Summary
Descriviamo un interno progettato in vitro camera modello di flusso, che permette l'indagine di aderenza batterica all'innesto di tessuti.
Abstract
Vari Tubi valvolati e stent-montate valvole sono utilizzati per sostituzione della valvola di efflusso del ventricolo destro (RVOT) del tratto in pazienti con cardiopatia congenita. Quando si utilizza materiali protesici tuttavia, questi innesti sono suscettibili di infezioni batteriche e varie risposte dell'ospite.
Identificazione dei fattori batterici e host che svolgono un ruolo vitale in endovascular aderenza dei microrganismi è di importanza per comprendere meglio la fisiopatologia di insorgenza di infezioni come l'endocardite infettiva (IE) e di sviluppare misure preventive strategie. Pertanto, lo sviluppo di modelli competenti a indagare adesione batterica in condizioni fisiologiche taglio è necessario. Qui, descriviamo l'uso di una nuova concezione in vitro aspersione camera basato su piastre parallele che permette che lo studio di aderenza batterica ai diversi componenti dei tessuti dell'innesto esposto come matrice extracellulare, cellule endoteliali e zone inerti . Questo metodo combinato con formazione di colonie (CFU) contando unitàè adeguato per valutare la propensione di materiali d'innesto all'adesione batterica sotto flusso. Ulteriormente, il sistema dell'alloggiamento di flusso potrebbe essere utilizzato per studiare il ruolo di emocomponenti in adesione batterica in condizioni di taglio. Abbiamo dimostrato che l'origine del tessuto, loro morfologia superficiale e la specificità di specie batteriche non sono i principali fattori determinanti in aderenza batterica all'innesto di tessuti utilizzando il nostro modello di aspersione in-House progettata in vitro .
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) impiega una varietà di strategie di virulenza di aggirare il sistema di difesa immunitaria ospite colonizzando superfici biologiche o non biologici impiantate nella circolazione umana, che porta a gravi infezioni intravascolari come sepsi e IE1,2,3,4,5. Resti di IE un importante trattamento complicanze nei pazienti dopo l'impianto di valvole cardiache protesiche mentre singoli fattori che contribuiscono all'insorgenza di IEare non ancora pienamente compreso6,7. In condizioni di flusso, batteri ritrovarvi con le forze di taglio, di cui hanno bisogno per superare allo scopo di rispettare il vaso muro8. Modelli, che consentono di studiare l'interazione tra batteri e tessuto della valvola prostetica o endotelio sotto flusso, sono di interesse in quanto riflettono la situazione in vivo più.
Parecchi meccanismi specifici facilitano l'aderenza batterica alle cellule endoteliali (ECs) e alla matrice subendothelial esposta (ECM) che porta alla colonizzazione dei tessuti e alla maturazione delle vegetazioni, essendo essenziali punti iniziali in IE9. Varie proteine di superficie stafilococciche o MSCRAMMs (microbiche superficiale componenti riconoscere molecole matrice adesiva) sono stati descritti come mediatori di adesione di cellule dell'ospite e di proteine ECM interagendo con le molecole come fibronectina, fattore di fibrinogeno, collagene e von Willebrand (VWF)8,10,11. Tuttavia, in considerazione di pieghevole intra-molecolari di alcuni fattori di virulenza, per lo più studiati in condizioni statiche, molte di queste interazioni possono avere rilevanza diversa nelle infezioni endovascolari nel sangue circolante.
Pertanto, vi presentiamo un interno progettato in vitro flusso parallelo-piastra camera modello, che permette di valutare l'aderenza batterica ai diversi componenti della ECM ed ECs nel contesto degli innesti del tessuto impiantato in posizione RVOT. L'obiettivo generale del metodo descritto in questo lavoro è quello di studiare i meccanismi di interazione tra batteri e tessuti sottostanti endovascular in condizioni di flusso, che sono strettamente legate all'ambiente in vivo degli agenti patogeni di circolazione sanguigna come S. aureus. Questo nuovo approccio si concentra sulla suscettibilità delle superfici di tessuto di innesto di aderenza batterica per identificare potenziali fattori di rischio per lo sviluppo di Internet Explorer.
