Vi presenterer en protokoll for sanntids optisk påvisning av ett umerket proteiner som de utskilles fra levende celler. Dette er basert på interferometric spredning (iSCAT) mikroskopi, som kan brukes til en rekke ulike biologiske systemer og konfigurasjoner.
Viser vi interferometric spredning (iSCAT) mikroskopi, en metode stand til å oppdage enkelt umerkede proteiner skilles ut fra individuelle levende celler i sanntid. I denne protokollen dekker vi de grunnleggende trinnene for å realisere en iSCAT mikroskop og komplettere den med flere tenkelig kanaler å overvåke levedyktigheten til en celle under studien. Etter bruker vi metoden for sanntids deteksjon av enkelt proteiner som de utskilles fra en levende celle som vi viser med en udødeliggjort B-celle linje (Laz388). Nødvendige skritt om utarbeidelse av mikroskopet og prøve og analyse av de innspilte dataene diskuteres. Video protokollen viser at iSCAT mikroskopi tilbyr en enkel metode for å studere sekresjon på enkelt-molekylet nivå.
Utskilles proteiner spiller en betydelig rolle i ulike fysiologiske prosesser1. Derfor er de rutinemessig studerte som en kollektiv ensemble (Proteomikk) eller enkeltenheter2,3. Proteomikk undersøker tradisjonelt hele settet med proteiner i et bestemt biologisk system som f.eks enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA), flowcytometri eller massespektrometri4,5, 6. Enkelt proteiner, derimot, oppdages vanligvis bruker en rekke teknikker som er basert på fluorescens7,8, plasmonics9,10eller kryogene elektron11 microscopies. Alle disse teknikkene bruker komplekse instrumenter, merking eller begge og ofte mangler dynamics informasjon som de bare leverer langsiktig informasjon om systemet under studien.
Her bruker vi iSCAT12,13 mikroskopi følelse personlige sekretoriske proteiner med sub-sekunders midlertidig løsning14. Viktigere, oppdager teknikken svake spredte signalet iboende hver protein12,14. Mengden lys som en liten bioparticle sprer skalerer med sin polarizability. Forutsatt at formen på et protein kan tilnærmes ved en effektiv spredning sfære14,15,16, og at ulike proteiner har ligner refractive indekser, målt signalet kan være direkte koblet til molekylvekt (MW) av protein. Empirisk kalibrering av iSCAT kontrast mot molekylær vekt av referanse målinger gjør det mulig å skille proteiner av forskjellige størrelser. iSCAT eksperimenter kan lett bli supplert med fluorescens mikroskopi17,18, immunosorbent reagenser, så vel som fluorescerende eller spredning etiketter å tillate en bestemt oppdagelsen av noe protein rundt14 , 17 , 19.
I prinsippet iSCAT fungerer ved å forsterke et protein, svak lys spredt via interferometric blander med en sekundær referanse bølge. Oppdaget intensiteten () i en iSCAT mikroskopet er beskrevet av
hvor er hendelsen intensiteten, er en koeffisient for bidraget av referanse wave, betyr spredning styrke nano-objektet under studien, og er faseskift mellom den spredte og referanse bølger14. Enten overført eller tilbake-reflekterte hendelsen lyset er vanligvis brukt som en referanse bølge, hvor i hvert tilfelle står for transmissivity eller Reflektivitet for eksempel kammeret, henholdsvis. Begrepet er proporsjonal med protein’s spredning tvers delen og kan bli neglisjert forhold til korset begrepet. Dermed, sette for komplett destruktiv interferens, oppdaget lyset er gitt av der er referanse intensiteten og er forstyrrelser intensiteten.
iSCAT mikroskopi tilbyr en utmerket metode for å studere biologiske prosesser på enkelt-molekylet nivå. Som et eksempel, undersøker vi Laz388 celler – en Epstein – Barr virus (EBV) forvandlet B-lymfocytt cellen linje20,21 , som de skiller proteiner som IgG-antistoffer16. Men metoden er generelt og kan brukes til en rekke andre biologiske systemer. iSCAT er iboende uspesifikke og kan oppdage noen protein eller hydrogenion eller det kan utvides med vanlige overflate functionalization metoder for spesifikke eller multiplex gjenkjenning. Dens enkelhet og muligheten til å kombineres med andre optisk teknikker, for eksempel fluorescens mikroskopi, gjør iSCAT til et verdifullt supplerende verktøy i cell biology.
