Her gir vi detaljert protokoller peroralt antibiotika mus, fecal prøver, DNA utvinning og kvantifisering av fekal bakterier av qPCR.
Tarmen bakterieflora har en sentral innflytelse på menneskers helse. Mikrobiell dysbiosis er forbundet med mange vanlige immunopathologies som inflammatorisk tarmsykdom, astma og leddgikt. Dermed er forstå mekanismene bak bakterieflora immunsystem crosstalk avgjørende. Antibiotikumet administrasjon, samtidig hjelpe patogen fortolling, også induserer drastiske endringer i størrelsen og sammensetningen av intestinal bakteriell samfunn som kan ha innvirkning på menneskers helse. Antibiotika behandling i mus viser virkningen og langsiktige endringer i menneskelig bakterieflora fra antibiotika behandlet pasienter, og aktiverer undersøkelse av mekanistisk koblingene mellom endringer i mikrobielle samfunn og immun celle-funksjonen. Mens flere metoder for antibiotikabehandling mus har blitt beskrevet, indusere noen av dem alvorlig dehydrering og vekttap kompliserende tolkningen av dataene. Her gir vi to protokoller peroralt antibiotika som kan brukes for langsiktig behandling av mus uten å indusere store vekttap. Disse protokollene gjør bruk av en kombinasjon av antibiotika som er rettet mot både Gram-positive og Gram-negative bakterier og kan gis enten annonse libitum i drikkevannet eller muntlig gavage. Videre beskriver vi en metode for kvantifisering av mikrobielle i fecal prøver av qPCR som kan brukes til å validere effekten av antibiotika behandling. Kombinasjonen av disse gir en pålitelig metode for manipulering av det tarmen bakterieflora og studier av effekten av antibiotika behandling i mus.
Pattedyr mage mucosa er et unikt miljø kolonisert av en svært kompleks blanding av mikroorganismer som etablerer et mutualistic forhold til verten. Forsvar av tarmen består av en epiteliale lag og en overflod av immunceller som begrenser commensals i tarmen samtidig bevare deres antall og mangfold. Derimot er commensal organismer nødvendig for utvikling av et fullt fungerende immunsystem. Mens interaksjoner mellom vert og gram-negative bakterier er normalt gunstig, blir det stadig klarere at dysregulated immunsystem-bakterieflora crosstalk kan favorisere utviklingen av kronisk inflammatorisk sykdommer, slik asinflammatory tarm sykdom, leddgikt eller astma1,2.
Tarmen bakterieflora kan endres av ulike faktorer, men kanskje de mest drastiske endringene er indusert av antibiotika behandling som alvorlig endrer både størrelsen og sammensetningen av bakteriell samfunn3,4. Mens fordelene med antibiotika til å behandle infeksjoner er ubestridelig, kan endres bakterieflora indusert av antibiotika eksponering i mennesker også endre immunforsvar som kan føre til skadelige effekter på helse. For eksempel antibiotika behandling hos mennesker har vært knyttet til økt risiko for Clostridium difficile-indusert diaré, astma og visse typer kreft3. Antibiotika behandling i mus viser virkningen og langsiktige endringer som finnes i tarmen samfunn av antibiotika-behandlede pasienter og aktivert undersøkelse av mekanistisk koblingene mellom endringer i mikrobielle samfunn og immun celle-funksjonen. Men har flere rapporter vist at administrasjon av antibiotika på drikkevann annonse libitum gir veldig merkbar vekttap som mus avstå fra drikkevann, antagelig på grunn av sin foul smak5,6. Dermed i disse modellene kan alvorlig dehydrering samtidig til muntlig antibiotikumet administrasjon komplisere tolkningen av eksperimenter å identifisere effekten av antibiotikabehandling immun celle funksjon.
Flere tilnærminger kan brukes å utforske størrelsen og sammensetningen av mikrobielle samfunn i intestinal seksjon7. Neste generasjons sekvensering teknologi har gitt uvurderlige data på denne saken8, men disse metodene er relativt dyrt og krever ekspert bioinformatic analyser for tolkning av dataene. På den annen side, tradisjonelle mikrobiologisk kultur metoder tillater påvisning av bakteriell arter, men de har lav følsomhet og en stor andel av commensal bakterier (spesielt anaerobes) er svært vanskelig eller umulig å dyrke med tilgjengelige metoder8. Kvantitativ polymerase kjedereaksjon (qPCR) teknikker brukes stadig for kvantifisering og identifikasjon av fecal bakterie-art, som de gir en rask og pålitelig kultur-uavhengig mål på total mikrobiell lasteevne. Følgelig qPCR metoder har vist seg nyttig å studere endringer i bakterieflora tilknyttet alder eller progresjon av flere sykdommer inkludert inflammatorisk tarm sykdom9,10. I tråd med dette gir qPCR metoder en rask og kostnadseffektiv tilnærming for å validere effekten av ulike behandlinger (inkludert antibiotika) i fecal bakteriell laster og bakterieflora komposisjon10,11,12.
Her presenterer vi en detaljert trinnvise redegjørelse for to forskjellige protokoller peroralt antibiotika til mus, fecal eksemplar innsamling, DNA utvinning, utarbeidelse av standarder og måling av bakterier i fecal prøver av qPCR. Disse protokollene gir en pålitelig metode å manipulere den tarmen bakterieflora i mus og studie av virkningene av antibiotika behandling i intestinal homeostase og sykdom.
Her gir vi eksperimentell protokoller peroralt antibiotika til mus og kvantifisering av fekal bakterier av qPCR. Kombinasjonen av antibiotika brukt i denne protokollen (inneholder ampicillin, gentamicin, neomycin, metronidazole og vancomycin) mål både Gram-positive og Gram-negative bakterier, tilbyr bakteriedrepende aktivitet mot et fullt spekter av bakterier. Både muntlig gavage og administrasjon av antibiotika i drikkevannet sterkt redusere fecal bakteriell laste5,6,12. Videre har begge behandlinger en dyp effekt på fenotypen av musene som de utvikler flere egenskaper som er typiske for bakterie-fri mus inkludert redusert milt størrelse og forstørret cecum. Valg av en bestemt metode for antibiotikumet administrasjon kan muligens avhenger på lengden på eksperimentet som muntlig gavage metoden krever daglig administrasjon av antibiotika, blir mer arbeidskrevende og muligens forårsaker mer ubehag til den dyr i det lange løp.
For administrasjon av antibiotika i drikkevannet, må forsiktighet tas med tillegg av søtningsmiddel til antibiotika blanding som dette er en avgjørende faktor for å holde mus fra dehydrering. Flere grupper har vist hvordan administrasjon av antibiotika i drikkevann (uten tillegg av søtningsmiddel) fører til svært alvorlig og raske vekttap med alle mus mister mer enn 20% av første kroppsvekt i de første dagene av eksperiment5 , 6. i våre protokollen, bruk av saccharine-baserte søtningsmiddel syntes å være tilstrekkelig til å maskere antibiotika smaken i vannet og mus mistet vekt i de første dagene etter antibiotikumet administrasjon, men utvinnes deres vekt raskt etter at ( Figur 1). Likevel, i vårt forsøk 5-10% av mus fortsatt nå menneskelige slutten-punktet i > 20% tap av planlagte kroppen vekt og måtte være euthanized. Vi har testet Sukralose-baserte søtningsmidler som mislyktes i å hindre mus dehydrering (100% av mus mistet > 20% vekt) mens andre forfattere har publisert lignende feil i aspartam-baserte søtningsmidler5,6. I tillegg til dette, bør alder, genetisk bakgrunn og generell helsestatus musene som brukes for eksperimenter vurderes, som de kan påvirke vekttap og dyr velvære under antibiotikabehandling. Derfor skal nøye overvåking av mus vekt og generelle helsetilstand utføres daglig under de to første ukene av muntlig antibiotikumet administrasjon.
qPCR metoder gir en rask og kostnadseffektiv tilnærming for kvantifisering av 16S rRNA i fecal prøver. Imidlertid noen begrensninger bør vurderes om denne teknikken inkludert: jeg) behovet for en pålitelig høy kvalitet standard; II) design og effektiviteten av qPCR primerne; III) det faktum at mikroorganismer kan ha forskjellige kopi antall 16S rRNA genet, dermed genet kopier kan ikke direkte lik celle teller15. Likevel, qPCR er en robust og sensitive metode som muliggjør rask analyse av fecal eksemplar. Denne metoden kan være spesielt nyttig å validere raskt effekten av ulike behandlinger (inkludert antibiotika) i fecal bakteriell laster som beskrevet her. Videre, selv om vi gir en protokoll for kvantifisering av totale . 16S rRNA, denne metoden kan lett tilpasses (ved å utforme spesifikke primere16) identifisere individuelle bakteriell taxa, altså både kvantitative og kvalitativ informasjon om microbiome størrelse og sammensetning.
I sammendraget, har vi gitt to protokoller for oral antibiotika behandling av mus og en qPCR-basert metode å kvantifisere antibiotika-induserte endringer i fekal bakterier. Selv om disse protokollene kan ytterligere optimalisert og kombinert med andre tilnærminger til egne eksperimentelle behov, kan de tjene som rask, kostnadseffektiv og pålitelig verktøy for å manipulere den murine tarmen bakterieflora og studie av virkningene antibiotika behandling i intestinal homeostase og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av den britiske Medical Research Council (grant P.B. MR/L008157/1); R.J. ble støttet av et Marie Curie Intra-European fellesskap (H2020-MSCA-hvis-2015-703639); P.M.B. ble støttet av en studentship fra den britiske Medical Research Council og King’s College London doktorgrad trening partnerskap innen biomedisinsk vitenskap (MR/N013700/1).
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (Merck) | A9518 | |
Neomycnin trisulfate salt hydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | N1876 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich (Merck) | M3761 | |
Vancomycin hydrochloride | Sigma-Aldrich (Merck) | V2002 | |
Gentamicin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Merck) | G3632 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich (Merck) | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich (Merck) | Y1625 | |
NaCL | Sigma-Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sweetener Sweet'n Low | Sweet'N Low | Available in the UK from Amazon.co.uk | |
X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside) | Fisher scientific | 10234923 | |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | |
Ultrapure Agarose | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 16500500 | |
RT-PCR grade water | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM9935 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725124 | with ROX |
TOPO TA cloningTM for sequencing | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 450030 | |
QIAamp fast DNA Stool mini kit | Qiagen | 51604 | |
QIAprep spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Syringe filter 0.45µm | Fisher scientific | 10460031 | |
Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades | Fisher scientific | 11792724 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | 300613 | |
1.5ml Crystal clear microcentriguge tube | StarLab | E1415-1500 | |
2ml Ultra high recovery microcentrifuge tube | StarLab | I1420-2600 | |
Oral dosing needles 20Gx38 mm curved (pk/3) | Vet-Tech | DE008A | |
Sterilin petri dish 50 mm | Scientific Laboratory Supplies | PET2020 | |
Absolute qPCR plate seals | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | |
MicroAmpTM optical 384-well plate | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4309849 | |
ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4453536 | |
Spectrophotometer (Nanodrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | |
Labnet Prism microcentrifuge | Labnet | C2500 | |
MultiGene Optimax Thermal cycler | Labnet | TC9610 |