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Protocol
1. preparazione dell'innesto tessuti per studi In Vitro
Nota: Sono stati utilizzati tre tipi di tessuti: innesti crioconservati omotrapianto (CH) e la vena giugulare bovina (BJV), patch di pericardio bovino (BP). In caso di BJV conduit e CH (tessuto trattati da Banca europea di omotrapianto (EHB) e conservati in azoto liquido prima dell'uso), sono stati utilizzati valvolari sia a parete. Patch di BP e BJV condotto sono stati acquistati dai produttori. Prima dell'uso, scongelare il CH seguendo le istruzioni di EHB12.
- Lavare tutti i tessuti con NaCl 0,9% prima dell'uso.
- Preparare le biopsie del tessuto utilizzando una biopsia della pelle monouso pugno per tagliare pezzi di tessuto circolare (diametro 10 mm).
- Tagliare tutte le patch di tessuto alla stessa altezza utilizzando il bisturi sterile monouso.
- Per i tessuti fissati con glutaraldeide (ad esempio conduit BJV), incubare innesto pezzi durante la notte a 4 ° C a 200 g/L di albumina umana per neutralizzare il fissativo.
- Lavare residui di glutaraldeide con 0,9% NaCl in micropiastra. Ripetere 3 volte per 1 minuto.
2. preparare i batteri per esperimenti di perfusione
Nota: Tre isolati batterici sono stati utilizzati: S. aureus Cowan (ATCC 12598), s. epidermidis ATCC 149900 e S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus e S. epidermidis sono state coltivate a 37 ° C in brodo di soia triptico (TSB) e S. sanguinis era cresciuta a 37 ° C con 5% CO2 in brodo di cervello cuore infusione (BHI).
- Preparare una notte cultura di batteri su una piastra di agar sangue solido.
- Utilizzare un'ansa sterile per raschiare i batteri congelati e inoculare su una piastra di agar sangue di Mueller-Hinton per cultura durante la notte a 37 ° C.
- Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per prendere una singola Colonia dalla coltura agar-sangue durante la notte e inoculare in 10 mL di TSB o BHI in un tubo da 14 mL e cultura durante la notte a 37 ° C.
- Centrifugare il pernottamento culture (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e risospendere il pellet in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). Inserire le provette mL 14 sul ghiaccio.
- Un'aliquota di 3,7 mg/mL di soluzione di 5 (6) - carbossi - fluorescina N-idrossi-succinimidyl ester (CF) in etanolo di preparare e conservare a-20 ° C. Diluire ulteriormente il brodo del CF a 150 µ g/mL utilizzando 'ultrapura' acqua.
Nota: Proteggere tubi dalla luce utilizzando il foglio di alluminio e conservare a-20 ° C. - Centrifugare i batteri (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e risospendere il pellet in 800 µ l di PBS e aggiungere 200 µ l della soluzione CF 150 µ g/mL (concentrazione finale di 30 µ g/mL, usato per esperimenti di perfusione). Proteggere i tubi dalla luce con carta stagnola e incubare per 30 minuti, utilizzando un agitatore orbitale.
- Dopo l'etichettatura, bloccare con 2% di soluzione di albumina di siero bovino (BSA) in PBS e spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Seguire con un passaggio di lavaggio utilizzando 10 mL di PBS e pellet batteri mediante centrifugazione (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
- Diluire i batteri con PBS per ottenere 107 unità formanti colonie (CFU) /mL (verificato CFU contando su piastre di agar sangue di Mueller-Hinton), che corrisponde ad un OD600 (densità ottica) pari a 0,65. Mantenere le provette nel buio sul ghiaccio prima di esperimenti di perfusione.
Nota. Tenete a mente che misure600 OD riflettono il numero approssimativo dei batteri. Per contare la dose efficace inoculazione, il metodo di diluizione seriale è un ulteriore passaggio necessario per verificare il diametro esterno basato su numeri come descritto nella sezione 3.8.
3. in vitro gli esperimenti di perfusione utilizzando una camera di flusso parallelo-piastra
- Montare le biopsie del tessuto di 10 mm di diametro e lo stesso spessore (preparato nei passaggi 1.1-1.5) in un sistema di flusso dell'alloggiamento con la superficie interna rivolta verso l'alto per entrare in contatto con la sospensione batterica.
Nota: Lo stesso spessore del tessuto attraverso vari innesti assicura che la stessa altezza del tessuto è raggiunto nel canale permettendo a flusso laminare in tutte le condizioni. Tutti gli elementi della camera del flusso sono presentati e descritti nella Figura 1.- Per iniziare il protocollo, posizionare il pezzo di tessuto rotondo tra un vetrino da microscopio con una perforazione circolare di 8 mm e una guarnizione in gomma.
Nota: Il vetrino da microscopio possiede il film ultra-sottile inferiore per consentire la generazione del foro 8 mm. Insieme con il foglio di gomma, si corregge il tessuto per consentire il contatto diretto tra il campione e mezzo fluente e impedisce anche la dislocazione della biopsia durante l'esperimento. La superficie del tessuto oggetto dell'inchiesta, che è esposto al flusso (diametro inferiore) non può essere manipolata dal forcipe. - Inserire il supporto con il tessuto il foglio di guarnizione che è incorporato nel frame inferiore in metallo della camera.
- Fissare il telaio di metallo superiore con il corrispondente foglio di guarnizione sulla parte inferiore della camera con il portarotolo inserite in precedenza. Successivamente montare l'intera camera con otto viti ed avvitare i dadi. Assicurarsi che l'altezza della camera è sempre lo stesso da altra parte gli innesti.
Nota: L'altezza della camera dovrebbe essere determinato sempre al momento di serraggio delle viti. Utilizzare una pinza o un righello.
- Per iniziare il protocollo, posizionare il pezzo di tessuto rotondo tra un vetrino da microscopio con una perforazione circolare di 8 mm e una guarnizione in gomma.
- Collegare la camera di flusso con una pompa peristaltica e il serbatoio del liquido con i tubi.
- Irrorare i tessuti con sospensioni di 107 CFU/mL (verificato CFU contando e legate alla OD600 misurazioni) fluorescente-identificati batteri in PBS con una sollecitazione di taglio di 3 dyne/cm2 (dyne per centimetro quadrato unità di pressione) da mezzi della pompa peristaltica (portata: 4 mL/min) per 1h facendo uso di un serbatoio batterica 400 mL (in-House design, Figura 1) condizionato a 37 ° C, utilizzando un termostato piastra (Tabella materiali).
- Continuamente ricircolare la sospensione batterica 100ml utilizzando il serbatoio di raccolta stesso.
- Dopo aspersione, smontare la camera per rilasciare la protesi e lavare il pezzo di tessuto due volte con 4 mL di PBS in un piatto di 12-pozzetti utilizzando l'agitatore orbitale di laboratorio per 3 minuti ciascuno. Successivamente tagliare la parte interna dell'innesto usando una biopsia della pelle punzone di un diametro inferiore.
- Posizionare ogni biopsia del tessuto in un tubo separato 14 mL contenente 1 mL di sterile 0,9% NaCl. Etichettare la provetta come #1.
- Staccare i batteri dal tessuto usando un bagno di sonicazione per 10 min (ampiezza = 100% e frequenza = 45 kHz).
Nota: Completo distacco dei batteri dal tessuto innesti dovrebbero essere valutati sopra incubazione di patch durante la notte a 37 ° C in mezzo liquido TSB, seguita da misure600 OD rispetto per controllare le patch trattate con una soluzione gratuita di batteri. - Utilizzare un metodo di diluizione seriale su piastre di agar sangue di Mueller-Hinton per contare CFUs.
- Preparare una provetta singola 14 mL con 10 mL di soluzione fisiologica sterile per effettuare diluizioni seriali della sospensione batterica ottenuta dopo sonicazione. Etichettare questo tubo come #2.
Nota: Per ogni un provetta esperimento di tessuto con 10 mL di 0,9% NaCl è necessaria. - Preparare tre provette di 14 mL con 10 mL di sterile 0,9% NaCl per diluizioni seriali di sospensione batterica iniziale dal punto 2.7. Etichettare le provette come segue #3, #4, #5.
Nota: Questo passaggio è necessario conoscere il reale numero CFU in sospensione batterica utilizzato per l'esperimento di aspersione. - Vortice mescolare ogni tubo per 15 s. Vortex le provette con la biopsia del tessuto, nonché la sospensione batterica iniziale per effettuare diluizioni seriali.
- Preparare tre piastre di agar, due per l'esperimento di tessuto (aspersione di batteri e aspersione di controllo di PBS) e la terza per la sospensione batterica iniziale utilizzata per le aspersioni.
- Etichetta tre settori per piastra per l'esperimento di tessuto nel seguente modo 10-1, 10-3 e 10-4. Per contare il numero di CFU nella perfusati batterica, la targhetta di etichettatura come segue: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7.
Nota: Tutte le indicazioni sull'agar piastre come 10-1, 10-3 e così via si riferiscono al numero finale di CFU/mL calcolato il giorno successivo. Piastra di controllo non richiede tutti i settori. Prima dell'uso, piastre di agar sangue dovrebbero essere posto sotto la cappa laminare e aperto per rimuovere l'umidità in eccesso. - Per continuare la preparazione delle diluizioni seriali, trasferire 100 µ l di filmato #1 filmato #2 e mescolare energicamente con vortice.
- Sviluppa 100 µ l del contenuto del filmato #1 e #2 sui corrispondenti settori 10-1 e 10-3 della piastra di agar. Allo stesso modo, diffondere 10 µ l di filmato #2 sul settore 10-4, ripetere questo passaggio 4 volte per ottenere 4 crescite separate da ogni volume di 10 µ l.
Nota: A causa del piccolo volume usato per la placcatura sul settore 10-4, si consiglia di avere più numero di goccioline di effettuare un numero medio di CFUs coltivati. - Per preparare le diluizioni seriali della cultura iniziale, trasferire 100 µ l di sospensione batterica da passo 2.7 in provetta #3 e mescolare energicamente con vortice. Aggiungere 100 µ l del tubo #3 al tubo #4 e mescolare bene, ripetere la procedura per successiva tubo #5.
- Stendere 100 µ l del contenuto delle provette #3, #4, #5 e la sospensione batterica regolata (punto 2.7), rispettivamente, su settori 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 della piastra di agar sangue.
- Lasciare le piastre di agar sangue nella cappa laminare di aria secca gli spread batterici, in genere per 10 minuti. In seguito, è possibile posizionare le piastre a 37 ° C per l'incubazione durante la notte.
- Dopo una notte di incubazione, contare le colonie batteriche per ottenere il numero di CFU derivanti dall'adesione per le biopsie del tessuto così come CFU/mL della sospensione batterica iniziale usato per l'aspersione. Esprimere i risultati come CFU/cm2.
- Preparare una provetta singola 14 mL con 10 mL di soluzione fisiologica sterile per effettuare diluizioni seriali della sospensione batterica ottenuta dopo sonicazione. Etichettare questo tubo come #2.
4. fluorescenza microscopia di batteri aderiti all'innesto di tessuti all'aspersione
- Dopo aspersione, lavare i pezzi di tessuto con PBS (Vedi punto 3.5) e tagliare la parte interna di un innesto usando un punzone di un diametro inferiore.
- Preparare una piastra a 6 pozzetti e posizionare le gocce di mezzo di montaggio (Tabella materiali).
- Posizionare ogni pezzo di tessuto irrorato dalla superficie verso il basso su una sola goccia di mezzo di montaggio.
- Leggere una piastra utilizzando uno scanner di fluorescenza (Tabella materiali). Impostare i parametri delle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione secondo un fluoroforo utilizzato per etichettare batterica.
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Representative Results
Per comprendere meglio i meccanismi dietro IE sviluppo, questo modello consente la valutazione di batterico e tessuto connesso fattori presenti nella situazione in vivo dell'inizio di infezione.
