Summary
Descrevemos um in-house projetado em vitro fluxo modelo de câmara, que permite a investigação de adesão bacteriana ao enxerto de tecidos.
Abstract
Várias condutos valvulados e válvulas de stent montado são utilizadas para substituição de válvula de trato (RVOT) de saída do ventrículo direito em pacientes com doença cardíaca congênita. Quando usando materiais protéticos, no entanto, esses enxertos são suscetíveis a infecções bacterianas e várias respostas do hospedeiro.
Identificação de fatores bacterianos e anfitrião que desempenham um papel vital na endovascular aderência dos microorganismos é de importância para compreender melhor a fisiopatologia da superveniência de infecções como a endocardite infecciosa (IE) e desenvolver preventiva estratégias. Portanto, o desenvolvimento de modelos competentes para investigar a adesão bacteriana em condições fisiológicas de cisalhamento é necessário. Aqui, descrevemos o uso de um recém-projetado em vitro perfusão câmara baseado em placas paralelas que permite o estudo da adesão bacteriana aos diferentes componentes dos tecidos de enxerto como expostos a matriz extracelular, células endoteliais e áreas inertes . Esse método combinado com formadoras de Colônia (CFU) unidade de contagem é adequada para avaliar a propensão dos materiais de enxerto para adesão bacteriana sob fluxo. Além disso, o sistema de câmara de fluxo pode ser usado para investigar o papel dos componentes do sangue na adesão bacteriana sob condições de cisalhamento. Temos demonstrado que a fonte de tecido, sua morfologia superficial e especificidade de espécies bacterianas não são os principais fatores determinantes na adesão bacteriana enxertar tecidos usando nosso modelo de perfusão in-house projetado em vitro .
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) emprega uma variedade de estratégias de virulência para burlar o sistema de defesa imunológica host colonizando superfícies biológicas ou não biológicos, implantadas na circulação humana, que leva a graves infecções intravasculares como sepse e IE,1,2,3,4,5. Restos de IE um tratamento importante associado a complicação em pacientes após o implante de válvulas protéticas do coração enquanto factores individuais, contribuindo para o aparecimento de IEare não ainda plenamente compreendido6,7. Sob condições de fluência, as bactérias encontram forças de cisalhamento, que eles precisam superar para aderir ao vaso parede8. Modelos, que permitem estudar a interação entre bactérias e tecido da prótese valvular ou endotélio sob fluxo, são de interesse como eles refletem na vivo situação mais.
Vários mecanismos específicos facilitam a aderência bacteriana às células endoteliais (ECs) e a matriz de subendothelial expostos (ECM) levando a colonização do tecido e maturação de vegetações, sendo essenciais primeiros passos no IE9. Várias proteínas de superfície estafilocócicas ou MSCRAMMs (componentes superfície microbianas reconhecer moléculas da matriz adesiva) têm sido descritos como mediadores de adesão às células do hospedeiro e a proteínas de ECM interagindo com moléculas como a fibronectina, fator de fibrinogênio, colágeno e von Willebrand (VWF)8,10,11. No entanto, tendo em conta a dobrar intra molecular de alguns fatores de virulência, estudadas na maior parte em condições estáticas, muitas dessas interações podem ter diferente relevância nas infecções endovascular na circulação de sangue.
Portanto, apresentamos um in-house projetado em vitro fluxo paralelo-placa modelo de câmara, que permite a avaliação da aderência bacteriana aos diferentes componentes do ECM e ECs no contexto de enxertos de tecido implantado na posição RVOT. O objetivo geral do método descrito neste trabalho é estudar os mecanismos de interação entre as bactérias e os tecidos subjacentes endovascular em condições de fluxo, que estão intimamente relacionados com o ambiente na vivo de patógenos de circulação sanguínea, tais como S. aureus. Esta nova abordagem enfoca a susceptibilidade de superfícies de tecido de enxerto para aderência bacteriana para identificar potenciais fatores de risco para o desenvolvimento do IE.
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Protocol
1. preparar o enxerto de tecidos para estudos In Vitro
Nota: Três tipos de tecidos foram utilizados: patch de pericárdio bovino (BP), enxertos criopreservado Homograft (CH) e bovinos de Veia Jugular (BJV). Em caso de conduta BJV e CH (tecido processadas pelo Banco Europeu de Homograft (EHB) e armazenados em nitrogênio líquido antes de usar), foram utilizados tanto a parede e folhetos valvulares. Patch de BP e conduíte BJV foram comprados de fabricantes. Antes da utilização, descongele o CH seguindo as instruções de EHB12.
- Lave todos os tecidos com 0,9% NaCl antes de usar.
- Prepare-se biópsias de tecido usando uma biópsia de pele descartável punch para cortar pedaços de tecido circular (10 mm de diâmetro).
- Corte todos os patches de tecido para a mesma altura usando bisturis estéril descartáveis.
- Em tecidos fixados com glutaraldeído (por exemplo conduit BJV), incube pedaços de enxerto durante a noite a 4 ° C com 200 g/L de albumina humana para neutralizar o fixador.
- Lavar resíduos de glutaraldeído com 0,9% NaCl em uma placa de microtitulação. Repeti 3 vezes durante 1 minuto.
2. preparar as bactérias para experimentos de perfusão
Nota: Três isolados bacterianos foram utilizados: Cowan (ATCC 12598) S. aureus , s. epidermidis ATCC 149900 e S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus e S. epidermidis foram cultivadas a 37 ° C em caldo tryptic soja (TSB) e S. sanguinis foi cultivado a 37 ° C com 5% CO2 em caldo de infusão cérebro coração (BHI).
- Prepare uma noite cultura de bactérias em uma placa de ágar de sangue sólido.
- Usar um loop estéril para raspar as bactérias congeladas e inocular em uma placa de ágar sangue de Mueller-Hinton para cultura durante a noite a 37 ° C.
- Usar um loop de inoculação estéril para pegar uma única colônia da cultura ágar sangue durante a noite e inocular em 10 mL de TSB ou BHI em um tubo de 14 mL e cultura durante a noite a 37 ° C.
- Centrifugar as culturas durante a noite (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e ressuspender as pelotas em 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS). Coloque os tubos de 14 mL no gelo.
- Prepare-se uma alíquota da solução de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxi - fluoresceína N-hidróxi-succinimidil éster (CF) em etanol e armazenar a-20 ° C. Dilua ainda mais o estoque de CF para 150 µ g/mL, usando água 'ultrapura '.
Nota: Proteger os tubos de luz usando a folha de alumínio e armazenar a-20 ° C. - Centrifugar as bactérias (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e Resuspenda as pelotas em 800 µ l de PBS e adicione 200 µ l da solução CF 150 µ g/mL (concentração final de 30 µ g/mL, usado para experiências de perfusão). Proteger os tubos de luz com papel alumínio e incube por 30 minutos usando um agitador orbital.
- Depois da rotulagem, bloco com 2% de solução de albumina de soro bovino (BSA) em PBS e girar (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Siga com uma etapa de lavagem usando 10 mL de PBS e pelota bactérias por centrifugação (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
- Dilua as bactérias com PBS para obter 10 unidades formadoras de colônia de7 (CFU) /mL (verificado pela UFC contando com placas de sangue Ágar Mueller-Hinton), que corresponde a uma OD600 (densidade óptica) de 0,65. Manter os tubos no escuro no gelo antes experimentos de perfusão.
Romance Tenha em mente que as medições de600 OD refletem o número aproximado de bactérias. Para contar a dose de vacina eficaz, o método de diluição serial é uma etapa adicional necessária para verificar o OD com base em números, conforme descrito na seção 3.8.
3. in vitro perfusão experimentos utilizando uma câmara de fluxo paralelo-placa
- Monte de biópsias de tecido de 10 mm de diâmetro e a mesma espessura (preparado nas etapas 1.1-1.5) em um sistema de câmara de fluxo com a superfície interior voltada para cima para entrar em contato com a suspensão bacteriana.
Nota: A mesma espessura de tecido através de vários enxertos garante que a mesma altura de tecido é alcançada no canal permitindo o fluxo laminar em todas as condições. Todos os elementos da câmara de fluxo são apresentados e descritos na Figura 1.- Para começar o protocolo, coloque o pedaço de tecido redondo entre uma lâmina de microscópio com uma perfuração circular de 8 mm e uma junta de borracha.
Nota: O microscópio possui o filme ultra-fino inferior para permitir a geração do furo de 8 mm. Juntamente com a folha de borracha, ele corrige o tecido para permitir o contato direto entre a amostra e o fluxo médio e também previne a luxação da biópsia durante o experimento. A superfície do tecido investigada, que é exposta ao fluxo (diâmetro menor) não pode ser manipulada pelo fórceps. - Encaixe o suporte com o tecido a folha da gaxeta que está incorporada no quadro de metal inferior da câmara.
- Fixe a estrutura de metal superior com a folha da gaxeta correspondente à parte inferior da câmara com o suporte do tecido inserido anteriormente. Posteriormente montar a câmara inteira com oito parafusos e porcas de parafuso. Certifique-se que a altura da câmara é sempre o mesmo através de enxertos.
Nota: A altura da câmara deve ser determinada sempre sobre os parafusos de aperto. Use um paquímetro ou régua.
- Para começar o protocolo, coloque o pedaço de tecido redondo entre uma lâmina de microscópio com uma perfuração circular de 8 mm e uma junta de borracha.
- Ligue a câmara de fluxo com uma bomba peristáltica e o reservatório do líquido com os tubos.
- Perfundir os tecidos com suspensões de 107 UFC/mL (verificado pela UFC contando e relacionadas com medições de600 OD) bactérias fluorescente-etiquetadas em PBS com uma tensão de cisalhamento de 3 Dina/cm2 (Dina por centímetro quadrado unidade de pressão) por meios da bomba peristáltica (4 mL/min de taxa de fluxo) para 1 h, usando um reservatório 400ml bacteriana (projeto In-house, Figura 1) condicionado a 37 ° C, usando um termostato de placa (Tabela de materiais).
- Recircular continuamente a suspensão bacteriana de 100 mL, usando o mesmo reservatório.
- Após a perfusão, desmonte a câmara para liberar o enxerto e lavar a peça de tecido duas vezes com 4 mL de PBS em uma placa de 12 usando o agitador orbital de laboratório por 3 min cada. Posteriormente, corte a parte interna da prótese usando uma biópsia de pele soco de um diâmetro menor.
- Coloque cada biópsia do tecido num tubo separado 14 mL contendo 1 mL de estéril 0,9% NaCl. Rotule o tubo como #1.
- Separar as bactérias do tecido usando um banho sonication por 10 min (amplitude = 100% e frequência = 45 kHz).
Nota: Completo desapego das bactérias do tecido enxertos devem ser avaliados após incubação de patches durante a noite a 37 ° C, em meio líquido TSB, seguido por medições de600 OD comparado para controlar os patches tratadas com uma solução livre de bactérias. - Use um método de diluição serial em placas de ágar sangue de Mueller-Hinton para contar CFUs.
- Prepare um tubo único 14 mL com 10 mL de solução salina estéril para fazer diluições em série da suspensão bacteriana obtidos após sonication. Rotule este tubo como #2.
Nota: Para cada tecido experimento um tubo com 10 mL de 0,9% NaCl é necessário. - Prepare-se três tubos de 14 mL com 10ml de estéril 0,9% NaCl para diluições em série de suspensão bacteriana inicial do passo 2.7. Rotule os tubos como segue 3 #, 4 #, 5 #.
Nota: Este passo é necessário saber o número real de UFC em suspensão bacteriana, usado para o experimento de perfusão. - Vórtice misturar cada tubo de vórtice s. 15 os tubos com a biópsia de tecido, bem como a suspensão bacteriana inicial para fazer diluições em série.
- Prepare três placas de ágar, dois para o experimento de tecido (perfusão de bactérias e controle da perfusão de PBS) e um terceiro para a suspensão bacteriana inicial usado para perfusions.
- Rotule a três setores por prato para o experimento de tecido da seguinte forma 10-1, 10-3 e 10-4. Para contar o número de CFUs na perfusates bacteriana, rotular o prato da seguinte forma: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7.
Nota: Todas as indicações em ágar placas como 10-1, 10-3 e assim por diante referem o número final de UFC/mL, calculado no dia seguinte. Placa de controle não exige qualquer setores. Antes da utilização, placas de ágar sangue devem ser colocadas sob o capô laminar e abriu para remover o excesso de umidade. - Para continuar a preparar as diluições em série, transferir 100 µ l do tubo #1 para o tubo #2 e misture vigorosamente com vortex.
- Espalhou-se 100 µ l do conteúdo do tubo #1 e #2 para o correspondente de setores 10-1 e 10-3 da placa de ágar. Da mesma forma, espalhar 10 µ l de tubo #2 sobre o setor 10-4, repita esta etapa 4 vezes para obter 4 crescimentos separados de cada volume de 10 µ l.
Nota: Devido ao pequeno volume usado para chapeamento para o setor 10-4, é aconselhável ter vários número de gotas para fazer um número médio de CFUs crescidos. - Para preparar as diluições de série da cultura inicial, transferir 100 µ l de suspensão bacteriana do passo 2.7 para tubo #3 e misture vigorosamente com vortex. Adicionar 100 µ l do tubo #3 #4 de tubo e misture bem, repita o procedimento para tubo subsequente #5.
- Espalhou-se 100 µ l do conteúdo dos tubos 3 #, 4 #, 5 # e a suspensão bacteriana ajustada (passo 2.7), respectivamente, para os setores de 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 da placa de ágar sangue.
- Deixe as placas de ágar sangue de capuz laminar de ar seco os spreads bacterianos, normalmente por 10 minutos. Depois, coloque as placas a 37 ° C para incubação durante a noite.
- Após a incubação durante a noite, conte as colônias bacterianas para obter o número de CFUs resultantes da adesão a biópsias de tecidos, bem como CFUs/mL na suspensão bacteriana de partida usada para a perfusão. Expressa os resultados como UFC/cm2.
- Prepare um tubo único 14 mL com 10 mL de solução salina estéril para fazer diluições em série da suspensão bacteriana obtidos após sonication. Rotule este tubo como #2.
4. fluorescência microscopia de bactérias aderidas enxertar tecidos mediante perfusão
- Após a perfusão, lavar peças de tecido com PBS (consulte a etapa 3.5) e cortar a parte interna de um enxerto usando um soco de um diâmetro menor.
- Preparar uma placa de 6 e coloque as gotas de meio de montagem (Tabela de materiais).
- Coloque cada pedaço de tecido com sua superfície perfundido para baixo em uma única gota de meio de montagem.
- Ler uma placa usando um scanner de fluorescência (Tabela de materiais). Definir parâmetros de excitação e emissão de comprimentos de onda de acordo com um fluoróforo usado para rotular bacteriana.
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Representative Results
Para melhor compreender os mecanismos por trás IE desenvolvimento, este modelo permite a avaliação de bacteriano e fatores de tecido associado apresentam a situação na vivo do início da infecção.
No detalhe, a abordagem do romance em vitro permite quantificar adesão bacteriana em condições de fluxo de tecidos diferentes do enxerto por perfusing fluorescente etiquetadas bactérias sobre os tecidos exercendo as tensões de cisalhamento na faixa fisiológica de 3-10 Dina / cm2 para o RVOT. Neste trabalho, usamos um caudal de 4 mL/min, o que correspondeu a 3 Dina/cm2. Levando em consideração a altura do canal de 0,3 mm através de todos os patches de tecido, a distância entre o enxerto montado e a entrada média de cerca de 39 milímetros, câmara de perfusão (mostrada na Figura 1) garante totalmente desenvolvido fluxo laminar (Re = 3,89 é significativamente menor do que 2000; o comprimento de entrada = 0,05 mm é significativamente menor do que a distância 'entrada-enxerto', parâmetros necessários para assumindo o padrão de fluxo adequado).
Sob condições de tensão de cisalhamento, observou-se um acessório similar bacteriano através dos vários tecidos de enxerto para infecção tanto S. aureus e S. epidermidis (Figura 2 e Figura 3). Embora não significativa, uma tendência para uma maior adesão de S. aureus para os folhetos CH foi perceptível.
Para S. sanguinis uma redução significativa de aderência à parede BJV foi encontrado quando comparado com o patch de BP (Figura 4; P < 0,05). Quando comparar as 3 espécies de bactériasS. sanguinis apresenta significativamente menor aderência à parede BJV em relação a S. aureus e S. epidermidis (P < 0,01 e P < 0.05 respectivamente, veja o vídeo). Em geral, observamos uma adesão bacteriana semelhante para todos os tecidos investigados sob tensão de cisalhamento.
Nossos dados de UFC contando (Figura 2, Figura 3, Figura 4) são suportados por microscopia de fluorescência usando um scanner de alta taxa de transferência (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Imagens estão apresentando pronuncia-se focos de bactérias rotulados aderindo para enxertar tecidos. Devido a esta abordagem, fomos capazes de Visualizar diretamente tecidos mediante perfusão sem qualquer post experimental de processamento para fins de ilustração.
Os resultados demonstram que a fonte de um tecido de enxerto, diferenças morfológicas superficiais, bem como adesinas bacterianas não são importantes determinantes da aderência bacterianapara estes materiais biológicos.
Figura 1: imagem de um sistema de câmara de fluxo recentemente desenvolvida (projeto in-house pelo departamento de Biohybrid & têxteis médicos, AME - Helmholtz Instituto de Engenharia Biomédica, Aachen, Alemanha). A. A câmara de fluxo (1) montado o conjunto de fluxo de dimensões CxLxA: 125 x 55 x 18 mm (parafusos em combinação com porcas do parafuso aguentar peças juntos e colocar pressão através da câmara do frame do metal as juntas para evitar vazamentos); (2) a parte superior da coluna; (3) folha de gaxeta superior com dois furos para fixar conectores de tubos, que conectam a câmara de fluxo com a bomba e o reservatório do líquido por meio do sistema de tubulação; (4) distância entre a médio da entrada e do tecido (o comprimento de entrada); slide de folha fina (5) (com uma perfuração circular de 8 mm para permitir a exposição do tecido da suspensão bacteriana) (em um intervalo do slide há o espaço para uma junta de borracha B9, para imobilizar o pedaço de tecido durante a perfusão); (6) a folha de vedação inferior com um recesso dedicado para colocar o enxerto de tecido montado entre a lâmina de microscópio e a junta de borracha; (7) a parte inferior da câmara de fluxo; B. O set-up completo (8) o slide de folha fina; (9) a gaxeta de borracha; (10) oito parafusos com porcas-correspondente (11) oito parafuso; (12) o reservatório do líquido (400 mL); sistema de tubulação (13) ; Unidade de perfusão C. (14) a bomba peristáltica; (15) dedicado tubulação que resiste aos rigores da ação de bombeamento peristáltico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Adesão de S. aureus Cowan enxertar tecidos sob condições de fluxo. Fluorescente etiquetadas bactérias foram perfundidos tecidos de enxerto por 5 (paredes de conduíte ou folhetos valvulares) em PBS. As bactérias foram desanexadas de pedaços de tecido infectado pelo sonication. Adesão bacteriana foi avaliado por meio de diluições seriais, usando o método de contagem de UFC e indicado como UFC/cm2. Todos os resultados são expressos como média ± SEM (n > 3 para folhetos valvulares devido a limitação do material; n > 5 para paredes de conduíte). UFC: unidade formadoras; BP: pericárdio bovino; BJV: bovina veia jugular; CH: homograft criopreservado. Esta figura foi modificada de Veloso et al . (Revista de cirurgia torácica e Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Adesão de S. epidermidis enxertar tecidos sob condições de fluxo. Fluorescente etiquetadas bactérias foram perfundidos tecidos de enxerto por 5 (paredes de conduíte ou folhetos valvulares) em PBS. As bactérias foram desanexadas de pedaços de tecido infectado pelo sonication. Adesão bacteriana foi avaliado por meio de diluições seriais, usando o método de contagem de UFC e indicado como UFC/cm2. Todos os resultados são expressos como média ± SEM (n > 3 para folhetos valvulares devido a limitação do material; n > 5 para paredes de conduíte). UFC: unidade formadoras; BP: pericárdio bovino; BJV: bovina veia jugular; CH: homograft criopreservado. Esta figura foi modificada de Veloso et al . (Revista de cirurgia torácica e Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Adesão de S. sanguinis enxertar tecidos sob condições de fluxo. Fluorescente etiquetadas bactérias foram perfundidos tecidos de enxerto por 5 (paredes de conduíte ou folhetos valvulares) em PBS. As bactérias foram desanexadas de pedaços de tecido infectado pelo sonication. Adesão bacteriana foi avaliado por meio de diluições seriais, usando o método de contagem de UFC e indicado como UFC/cm2. Todos os resultados são expressos como média ± SEM (n = 3 para folhetos valvulares devido a limitação do material; n > 5 para paredes de conduíte). UFC: unidade formadoras; BP: pericárdio bovino; BJV: bovina veia jugular; CH: homograft criopreservado. Esta figura foi modificada de Veloso et al . (Revista de cirurgia torácica e Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visualização de S. aureus Cowan aderência enxertar tecidos por meio de microscopia de fluorescência. Esquerda para a direita: parede de conduíte BJV, folheto BJV, parede CH e CH a bula. Esta figura foi modificada de Veloso et al . (Revista de cirurgia torácica e Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Visualização de aderência de S. epidermidis enxertar tecidos usando microscopia de fluorescência. Esquerda para a direita: parede de conduíte BJV, folheto BJV, parede CH e CH a bula. Esta figura foi modificada de Veloso et al . (Revista de cirurgia torácica e Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Visualização da aderência de S. sanguinis enxertar tecidos usando microscopia de fluorescência. Esquerda para a direita: parede de conduíte BJV, folheto BJV, parede CH e CH a bula. Esta figura foi modificada de Veloso et al . (Revista de cirurgia torácica e Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Observações clínicas recentes dar atenção especial a IE como uma complicação em pacientes submetidos a substituição da válvula da RVOT6,13. Disfunção da válvula implantada no IE é o resultado da interação bacteriana com o enxerto endovascular, levando a extensa inflamatória procoagulante reações1,e14. O modelo apresentado romance em vitro permitiu-nos investigar se as diferenças em estruturas de tecido e fatores bacterianos são susceptíveis de modular a susceptibilidade a infecções na vivo utilizados enxertos15. BJV e CH enxerto tecido mostraram semelhante propensão para recrutamento bacteriano em condições de fluxo. Portanto, os dados sugerem que em geral a origem do tecido e sua estrutura de superfície bem como proteínas específicas de adesivo bacteriana por si não são os principais factores determinantes na adesão bacteriana inicial.
Em geral, caminhos, evocando a inflamação, deposição de danos, plaquetas e fibrina de tecido no local infectado endovascular são ativados por vários jogadores1,16. Uma grande vantagem do modelo desenvolvido em vitro é a oportunidade de analisar, espaços, a contribuição dos jogadores envolvidos. Fatores bacterianos único podem ser investigados por meio de estirpes mutantes de bactérias ou bactérias geneticamente modificadas, expressando proteínas de adesão única na sua superfície14. Escolhendo a perfusão de diferentes meios, plasma ou sangue, pode ser avaliado o envolvimento das proteínas do plasma e as células do sangue. Mais estudos incidirá sobre tecidos relacionados a fatores para que os tecidos será pré-incubado com por exemplo proteínas plasmáticas antes montado em câmara de fluxo para perfusão subsequente. Desde jogadores que contribuem para o aparecimento da prótese válvula IE permanecem pouco claras, estudos futuros podem desvendar os fatores potenciais pelo edifício até uma instalação experimental mais complexa. Além disso, esta configuração experimental herda a possibilidade que os tecidos podem ser semeados com uma camada de CE para analisar a expressão do gene CE cisalhamento-dependente. A câmara de fluxo paralelo-placa também permite a perfusão corrediças do microscópio coberta de CE devido a uma altura interior flexível da câmara de perfusão. Diferentes revestimentos de lamínulas usando várias proteínas da matriz extracelular são também uma opção possível para avaliar interações importantes com a matriz subendotelial. Além disso, inibidores farmacológicos ou anticorpos funcionais podem ser investigados por seu efeito na respectiva condição em nossa câmara de fluxo. Em resumo, várias condições podem ser estudadas pela complexidade crescente.
Ativação inflamatória na área infectada do enxerto é um passo crucial, controlado por cisalhamento, favorecendo a deposição de plaquetas activadas e monócitos. O impacto de cisalhamento força na adesão bacteriana ao tecido superfícies são de grande preocupação. Para resolver esse problema, a novidade do sistema apresentado em vitro centra-se sobre a possibilidade de montar os tecidos em uma câmara de fluxo. Isso reforça a importância do método para além de alternativas existentes, em que geralmente estáticas interações entre bactérias e tecidos subjacentes foram investigadas. Mesmo que a tensão de cisalhamento foi enviada por agitação ou outras forças externas, isso não foi padronizou para o mesmo nível como podemos ganhar do nosso modelo de fluxo uniforme.
Padrão de fluxo em vivo, um não-fisiológica pode favorecer a adesão bacteriana como o início do IE ao nível da válvula de condutas implantados. Tensão de cisalhamento foi encontrado para cima-regular parâmetros inflamatórios endoteliais como secreção de citocinas e aumentar o fator tecidual mediada por coagulação17. A interação do tecido subjacente usado para próteses de válvula com bactérias e sua influência na expressão do gene CE sob tensão de cisalhamento é importante para construir uma válvula menos capaz de adesão bacteriana e inflamação crônica.
