתה של חיידקי הידבקות רקמות באופן stepwise. הידע זמין בזאת יכול לתרום לפיתוח מניעה יעילה יותר וטיפול של IE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. לא-
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק של לופן KU קרן מחקר (OT 14 097) שניתנה RH. TRV היה בחור דוקטורט של קרן המחקר FWO - פלנדרס (בלגיה; להעניק מספר - 12K0916N) ו RH הוא נתמך על ידי קרן מחקר קליני של UZ לוון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P.
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A.
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