In dettaglio, l'approccio di romanzo in vitro permette di quantificare adesione batterica in condizioni di flusso ai tessuti diversi innesto irrorando fluorescente identificati batteri sopra i tessuti esercitando le sollecitazioni di taglio nella gamma fisiologica di 3-10 dyne / cm2 per la RVOT. In questo lavoro, abbiamo usato una portata di 4 mL/min che corrispondeva a 3 dyne/cm2. Prendendo in considerazione l'altezza del canale di 0,3 mm attraverso tutte le patch di tessuto, la distanza tra l'innesto montato e l'ingresso di mezzo di circa 39 mm, camera di aspersione (illustrata nella Figura 1) garantisce pienamente sviluppato a flusso laminare (Re = 3,89 è significativamente inferiori a 2000; la lunghezza di ingresso = 0,05 mm è significativamente inferiore alla distanza 'ingresso-innesto', parametri necessari per l'assunzione di modello di flusso appropriato).
In condizioni di sollecitazione di taglio, un simile allegato batterico attraverso i vari tessuti dell'innesto è stato osservato per l'infezione sia S. aureus e S. epidermidis (Figura 2 e Figura 3). Anche se non significativa, una tendenza verso più alta adesione di S. aureus gli opuscoli CH era notevole.
Per S. sanguinis una significativa riduzione di aderenza alla parete BJV è stata rilevata rispetto alla patch BP (Figura 4; P < 0,05). Quando confrontando le 3 specie di batteriS. sanguinis presenta significativamente più bassa adesione alla parete BJV in relazione di S. aureus e S. epidermidis (P < 0,01 e P < 0,05 rispettivamente, vedere il video). In generale, abbiamo osservato una simile adesione batterica a tutti i tessuti studiati sotto sollecitazione di taglio.
I nostri dati da CFU contando (Figura 2, Figura 3, Figura 4) sono supportati da microscopia di fluorescenza usando uno scanner ad alta velocità di trasmissione (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Immagini presentano pronunciate focolai di batteri con etichettati aderendo per l'innesto di tessuti. A causa di questo approccio, siamo stati in grado di visualizzare direttamente tessuti su aspersione senza alcun post sperimentale di elaborazione per scopi illustrativi.
I risultati dimostrano che l'origine di un tessuto di innesto, superficie differenze morfologiche, nonché adesine batteriche non sono fattori determinanti importanti di aderenza battericaa questi materiali biologici.
Figura 1: immagine di un sistema di alloggiamento di flusso recente sviluppato (in-House design by the dipartimento di Biohybrid Tessuti medicali, AME - Helmholtz Istituto di ingegneria biomedica, Aquisgrana, Germania). A. la camera di flusso (1) montato insieme di flusso di dimensioni LxWxH: 125 x 55 x 18 mm (viti in combinazione con dadi tenere parti insieme e mettere pressione tramite della camera il telaio metallico delle guarnizioni per evitare perdite;) (2) la parte superiore della colonna; (3) il guarnizione superiore foglio con due fori per fissare i tubi connettori, che collegano la camera di flusso con la pompa e il serbatoio del liquido mediante il sistema di tubazione; (4) distanza fra l'ingresso di mezzo ed il tessuto (la lunghezza di ingresso); diapositiva di lamina sottile (5) (con una perforazione circolare di 8 mm per consentire l'esposizione del tessuto alla sospensione batterica) (in una rientranza della diapositiva c'è lo spazio per una guarnizione in gomma B9, per immobilizzare il pezzo di tessuto durante la perfusione); (6) il foglio di guarnizione inferiore con una nicchia dedicata per posizionare l'innesto di tessuto montato tra il vetrino da microscopio e la guarnizione di gomma; (7) la parte inferiore della camera di flusso; B. il set-up completo (8) la diapositiva di lamina sottile; (9) la guarnizione di gomma; (10) otto viti con dadi corrispondente (11) otto; (12) il serbatoio del liquido (400 mL); sistema di tubi (13) ; C. aspersione unità (14) la pompa peristaltica; (15) dedicato a tubi che resiste ai rigori dell'azione di pompaggio peristaltico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Adesione di S. aureus Cowan all'innesto di tessuti in condizioni di flusso. Fluorescente identificati batteri sono stati irrorati tessuti oltre 5 innesto (conduit pareti o valvolari) in PBS. I batteri sono stati distaccati da pezzi di tessuto infetto tramite sonicazione. Adesione batterica è stata valutata mediante diluizioni seriali utilizzando il metodo di conteggio di CFU e indicato come CFU/cm2. Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM (n > 3 per valvolari con una limitazione di materiale; n > 5 per le pareti del condotto). CFU: unità formanti colonie; BP: pericardio bovino; BJV: vena giugulare bovina; CH: omotrapianto crioconservato. Questa figura è stata modificata da Veloso et al. (Giornale di ambulatorio toracico e cardiovascolare , 155 (1), 325-332 (2018)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Adesione di S. epidermidis all'innesto di tessuti in condizioni di flusso. Fluorescente identificati batteri sono stati irrorati tessuti oltre 5 innesto (conduit pareti o valvolari) in PBS. I batteri sono stati distaccati da pezzi di tessuto infetto tramite sonicazione. Adesione batterica è stata valutata mediante diluizioni seriali utilizzando il metodo di conteggio di CFU e indicato come CFU/cm2. Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM (n > 3 per valvolari con una limitazione di materiale; n > 5 per le pareti del condotto). CFU: unità formanti colonie; BP: pericardio bovino; BJV: vena giugulare bovina; CH: omotrapianto crioconservato. Questa figura è stata modificata da Veloso et al. (Giornale di ambulatorio toracico e cardiovascolare , 155 (1), 325-332 (2018)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Adesione di S. sanguinis all'innesto di tessuti in condizioni di flusso. Fluorescente identificati batteri sono stati irrorati tessuti oltre 5 innesto (conduit pareti o valvolari) in PBS. I batteri sono stati distaccati da pezzi di tessuto infetto tramite sonicazione. Adesione batterica è stata valutata mediante diluizioni seriali utilizzando il metodo di conteggio di CFU e indicato come CFU/cm2. Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM (n = 3 per valvolari con una limitazione di materiale; n > 5 per le pareti del condotto). CFU: unità formanti colonie; BP: pericardio bovino; BJV: vena giugulare bovina; CH: omotrapianto crioconservato. Questa figura è stata modificata da Veloso et al. (Giornale di ambulatorio toracico e cardiovascolare , 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Visualizzazione di S. aureus Cowan aderenza all'innesto di tessuti mediante microscopia a fluorescenza. Da sinistra a destra: opuscolo parete condotto BJV, foglio illustrativo BJV, parete CH e CH. Questa figura è stata modificata da Veloso et al. (Giornale di ambulatorio toracico e cardiovascolare , 155 (1), 325-332 (2018)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Visualizzazione di S. epidermidis aderenza all'innesto di tessuti utilizzando la microscopia a fluorescenza. Da sinistra a destra: opuscolo parete condotto BJV, foglio illustrativo BJV, parete CH e CH. Questa figura è stata modificata da Veloso et al. (Giornale di ambulatorio toracico e cardiovascolare , 155 (1), 325-332 (2018)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Visualizzazione di S. sanguinis aderenza all'innesto di tessuti utilizzando la microscopia a fluorescenza. Da sinistra a destra: opuscolo parete condotto BJV, foglio illustrativo BJV, parete CH e CH. Questa figura è stata modificata da Veloso et al. (Giornale di ambulatorio toracico e cardiovascolare , 155 (1), 325-332 (2018)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le osservazioni cliniche recenti dare consapevolezza speciale a IE come complicazione in pazienti sottoposti a sostituzione della valvola del RVOT6,13. Disfunzione della valvola impiantata in IE è il risultato dell'interazione batterica con l'innesto di endovascular che conduce al vasto infiammatorio e procoagulante reazioni1,14. Il modello presentato romanzo in vitro ci ha permesso di indagare se le differenze nelle strutture del tessuto e fattori batterici possono modulare la suscettibilità alle infezioni di in vivo utilizzati innesti15. BJV e tessuto di innesto CH ha mostrato simile propensione all'assunzione batterica in condizioni di flusso. Pertanto, i dati suggeriscono che in generale la fonte di tessuto e sua struttura superficiale, nonché specifiche proteine adesive batteriche di per sé non sono i principali fattori determinanti di aderenza batterica iniziale.
In generale, vie che evoca l'infiammazione, deposito di danni, delle piastrine e fibrina del tessuto presso il sito di endovascular infetti sono attivate da più giocatori1,16. Dei principali vantaggi del modello sviluppato in vitro è la possibilità di analizzare gradualmente il contributo dei soggetti coinvolti. Singoli fattori batterici possono essere studiate utilizzando ceppi mutanti batterici o batteri geneticamente modificati che esprimono le proteine di adesione singola sulla loro superficie14. Scegliendo i mezzi differenti di aspersione, plasma o sangue, il coinvolgimento di proteine del plasma e cellule del sangue possa essere valutato. Ulteriori studi si concentreranno sul tessuto dei fattori per cui tessuti sarà pre-incubate con ad esempio proteine plasmatiche prima montato nella camera di flusso per la successiva aspersione. Dal giocatori che contribuiscono all'insorgenza di valvola prostetica IE rimangono poco chiari, gli studi futuri potrebbero svelare i fattori potenziali di costruzione fino a una configurazione più complessa e sperimentale. Inoltre, questa messa a punto sperimentale eredita la possibilità che tessuti possono essere seminati con uno strato di CE per analizzare l'espressione genica di shear-dipendente CE. La camera di flusso parallelo-piastra consente inoltre di aspersione su vetrini da microscopio CE-coperto a causa di una flessibile altezza interna della camera di aspersione. Diversi rivestimenti di vetrini utilizzando varie proteine della matrice extracellulare è anche un'opzione possibile per valutare importanti interazioni con la matrice subendoteliale. Inoltre, inibitori farmacologici o anticorpi funzionali possono essere analizzati per il loro effetto nelle rispettive condizioni nella nostra camera di flusso. In sintesi, possono essere studiate varie condizioni di crescente complessità.
Attivazione infiammatoria presso la zona infetta dell'innesto è un passo cruciale, shear-controllato, favorendo la deposizione di piastrine attivate e monociti. L'impatto di tosare le forze su aderenza batterica del tessuto sono superfici di grande preoccupazione. Per risolvere questo problema, la novità del sistema presentato in vitro si concentra sulla possibilità di montare tessuti in una camera di flusso. Questo rafforza il significato del metodo di là delle alternative esistenti, in cui di solito statiche interazioni tra batteri e tessuti sottostanti sono state studiate. Anche se la sollecitazione di taglio è stato presentato da agitazione o altre forze esterne, esso non è stato standardizzato allo stesso livello come possiamo ottenere dal nostro modello di flusso uniforme.
Modello di flusso In vivo, un non-fisiologica può favorire l'adesione batterica come l'insorgenza di IE a livello della valvola di cavidotto impiantato. Sollecitazione di taglio è stato trovato di up-regolare i parametri infiammatori endoteliali come la secrezione di citochine e di aumentare il fattore tissutale mediata coagulazione17. L'interazione del tessuto sottostante utilizzato per le protesi di valvola con batteri e la loro influenza sull'espressione del gene CE sotto sollecitazione di taglio è importante per costruire una valvola meno capace di adesione batterica e l'infiammazione cronica.
Le questioni tecniche basale della camera fabbricata di consentono indagini in condizioni standardizzate a flusso laminare18. Per garantire il flusso laminare completamente sviluppato presso il sito del tessuto indagato della camera è costruita per montare l'innesto a una certa distanza dall'ingresso di medie (significativamente più a lungo la lunghezza calcolata ingresso, vedere risultati e Figura 1). Utilizzando diverse pompe nel sistema consentirebbe di eseguire esperimenti in condizioni di flusso pulsatile o turbolento in futuro.
Il telaio flessibile della camera impedisce la camera efficacemente da perdite e l'altezza interna del telaio permette di adeguare per spessore del tessuto. La costruzione dell'intero sistema permette un flusso di circolazione, che è importante eseguire le aspersioni di lunga durature con l'utilizzo di una corrispondente quantità di mezzo di. Basata su studi precedenti il nostro protocollo di adesione assunse una dose di inoculazione batterica di 107 CFU/mL per una di4,di incubazione di 1 h19. Utilizzando queste impostazioni, livelli di adesione erano rilevabili, seppur abbastanza basso per essere in grado di osservare un miglioramento significativo di aderenza batterica senza saturazione della superficie dell'innesto del tessuto. Inoltre, in questo periodo di tempo, era fattibile a notare le differenze di potenziale nell'associazione per i ceppi presi in questo studio. Parametri di taglio indirizzati qui erano nella gamma fisiologica e ottimizzato per i vasi sanguigni, che erano il nostro target rispetto alla RVOT.
Ulteriori modifiche del metodo si concentreranno su un consumo più efficiente del mezzo durante la procedura, così come sulla semplificazione del montaggio l'installazione. Inoltre, un nuovo design tra cui slot multipli per il montaggio del tessuto faciliterebbe un intero esperimento in aspetti quali l'efficienza.
In questa fase il nostro metodo è focalizzato sui risultati end-point e non è stato testato per applicazioni real-time come ad esempio il corso di tempo di eventi dinamici che si verificano sulla superficie del tessuto. Così, questa applicazione più ampia rimane in esame; Tuttavia, problemi come tessuto autofluorescenza, ottimizzazione di un protocollo di microscopio di fluorescenza nonché adattamenti della camera devono essere affrontate. Ulteriormente, il metodo nel suo stato attuale può essere adattato per monitoraggio in tempo reale di associazione batterica agli strati CE su vetrini da microscopio di microscopio a fluorescenza in posizione verticale. Attualmente, siamo in grado di visualizzare i batteri e altri componenti/globuli associati ai tessuti mediante microscopia confocale senza necessità di post-elaborazione sperimentale del tessuto, che è predisponente per la visualizzazione in tempo reale sotto flusso di invertito microscopi a fluorescenza.
In questo studio, la quantificazione dell'adesione batterica è stata fornita contando CFU mentre microscopia di fluorescenza è uno strumento di supporto, non quantitativi. A causa di problemi di risoluzione derivanti dalla mancanza di un'adeguata microscopio lente, l'imaging di fluorescenza si è rivelato per essere meno riproducibile nelle nostre mani di diluizioni seriali. Tuttavia, è possibile utilizzare la scansione per quantificazione quando obiettivo adatto potrebbe illuminare la dimensione intera dell'innesto di 8 mm di diametro per quantificazione affidabile fuochi di fluorescenza. Utilizzando un programma di elaborazione di immagini (ad esempio di ImageJ), unità di fluorescenza assoluto potrebbe essere quantificata per campioni di tessuto studiato e l'adesione batterica potrebbe essere espresso per esempio come un segnale relativo al controllo interno (innesti irrorati con batteri non marcato).
La limitazione principale di questa impostazione sperimentale sono i problemi connessi con gli studi in vitro in generale. Risultati raggiunti utilizzando questo modello di camera del flusso in vitro potrebbero essere trasferiti a un modello animale per conferma in vivo .
In conclusione, questo modello in vitro permette di indagine su singolo batterico, tessuto e basati su taglio fattori che contribuiscono all'insorgenza di adesione batterica ai tessuti in un modo graduale. La conoscenza dichiara abilitata potrebbe contribuire allo sviluppo della più efficace prevenzione e trattamento di IE.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Questo studio è stato sponsorizzato da un grant di ricerca fondo KU Leuven (OT/14/097) dato a RH. TRV è stato borsista della Fondazione di ricerca FWO - Flanders (Belgio; Concedere il numero - 12K0916N) e RH è supportato dalla clinica ricerca fondo di UZ Lovanio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
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