En av de viktigste aspektene å skaffe nyttig iSCAT data er muligheten til å finne riktig fokus posisjon på dekkglassvæske overflaten, og videre til hold denne posisjonen i lange perioder. Unnlater å gjøre det vil resultere i utvidet PSFs, svak iSCAT signaler og drift-assosiert gjenstander i dynamics analyser. Det viser seg at finne fokalplanet på en ren, nakne dekkglassvæske overflate ikke er en lett oppgave som overflaten ikke er synlige på store referanse strålen bakgrunn (se Figur 4 d).
Rå iSCAT bilder er ofte skjult av bakgrunnen signaler som oppstår fra wavefront urenheter i excitation kilde, og kan hindre ens evne til å finne riktig tenkelig flyet. Aktive wavefront subtraksjon er en nyttig måte å omgå dette problemet og senere overvåke iSCAT fokus under en måling16. Én måte å oppnå dette er gjennom romlige eksempel modulering. I korte trekk gjelder en funksjonsgenerator en 50 Hz firkantbølge ekstern kontroll porten piezo scenen, noe som resulterer i en romlig eksempel moduleringshjul på anvendt frekvens (290 nm amplituden). Synkron kameraet oppkjøp utløses fra samme kilde, og når kombinert gjennom låsbare prinsipper, resulterer i en wavefront-kompensert bilde14,16. Det resulterende bildet viser vanligvis overflateruhet av dekkglassvæske (figur 4e). Små funksjoner igjen på glasset etter rengjøring kan brukes til å bringe mikroskopet i fokus. Parametere som brukes for dette aktive bakgrunn subtraksjon trinnet kan endres etter bildefrekvens, eksponeringstid eller maskinvare.
Som nevnt ovenfor, bruk av en høy kvalitet strålen splitter i iSCAT stilling (trinn 1.2.1.) anbefales som imaging gjenstander som skygger eller forstyrrelser som oppstår tynn planar strålen splittere vil påvirke bildet og forstyrre målingen. Figur 7 viser en sammenligning mellom en høy kvalitet og lav kvalitet strålen splitter. Både rå iSCAT bilder viser samme område på dekkglassvæske som inneholder noen gjenværende partikler. Samme iSCAT oppsett ble brukt til å fange både bilder, bare bjelke oppdelingen ble utvekslet. Figur 7a viser bildet dannet på kameraet ved bruk av en tykkere (5 mm), AR-belagt, og klemt fast bredde splitter. På grunn av klemt fast design, reflektert strålen fra tilbake overflaten av bjelke splitter anti-parallell til refleksjon som oppstår fra overflaten og inn ikke målet. Ingen forstyrrelser gjenstander oppstå. Figur 7b viser samme synsfelt på prøven, men denne gangen en tynnere (1 mm) planar strålen splitter ble brukt. To refleksjoner fra og baksiden splitterens strålen er parallell og overføres til kameraet. Forstyrrelser gjenstander er klart synlig.
Figur 7: sammenligning av iSCAT bilder produsert med høy og lav-kvalitet strålen splitters. (a) noe som resulterte rå iSCAT bilde ved bruk av en 5 mm tykk, AR-belagt og klemt fast bredde splitter. (b) noe som resulterte rå iSCAT bilde av samme område ved hjelp av en 1 mm tykk planar strålen splitter. Begge strålen splittere har samme splitting forhold (50% refleksjon, 50% overføring). Forstyrrelser gjenstander som oppstår fra Fresnel refleksjoner er tydelig observert i bildet med 1 mm tykke planar strålen splitter. Skalere barer: 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I denne protokollen beskriver vi et bredt felt belysning oppsett for iSCAT som det er rask og enkel å forstå og gir mulighet for parallell sensing over et stort område14. En annen felles tilnærming er å bruke acousto-optisk deflektorer (AODs) og skanning en AC confocal stråle eksempel12,17. Dette unngår behovet for høy kvalitet wavefronts men er mer eksperimentelt kompleks enn konvensjonelle wide-field bildebehandling. Videre er hastigheten på AC confocal belysning begrenset av for AODs. Avhengig av ønsket eksperimentelle parametrene kan enten AC confocal eller wide-field belysning ordninger i prinsippet benyttes for å oppdage enkelt proteiner skilles ut fra levende celler.
Som omtalt i protokollen, er det viktig å minimere lateral mekanisk svingninger i utvalg scenen av mikroskopet. Selv nanometer avvik i posisjonen til prøven kan føre til variasjoner i påfølgende kameraet rammer og indusere betydelig ytre støy i differensial bildet. Det anbefales derfor å bruke en mekanisk stabil mikroskop scene og en dempet optisk tabell (trinn 1.1.1.) og dekker installasjonen med optisk gardiner eller panel under et eksperiment (trinn 3.5.).
Et fokus stabilisering ordningen kan også bli vurdert for langsiktige mål. I denne tilnærmingen, er en andre laser innlemmet i mikroskopet totale interne refleksjon (TIR) arrangement, og senere fotografert på en kvadrant photodiode. Endringer i systemets fokus oversette til laterale forskyvninger av TIR laser spot på kvadrant diode, som deretter kan brukes i et aktivt feedback loop for å kontrollere z-aksen piezo scenen26. Vertikal drift langtidseffekter er dermed eliminert.
Flere endringer og utvidelser kan brukes med presentert teknikken adresse eksperimentelle behov. For eksempel kommersielle mikroskop scenen inkubatorer er tilgjengelig som kan lett bli innarbeidet i iSCAT mikroskop for langsiktig avbildning av celler. Andre teknikker kan også implementeres for å komplettere iSCAT imaging som AC confocal eller TIR fluorescens microscopies17. For å tilpasse på systemet under studien, iSCAT sekresjon målinger kan utføres andre cellen medier som DMEM eller DPBS, men bør den pH indikator fenol røde unngås så det kan forstyrre forsøket på grunn av absorpsjon av laserlys. I tillegg inneholder som fosterets kalv serum (FCS) eller menneskelig Platederivert lysate (hPL) proteiner som kan forstyrre iSCAT gjenkjenning. Avhengig av ønsket følsomheten av eksperimentet, bør disse kosttilskudd ekskluderes fra mikroskopi medium.
iSCAT er avhengig av en analytt muligheten til å spre lys – en egenskap som er iboende alle proteiner, og er dermed iboende uspesifikke. Likevel er noen grad av spesifisitet mulig som iSCAT signaler skala lineært med protein masse14,27,28. Dette gir kalibrering av en iSCAT system som bruker standard protein utvalgene, for eksempel bovin serum albumin (BSA) og fibrinogen14,27,28. I faktisk ganske nylig, unge et al. 28 har utvidet på arbeidet til Piliarik & Sandoghdar14 og har vist at iSCAT kan brukes til å bestemme molekylvekt av proteiner så liten som streptavidin (53 kDa) med en masse oppløsning på 19 kDa og en nøyaktighet på ca 5 kDa. Flere konvensjonelle tilnærminger kan videre utfyller iSCAT ved å gi et ekstra nivå av spesifisitet. Som et eksempel, enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA) eller andre overflaten modifikasjoner, begrense oppdaget protein bindende hendelser slik at bare målet protein er16.
I denne protokollen beskrev vi hvordan iSCAT mikroskopi kan brukes å undersøke mobilnettet sekreter på enkelt protein nivå med subsecond midlertidig løsning16. Teknikken er generelt og kan implementeres på noen kommersielle eller hjemme-bygget mikroskop. I motsetning til én-molekylet fluorescens tilnærminger, metoden lider ikke av photobleaching eller blinker effekter, men det fremdeles oppnår single-protein følsomhet. Disse funksjonene gjør iSCAT et kraftig verktøy i biosensing og mikroskopi. Framtidige applikasjoner vil fokusere på Klargjørende komplekse mobilnettet interaksjoner som immunologiske respons til stimulans eller mobil kommunikasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Max Planck samfunnet, et Alexander von Humboldt professorat og Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Vi takker Stefanie Schaffer på Universitätsklinikum Erlangen gir Laz388 celler og nyttig diskusjoner. Vi takker Simone Ihloff og Maksim Schwab på MPL for kundestøtte.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |