Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

В Vitro модель параллельно плита перфузии системы для изучения бактериальных приверженность графт тканей

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58476
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1, 5, 2, 1
1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Summary

Мы описываем доме разработан в vitro потока камеры модель, которая позволяет исследование бактериальных приверженность графт тканей.

Abstract

Для замены клапана тракта (Антиангинальную) правого желудочка отток в больных с врожденным пороком сердца используются различные клапанами трубопроводы и клапаны смонтированы стента. При использовании протезов материалов, однако, эти трансплантаты восприимчивы к бактериальной инфекции и различных принимающих ответы.

Идентификация бактериальных и принимающих факторов, которые играют жизненно важную роль в эндоваскулярной прилипание микроорганизмов имеет значение лучше понимать патофизиологию начала инфекций, таких как инфекционный эндокардит (IE) и развивать превентивные стратегии. Таким образом необходима разработка моделей компетентным расследовать бактериальной адгезии в условиях физиологического сдвига. Здесь мы описывают использование недавно разработан в vitro перфузии камеры на основе параллельных пластин что позволяет исследование бактериальных присоединения к различным компонентам лоскута ткани, такие как открытые внеклеточного матрикса, эндотелиальных клеток и инертных районы . Этот метод в сочетании с колонии формирование подразделения (CFU) подсчет является достаточным для оценки склонности трансплантата материалов к бактериальной адгезии под поток. Далее, камерная система потока может использоваться для изучения роли компонентов крови в бактериальной адгезии условиях сдвига. Мы продемонстрировали, что источник ткани, их поверхности морфологии и бактериальных видов специфика не основных определяющих факторов в бактериальных приверженность графт тканей с помощью наших собственных разработан в vitro перфузии модели.

Introduction

Золотистый стафилококк (S. aureus) использует различные стратегии вирулентности обойти системе хозяина иммунной обороны колонизации биологических и небиологических поверхностей, имплантированные в человека циркуляции, что приводит к тяжелой внутрисосудистого инфекций, таких как сепсис и IE1,2,3,4,5. IE остается важным лечение связанных осложнением у больных после имплантации протезов сердечных клапанов при отдельных факторов, способствующих начала IEare не еще полностью понятны6,7. Условиях потока бактерии сталкиваются сдвига, которые им необходимо преодолеть для того, чтобы придерживаться судна стены8. Модели, которые позволяют изучать взаимосвязь между бактерий и протезирование клапана тканей или эндотелием под поток, представляют интерес, поскольку они отражают в естественных условиях ситуация больше.

Несколько конкретных механизмов содействия бактериальных присоединение к эндотелиальных клеток (ECs) и подвергаются subendothelial матрица (ECM), ведущих к ткани колонизации и созревания растительностями, будучи важным первые шаги в IE9. Различные стафилококковых поверхности белки или MSCRAMMs (микробной поверхности компонентов, признавая молекул клея матрица) были описаны как посредники адгезии клеток хозяина и ECM белков, взаимодействуя с молекул, таких как фибронектин, фибриноген, коллаген и Виллебранда фактор (VWF)8,10,11. Однако учитывая складывающиеся внутри молекулярная некоторых факторов вирулентности, главным образом изучены в статических условиях, многие из этих взаимодействий могут иметь различные отношение в эндоваскулярной инфекции в циркулирующей крови.

Таким образом мы представляем доме разработан в vitro параллель плита потока камеры модель, которая позволяет оценивать бактериальной приверженность различных компонентов в контексте Tканевые трансплантаты, имплантированные в положении Антиангинальную ECM и ECs. Общая цель метода, описанного в этой работе является изучение механизмов взаимодействия между бактериями и базовой эндоваскулярных тканей в условиях потока, которые тесно связаны с в естественных условиях окружающей среды кровоток патогенов, таких как S. aureus. Этот новаторский подход фокусируется на восприимчивость трансплантат ткани поверхности бактериальной присоединения для выявления потенциальных факторов риска для развития IE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка лоскута тканей In Vitro исследования

Примечание: Три типа тканей были использованы: патч бычьего перикарда (BP), замораживают Homograft (CH) и говядину яремной графтов (BJV). В случае BJV каналом и CH (ткани Европейского банка по Homograft (EHB) обрабатываются и хранятся в жидком азоте до использования) были использованы как стены, так и клапанной листовки. BP патч и BJV каналом были приобретены от производителей. Перед использованием оттепель CH после инструкции EHB12.

  1. Промойте все ткани с 0,9% NaCl до использования.
  2. Подготовьте биопсия тканей с помощью биопсии кожи одноразовые удар сократить круговая ткани штук (10 мм в диаметре).
  3. Вырежьте все патчи ткани на одинаковой высоте, используя одноразовые стерильные скальпели.
  4. Для тканей с глутаровый (например , каналом BJV) Инкубируйте трансплантата штук на ночь при 4 ° C с 200 г/Л человеческого альбумина для нейтрализации фиксатором.
  5. Промывают остатки глютаральдегид с 0,9% NaCl в микротитровальных плиту.  Повторите 3 раза за 1 минуту.

2. Подготовка бактерий для перфузии экспериментов

Примечание: Три бактериальных изолятов были использованы: S. aureus Коуэн (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 и S. sanguinis НКТЦ 7864. S. aureus и S. epidermidis были выращены при 37 ° C в tryptic соевый бульон (TSB) и S. sanguinis был выращен при 37 ° C с 5% CO2 в мозг сердца вливания бульона (BHI).

  1. Подготовьте ночь культуры бактерий на твердых крови агар тарелку.
    1. Используйте стерильные цикл соскрести замороженных бактерий и прививать на тарелку крови агар Мюллер Хинтон ночь культуры при 37 ° C.
  2. Использовать стерильные прививка цикл подобрать единую колонию от ночи культуры крови агар и инокуляции в 10 мл TSB или BHI в 14 мл трубки и культуре на ночь при 37 ° C.
  3. Центрифуга ночь культур (3000 x g, 4 ° C, 10 мин) и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл-фосфатный буфер (PBS). Место 14 мл пробирок на льду.
  4. Подготовить Алиготе 3,7 мг/мл раствора 5 (6) - карбоксильную - флуоресцеин N-гидрокси succinimidyl эфира (CF) в этаноле и хранить при температуре от-20 ° C. Далее разбавляют фондовой CF до 150 мкг/мл, используя «сверхчистого» воды.
    Примечание: Защитить трубы от света с помощью алюминиевой фольги и хранить при температуре от-20 ° C.
  5. Центрифуга для бактерий (3000 x g, 4 ° C, 10 мин) и Ресуспензируйте гранулы в 800 мкл PBS и 200 мкл раствора CF 150 мкг/мл (конечная концентрация 30 мкг/мл, для перфузии экспериментов). Защитить трубы от света с алюминиевой фольгой и Инкубируйте 30 мин, с использованием орбитальный шейкер.
  6. После маркировки, блок с 2% раствора бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS и вращаться (3000 x g, 4 ° C, 10 мин). Выполните с помощью центрифугирования (3000 x g, 4 ° C, 10 мин) 10 мл PBS и Пелле бактерий мыть шагом.
  7. Разбавьте бактерий с PBS для получения 10 единиц, образуя колонии 7/мл (CFU) (проверено путем подсчета на плитах агара крови Мюллер Хинтон кое), что соответствует ОД600 (оптическая плотность) 0,65. Держите трубы в темноте на льду до перфузии экспериментов.
    Примечание. Имейте в виду, что измерения600 ОД отражает приблизительное количество бактерий. Чтобы подсчитать эффективной вакцинации дозы, метод последовательного растворения является необходимые дополнительный шаг для проверки ОД на основе чисел, как описано в разделе 3.8.