As questões técnicas basais da câmara fabricada permitam investigações em condições padronizadas em fluxo laminar18. Para assegurar o fluxo laminar totalmente desenvolvido no local do tecido investigado a câmara é construída para montar o enxerto em uma certa distância da entrada de médio (significativamente mais do que o comprimento de entrada computada, ver resultados e Figura 1). Usar bombas diferentes no sistema permitiria realizando experiências sob condições de fluxo pulsátil ou turbulenta no futuro.
O quadro flexível da câmara impede que a câmara efetivamente vazando e a altura interna do quadro permite a adaptação para a espessura do tecido. A construção de todo o sistema permite que um fluxo de circulação, que é de importância para realizar perfusions de longa duração com o uso de uma quantidade respectiva de médio. Com base em estudos anteriores nosso protocolo de adesão assumiu uma dose de inoculação bacteriana de 107 UFC/mL para uma incubação de 1 h4,19. Usando estas definições, níveis de adesão foram detectáveis, embora baixo o suficiente para ser capaz de observar o significativo aumento da aderência bacteriana sem saturação da superfície do enxerto de tecido. Além disso, neste período de tempo, foi possível notar diferenças de potencial na ligação entre estirpes tomadas neste estudo. Parâmetros de cisalhamento abordados aqui estavam na faixa fisiológica e otimizado para os vasos sanguíneos, o que era nosso destino em conformidade com o RVOT.
Outras modificações do método incidirá sobre o consumo mais eficiente de médio durante o procedimento, bem como sobre a simplificação da montagem da instalação. Além disso, um novo design, incluindo vários slots para montagem de tecido facilitaria uma experiência inteira em aspectos como a eficiência.
Nesta fase, nosso método é focado em resultados o ponto final e não foi testado para aplicações de tempo real como o curso do tempo da dinâmicos eventos que ocorrem na superfície do tecido. Assim, esta aplicação mais ampla continua a ser considerado; no entanto, questões como tecido autofluorescência, otimização de um protocolo de microscópio de fluorescência adequada, bem como as adaptações da câmara precisam ser abordadas. Além disso, o método em seu estado atual pode ser adaptado para monitoramento em tempo real de ligação bacteriana a camadas de CE em corrediças do microscópio por microscópio de fluorescência na posição vertical. Atualmente, somos capazes de visualizar as bactérias e outros componentes/glóbulos vinculados aos tecidos pela microscopia confocal, sem a necessidade de pós-processamento de tecido experimental, que é predisponentes para a visualização em tempo real sob fluxo por invertido microscópios de fluorescência.
Neste estudo, a quantificação de adesão bacteriana foi fornecida pela UFC contando enquanto microscopia de fluorescência foi uma ferramenta de apoia, não-quantitativa. Devido a problemas de resolução resultantes da falta de uma lente do microscópio adequado, imagem de fluorescência acabou por ser menos reprodutível em nossas mãos do que diluições em série. No entanto, é possível recorrer a fluorescência quando apropriada lente objetiva poderia iluminar o tamanho inteiro do enxerto de 8 mm de diâmetro para quantificação confiável focos de digitalização para quantificação. Usando um programa de processamento de imagem (como ImageJ), unidades de fluorescência absoluto podem ser quantificadas para amostras investigadas e a adesão bacteriana pode ser expresso por exemplo, como um sinal relativo para o controle interno (enxertos perfundidos com bactérias não-rotulados).
A grande limitação dessa configuração experimental são as questões associadas em vitro estudos em geral. Resultados alcançados usando este modelo de câmara de fluxo em vitro poderão ser transferidos para um modelo animal para confirmação na vivo .
Em conclusão, este modelo in vitro permite a investigação de única bacteriana, tecido e tesoura com base em fatores contribuindo para o início da adesão bacteriana dos tecidos de forma gradual. O conhecimento por este meio habilitado poderia contribuir para o desenvolvimento de mais eficazes de prevenção e tratamento do IE.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Este estudo foi patrocinado por uma concessão do fundo de pesquisa KU Leuven (OT/14/097) dada ao RH. TRV foi Postdoctoral Fellow da Fundação de pesquisa FWO - Flandres (Bélgica; Grant Number - 12K0916N) e RH é suportado pela pesquisa clínica fundo de UZ Leuven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
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