3. в vitro перфузии эксперименты с использованием потока палата параллель-плита

  1. Смонтируйте биопсия тканей 10 мм в диаметре и такой же толщины (подготовлен в шагах 1.1-1.5) в систему камеры потока с внутренней поверхностью вверх, чтобы войти в контакт с бактериальной подвеска.
    Примечание: Такой же толщины ткани через различные графтов гарантирует, что такой же высоты ткани достигается в канале, позволяя ламинарного потока в любых условиях. Все элементы потока камеры представлены и описаны в рисунке 1.
    1. Чтобы начать протокол, место кусок раунда ткани между микроскопа с круговой перфорации 8 мм и резиновой прокладкой.
      Примечание: Микроскопа обладает ультра-тонкий нижней фильм, чтобы позволить поколение отверстия 8 мм. Вместе с резиновый лист он фиксирует ткани для включения прямого контакта между образца и течет средних, а также предотвращает дислокации биопсии во время эксперимента. Поверхности исследуемых тканей, которая подвергается воздействию потока (меньшего диаметра) не может быть манипулирован щипцы.
    2. Вставьте держатель с ткани в прокладка листа, которая встроена в металлический каркас нижней палаты.
    3. Прикрепите верхнюю металлический каркас с соответствующего листа прокладку на нижней части камеры с держателем ранее вставленных ткани. Впоследствии смонтировать всю камеру с восьми винты и гайки. Убедитесь, что высота камеры является всегда то же самое через графтов.
      Примечание: Высота камеры должен всегда определяться после затяжки винтов. Используйте суппорт или правитель.
  2. Подключите камеру потока с перистальтического насоса и резервуара с трубками.
  3. Perfuse ткани с подвески 107 кое/мл (Проверено CFU подсчета и ОД600 измерения)-дневно обозначенных бактерий в PBS с касательное напряжение 3 Дин/см2 (Дина на единицу давления квадратный сантиметр) средства перистальтического насоса (расход 4 мл/мин) за 1 ч, с использованием 400 мл бактериальных водохранилище (внутренний дизайн, рис. 1) выдержаны при 37 ° C, с помощью пластины термостат (Таблица материалов).
  4. Непрерывно рециркуляции бактериальных подвеска 100 мл, используя же накопительного резервуара.
  5. После перфузии Демонтируйте палата освободить трансплантата и мыть кусок ткани два раза с 4 мл PBS в 12-ну пластине с помощью лабораторных орбитальный шейкер 3 мин. Впоследствии вырежьте внутреннюю часть лоскута с помощью биопсии кожи удар меньшего диаметра.
  6. Место каждого биопсия тканей в отдельном 14 мл, содержащие 1 мл стерильного 0,9% NaCl. Этикетке трубки как #1.
  7. Отсоединить бактерии из ткани, с помощью sonication ванна для 10 мин (амплитуда = 100% и частота = 45 кГц).
    Примечание: Полный отряд бактерий из ткани, что трансплантаты должны оцениваться по инкубации патчей на ночь при 37 ° C в жидкой среде TSB следуют ОД600 измерений по сравнению с управления патчи, лечение бесплатно раствором бактерий.
  8. Используйте метод последовательного разрежения на плитах агара крови Мюллер Хинтон рассчитывать CFUs.
    1. Подготовка единого 14 мл тюбик 10 мл стерильного физиологического раствора сделать серийных разведений бактериальных подвески, полученные после sonication. Ярлык этой трубки #2.
      Примечание: Для каждой ткани эксперимент одной трубы с 10 мл 0,9% NaCl является необходимым.
    2. Подготовить три 14 мл пробирки с 10 мл стерильного 0,9% NaCl для серийных разведений первоначальных бактериальных подвески из шага 2.7. Метки трубы следующим #3, #4, #5.
      Примечание: Этот шаг необходим знать реальный номер кое в бактериальных подвеска для эксперимента перфузии.
    3. Вихревой mix каждую пробирку для 15 s. Vortex трубы с биопсия тканей, а также первоначальный бактериальных подвеска сделать серийных разведений.
    4. Подготовьте три плиты агара, два для эксперимента ткани (перфузии бактерий и контроль перфузии PBS) и третье для первоначального бактериальных подвеска, используемые для орошений.
    5. Ярлык три сектора на пластину для эксперимента ткани в следующим образом 10-1, 10-3 и 10-4. Чтобы подсчитать количество CFUs в бактериальных перфузатов, ярлык пластину следующим: 10-1, 10-3, 10-5 и 10-7.
      Примечание: Все указания на агаре пластин например 10-1, 10-3 и так далее ссылаются на окончательное количество КОЕ/мл, рассчитанной на следующий день. Пластина управления не требует каких-либо секторов. Перед использованием плиты агара крови должны быть под ламинарных капюшоном и открыт для удаления избыточной влаги.
    6. Продолжать подготовку серийных разведений, передать трубку #2 100 мкл трубки #1 и энергично перемешивают с вихревой.
    7. Распространение 100 мкл содержимое тюбика #1 и #2 на соответствующие секторы 10-1 и 10-3 плиты агара. Кроме того распространение 10 мкл трубки #2 на сектор 10-4, повторите этот шаг 4 раза получить 4 отдельных наросты от каждого тома 10 мкл.
      Примечание: Из-за малого объема используется для обшивки на сектор 10-4, рекомендуется иметь несколько количество капель сделать среднее количество выросли CFUs.
    8. Подготовить серийных разведений первоначальной культуры, передать трубки #3 100 мкл бактериальной подвеска из шага 2.7 и энергично перемешивают с вихревой. Добавить 100 мкл трубки #3 трубки #4 и хорошо перемешать, повторите процедуру для последующих трубки #5.
    9. Распространение 100 мкл содержимое трубки #3, #4, #5 и скорректированные бактериальных подвеска (шаг 2.7), соответственно, на секторы 10-3, 10-5, 10-7 и 10-1 агар крови пластины.
    10. Оставьте плиты агара крови в ламинарном вытяжки воздуха сухой бактериальных распространяется, как правило, за 10 минут. После этого поместите пластины при 37 ° C для ночи инкубации.
    11. После ночи инкубации граф бактериальных колоний, чтобы получить количество CFUs результате адгезии биопсия тканей, а также CFUs/мл в начальный бактериальных подвеска для перфузии. Экспресс результаты как CFU/см2.

4. флуоресцентной микроскопии придерживался бактерий, чтобы прививка тканей после перфузии

  1. После перфузии, промыть куски ткани с PBS (см. шаг 3.5) и отрезать внутреннюю часть лоскута с помощью штампа меньшего диаметра.
  2. Подготовка 6-ну тарелку и место капельки монтажа средних (Таблица материалов).
  3. Поместите каждый кусок ткани с его перфузии поверхностью вниз на одной капли среднего монтажа.
  4. Читайте тарелку с использованием сканера флуоресцирования (Таблица материалов). Задать параметры волн возбуждения и выбросов согласно Флюорофор, используется для маркировки бактериальных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы лучше понять механизмы за IE развития, эта модель позволяет оценки бактериальных и ткани, связанные факторы представляют в ситуации в естественных условиях наступления инфекции.

В деталях, Роман в vitro подход позволяет дать количественную оценку бактериальной адгезии в условиях потока в разных лоскута ткани, perfusing дневно обозначенные бактерий через ткани, оказывают касательные напряжения в физиологическом диапазоне Дина 3-10 / 2 см для Антиангинальную. В этой работе мы использовали скорость потока 4 мл/мин, что соответствует 3 Дин/см2. Принимая во внимание канала высоты 0,3 мм во всех тканей патчи, расстояние между навесные трансплантата и средних входе около 39 мм, палата перфузии (показано на рис. 1) гарантирует полностью развитых ламинарного потока (Re = 3.89 является значительно ниже, чем 2000; Вход длина = 0,05 мм значительно меньше, чем расстояние «входе трансплантата», параметры, необходимые для себя соответствующие потока).

В условиях напряжение сдвига аналогичными бактериальной вложений через различные ткани трансплантата было отмечено для S. aureus и S. epidermidis инфекции (рис. 2 и рис. 3). Хотя не значительные, тенденция к более высокой адгезии S. aureus к CH листовки был заметным.

Для S. sanguinis значительное сокращение присоединения к стенке BJV был найден, когда по сравнению с BP патч (рис. 4; P < 0,05). Когда сравнение 3 вида бактерийS. sanguinis представляет значительно ниже адгезия к стенке BJV применительно к S. aureus и S. epidermidis (P < 0.01 и P < 0,05 соответственно, смотрите видео). В общем мы наблюдали аналогичные бактериальной адгезии для всех тканей, расследование под напряжение сдвига.

Наши данные от CFU подсчета (рис. 2, рис. 3, рис. 4), поддерживаются микроскопии флуоресцирования, используя высокую пропускную способность сканера (Рисунок 5, Рисунок 6, рис. 7). Образы представляют выраженным очагов помечены бактерий, придерживаясь графт тканей. Благодаря этому подходу мы смогли непосредственно визуализировать тканей после перфузии без каких-либо пост экспериментальной обработке для целей иллюстрации.

Результаты показывают, что источником лоскута ткани, поверхности морфологической различия, а также бактериальных адгезины не являются основными факторами, определяющими присоединения бактериальнойэти биологические материалы.

Figure 1
Рисунок 1: изображение камеры системы недавно разработанных потока (внутренний дизайн Департамента Biohybrid и медицинских текстиль, AME - институт Гельмгольца по биомедицинской инженерии, Аахен, Германия). A. камеры потока (1) смонтированы потока набор размеры ДxШxВ: 125 x 55 x 18 мм (винты в сочетании с гайки удерживайте палаты частей вместе и положил давления через металлический каркас на прокладки для предотвращения утечки); (2) в верхней части столбца; (3) верхняя прокладка лист с двумя отверстиями исправить труб соединители, которые соединяют потока камеры с насоса и резервуара с помощью системы труб; (4) расстояние между средней входе и ткани (длина входа); (5) тонкой фольги слайд (с 8 мм круговой перфорацией, чтобы позволить воздействия на ткани бактериальной подвеска) (в нише слайд есть пространство для резиновой прокладкой B9, обездвижить кусок ткани во время перфузии); (6) нижний прокладка лист с выделенный углубление поставить ткани трансплантата монтируется между микроскопа и резиновая прокладка; (7) в нижней части камеры потока; B. полное set-up (8) слайд тонкой фольги; (9) резиновая прокладка; (10) восемь винтов с соответствующими гайки (11) 8; (12) резервуар для жидкости (400 мл); система труб (13) ; C. перфузии единицы (14) Перистальтический насос; (15) посвятил труб, которые выдерживает суровых перистальтические насосное действие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Адгезия S. aureus Коуэн привить тканей условиях потока. Дневно обозначенные бактерии были перфузии тканей более 5 трансплантата (каналом стены или клапанной листовки) в PBS. Бактерии были оторваны от инфицированных тканей штук по sonication. Бактериальной адгезии была оценена серийных разведений, с помощью метода подсчета кое и указано как CFU/см2. Все результаты выражаются как означает ± SEM (n > 3 для клапанной листовки из-за ограничения материала; n > 5 для стен каналом). Кое: колонии формирование подразделения; BP: бычьего перикарда; BJV: говядину яремной; CH: криоконсервированных homograft. Эта цифра была изменена с Велозу и др. (Журнал грудной и сердечно-сосудистой хирургии 155 (1), 325-332 (2018)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Адгезия S. epidermidis привить тканей условиях потока. Дневно обозначенные бактерии были перфузии тканей более 5 трансплантата (каналом стены или клапанной листовки) в PBS. Бактерии были оторваны от инфицированных тканей штук по sonication. Бактериальной адгезии была оценена серийных разведений, с помощью метода подсчета кое и указано как CFU/см2. Все результаты выражаются как означает ± SEM (n > 3 для клапанной листовки из-за ограничения материала; n > 5 для стен каналом). Кое: колонии формирование подразделения; BP: бычьего перикарда; BJV: говядину яремной; CH: криоконсервированных homograft. Эта цифра была изменена с Велозу и др. (Журнал грудной и сердечно-сосудистой хирургии 155 (1), 325-332 (2018)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Адгезия S. sanguinis привить тканей условиях потока. Дневно обозначенные бактерии были перфузии тканей более 5 трансплантата (каналом стены или клапанной листовки) в PBS. Бактерии были оторваны от инфицированных тканей штук по sonication. Бактериальной адгезии была оценена серийных разведений, с помощью метода подсчета кое и указано как CFU/см2. Все результаты выражаются как означает ± SEM (n = 3 для клапанной листовки из-за ограничения материала; n > 5 для стен каналом). Кое: колонии формирование подразделения; BP: бычьего перикарда; BJV: говядину яремной; CH: криоконсервированных homograft. Эта цифра была изменена с Велозу и др. (Журнал грудной и сердечно-сосудистой хирургии 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Визуализация S. aureus Коуэн присоединения к графт тканей с помощью микроскопии флуоресцирования. Слева направо: BJV каналом стены, BJV листовка, CH стены и CH листовка. Эта цифра была изменена с Велозу и др. (Журнал грудной и сердечно-сосудистой хирургии 155 (1), 325-332 (2018)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Визуализация S. epidermidis присоединения к графт тканей, с помощью микроскопии флуоресцирования. Слева направо: BJV каналом стены, BJV листовка, CH стены и CH листовка. Эта цифра была изменена с Велозу и др. (Журнал грудной и сердечно-сосудистой хирургии 155 (1), 325-332 (2018)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Визуализация S. sanguinis присоединения к графт тканей, с помощью микроскопии флуоресцирования. Слева направо: BJV каналом стены, BJV листовка, CH стены и CH листовка. Эта цифра была изменена с Велозу и др. (Журнал грудной и сердечно-сосудистой хирургии 155 (1), 325-332 (2018)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Последние клинические наблюдения дают специальные осведомленности для IE как осложнение у пациентов, прошедших Замена клапана Антиангинальную6,13. Дисфункция имплантирован клапан в IE является результатом бактериального взаимодействия с эндоваскулярных трансплантата, ведущих к обширных воспалительных и procoagulant реакции1,14. Модель представлена Роман в vitro позволил нам исследовать, если различия в тканевых структур и бактериальные факторы способны модулировать восприимчивость к инфекции в естественных условиях используются трансплантаты15. BJV и CH лоскута ткани показали аналогичные склонности к бактериальной вербовки в условиях потока. Таким образом данные показывают, что в целом источник ткани и ее структура поверхности а также специфические бактериальных адгезивные белки per se не являются основными определяющими факторами в первоначальных присоединения бактериальной.

В общем пути, вызывая воспаление, ткани ущерб, тромбоцитов и фибрин осаждения на сайте зараженном Эндоваскулярная активируются несколько игроков1,16. Основное преимущество модели развитых в пробирке является возможность анализировать шагам вклад участвующих игроков. Одноместный бактериальных факторов можно исследовать с помощью мутантных штаммов бактерий или генетически модифицированных бактерий, выражая одного адгезии белков на их поверхности14. Выбирая различные перфузии СМИ, плазмы или крови, можно оценить участие белков плазмы и эритроцитов. Дальнейшие исследования будут сосредоточены на ткани связанные факторы, для которых ткани будет предварительно инкубируют с например белками плазмы до монтируется в камере потока для последующего перфузии. С игроками, способствуя начала протезирования клапана IE остаются неясными, будущих исследований может подорвать потенциальные факторы здания до более сложных экспериментальной установки. Кроме того эта экспериментальная установка наследует возможность, что ткани может быть заполнена с EC слоем для анализа экспрессии генов EC зависящих от сдвига. Параллель плита потока палата также позволяет перфузии на скольжениях микроскопа EC-покрыты за счет гибкой внутренняя высота камеры перфузии. Разные покрытия скользит крышка, с использованием различных белков внеклеточного матрикса являются также возможным вариантом для оценки важно взаимодействий с субэндотелиальном матрицей. Кроме того для их влияние в соответствующих условиях в нашей камере потока могут расследоваться фармакологических ингибиторы или функциональных антител. В целом различные условия могут быть изучены путем увеличения сложности.

Воспалительные активации трансплантата в зоне заражения является решающую, контролируемые сдвига шаг пользу осаждения активированных тромбоцитов и моноцитов. Влияние сдвига силы на бактериальных приверженность ткани, которую поверхности вызывают серьезную озабоченность. Для решения этой проблемы, новизна представленных в vitro системы сосредоточена на возможность смонтировать тканей в камере потока. Это усиливает значение метода за пределами существующих альтернатив, в которых обычно были расследованы статических взаимодействий между бактериями и основной ткани. Даже несмотря на то, что напряжение сдвига был представлен встряхивания или других внешних сил, она не была стандартизирована на том же уровне как мы можем получить от нашей модели однородность потока.

В естественных условиях, не физиологическая шаблон потока может пользу бактериальной адгезии как наступление IE на уровне клапан имплантированные трубопроводов. Касательное напряжение было установлено, что вверх регулировать эндотелиальной воспалительных параметров, таких как секрецию цитокинов и увеличить коэффициент ткани при посредничестве коагуляции17. Взаимодействие между основной ткани, используемые для протезов клапанов с бактериями и их влияние на экспрессию генов ЕС под напряжение сдвига важно построить вентиля, менее бактериальной адгезии и хронического воспаления.

Базальная технические вопросы изготовлены камеры позволяют расследованиях стандартизированных условиях ламинарных18. Для обеспечения полностью разработанных ламинарного потока на сайте исследуемых тканей камеры построен для монтирования трансплантата в определенном расстоянии от средних входе (значительно больше, чем длина вычисляемых вход, см. результаты и рис. 1). Использование различных насосов в системе позволит выполнять эксперименты условиях пульсирующего или турбулентного потока в будущем.

Эффективно гибкий кадр палаты предотвращает камеры от утечки и внутренняя высота кадра позволяет адаптировать для толщины ткани. Строительство всей системы позволяет циркуляционный поток, который имеет важное значение для выполнения длительной орошений с использованием соответствующих количество средних. На основе предыдущих исследований нашей адгезии протокол себя бактериальный прививка дозе 107 кое/мл для инкубации 1 h4,19. С помощью этих параметров, адгезии уровни были обнаруживаемыми, хотя и достаточно низкой, чтобы иметь возможность наблюдать значительное повышение бактериальной присоединения без насыщения поверхности ткани трансплантата. Кроме того в этот период времени, было целесообразно заметить потенциальные различия в привязке различных штаммов, принятых в этом исследовании. Параметры сдвига, рассматриваемых здесь были в пределах физиологического и оптимизированы для кровеносных сосудов, которые были наши цели в отношении Антиангинальную.

Дальнейшие модификации метода будет сосредоточена на более эффективное потребление среднего во время процедуры, а также на упрощение монтажа установки. Кроме того новый дизайн, включая несколько слотов для ткани Ассамблее облегчит весь эксперимент в такие аспекты, как эффективность.

На данном этапе наш метод ориентирован на результаты конечной точки и не был протестирован на реальном времени приложений, таких как время курс динамических событий, происходящих на поверхности ткани. Таким образом это более широкое применение по-прежнему находится на рассмотрении; Однако необходимо решать вопросы такие ткани аутофлюоресценция, оптимизация Микроскоп флуоресценции соответствующего протокола, а также адаптации камеры. Далее, метод в его текущем состоянии может быть адаптирована к мониторинг в реальном времени бактериальных привязки для EC слои на скольжениях микроскопа вертикально флуоресцентным микроскопом. В настоящее время мы можем визуализировать бактерии и другие компоненты/клетки крови, тканей обязательность confocal микроскопии без необходимости обработки экспериментальных ткани пост, который предрасполагающие для визуализации в реальном времени по потоку, Перевернутый флуоресценции микроскопы.

В этом исследовании количественная оценка бактериальной адгезии оказали CFU подсчета при микроскопии флуоресцирования была благоприятной, неколичественного инструмент. Благодаря резолюции вопросы, обусловленные отсутствием адекватных Микроскоп объектива флуоресценции изображений оказался менее воспроизводимые в наших руках, чем серийных разведений. Тем не менее можно использовать флуоресценции, сканирование для количественной оценки, когда подходящий объектив может осветить весь трансплантата размер 8 мм в диаметре для количественного определения надежных очагов. С помощью программы обработки изображений (таких как ImageJ), абсолютной флуоресценции единиц может быть количественно для образцов исследуемых тканей и бактериальной адгезии может быть выражено например как сигнал относительно внутреннего контроля (графтов увлажненную с -меченых бактерии).

Основным ограничением этой экспериментальной установки являются вопросы, связанные с в vitro исследования в целом. Результаты, достигнутые с помощью этой в vitro модели камеры потока могут быть переданы животной модели для подтверждения в естественных условиях .

В заключение эта модель в vitro позволяет расследование одного бактериальных, ткани и на основе сдвига факторов, способствующих начала бактериальной адгезии тканей в виде ступенчатой. Настоящим включен знаний может способствовать разработке более эффективной профилактики и лечения IE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет.

Acknowledgments

Это исследование было организовано предоставление исследовательский фонд ку Лёвен (OT/14/097) для RH. TRV был после защиты докторской сотрудник исследовательского фонда FWO - Фландрия (Бельгия; Предоставить номер - 12K0916N) и RH поддерживается клинических исследований фонда UZ Лёвен.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium Synovis Surgical Innovations, USA PC-0404SN
Bovine Jugular Vein conduits (BJV) Contegra conduit; Medtronic Inc, USA M333105D001
CH cryopreserved homograft European Homograft Bank (EHB) -
Acu-Punch Acuderm Inc, USA P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
human Albumin Flexbumin; Baxter, Belgium BE171464
LOT:16G12C
Tryptic soy broth (TSB) Fluka, Steinheim, Germany 22092-500G
Heart infusion broth (BHI) Fluka 53286-500G
Phosphate buffered saline (PBS). Gibco 14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) Sigma-Aldrich, Germany 21878-100MG-F
Peristaltic pump (MODEL ISM444B) Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany 631942-2
Sonication bath VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa 142-6044 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen by ThermoFisher P36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa 29027886
Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ Millipore 87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) Sarstedt 94.6140.102
1-well on Lumox detachable Sarstedt 94.6150.101
Stainless Steel - surgical Blades Swann-Morton 311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD Cole-Parmer EW-95702-06 Temperature range: –80 to 200°C
Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure
PharMed BPT Tubing Saint-Gobain AY242012 Autoclavable 30 min at 121°C
Tygon LMT-55 Tubing Saint Gobain Performance Plastics™ 15312022
Thermostat BMG BIOMEDIZINTECHNIK 300-0042 230V, 90VA, 50Hz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
  2. Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
  3. Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
  4. Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
  5. Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
  6. Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
  7. Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
  8. Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
  9. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
  10. Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
  11. Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
  12. Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
  13. Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
  14. Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
  15. Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
  16. Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
  17. Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
  18. Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
  19. Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).

Tags

Биология развития выпуск 143 золотистый стафилококк инфекционного эндокардита адгезии субэндотелиальном матрица касательное напряжение потока камеры клапанной лоскута ткани Антиангинальную
<em>В Vitro</em> модель параллельно плита перфузии системы для изучения бактериальных приверженность графт тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ditkowski, B., Veloso, T. R.,… More

Ditkowski, B., Veloso, T. R., Bezulska-Ditkowska, M., Lubig, A., Jockenhoevel, S., Mela, P., Jashari, R., Gewillig, M., Meyns, B., Hoylaerts, M. F., Heying, R. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58476, doi:10.3791/58476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter