Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

خالية من تسمية "التصوير من واحد البروتينات ويفرز" من "الخلايا الحية" عبر إيست المجهري

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58486
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4, 4, 1,3
1Max Planck Institute for the Science of Light (MPL), 2Area of Scientific Learning, Milligan College, 3Department of Physics, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg, 4Department of Internal Medicine 5, Hematology and Oncology, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg (FAU), University Hospital Erlangen

Summary

نقدم بروتوكولا لكشف البروتينات غير مسمى واحد البصرية في الوقت الحقيقي كما أنها هي ويفرز من الخلايا الحية. يستند هذا الفحص المجهري التداخل السوناريه نثر (إيسكات)، التي يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية المختلفة والتكوينات.

Abstract

علينا أن نظهر مجهرية التداخل السوناريه نثر (إيست)، طريقة قادرة على اكتشاف البروتينات غير مسمى واحد يفرز من الخلايا الحية الفردية في الوقت الحقيقي. في هذا البروتوكول، ونحن تغطية الخطوات الأساسية لتحقيق مجهر إيسكات وتكمل ذلك مع القنوات تصوير إضافية لمراقبة صلاحية خلية قيد الدراسة. وفي أعقاب ذلك، نستخدم الأسلوب للكشف في الوقت الحقيقي من البروتينات وحيدة كما أنها هي تفرز من خلية حية التي نظهر مع خط ب-خلية مخلدة (Laz388). وتناقش الخطوات اللازمة فيما يتعلق بإعداد المجهر وعينه وكذلك تحليل البيانات المسجلة. البروتوكول فيديو يوضح هذا الفحص المجهري إيسكات يوفر طريقة مباشرة لدراسة إفراز على مستوى جزيء واحد.

Introduction

يفرز البروتينات تلعب دوراً هاما في العمليات الفسيولوجية المختلفة1. وبسبب هذا، يتم درسوا بشكل روتيني فرقة جماعي (البروتينات) أو ككيانات فردية2،3. البروتيوميات تقليديا تحقق مجموعة كاملة من البروتينات موجودة في نظام بيولوجي معين عن طريق مثلاً، فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) أو قياس التدفق الكتلي4،5، 6. البروتينات وحيدة، ومن ناحية أخرى، يتم عموما الكشف عن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تستند إلى الأسفار7،8أو9،plasmonics10إلكترون المبردة11 ميكروسكوبيس. كل من هذه التقنيات استخدام الأدوات المعقدة، ووضع العلامات، أو كليهما، وغالباً ما تفتقر إلى معلومات حيوية كما أنها تقدم فقط معلومات طويلة الأجل حول النظام قيد الدراسة.

هنا نستخدم إيست12،13 الفحص المجهري للاحساس بالبروتينات الافرازية الفردية مع الأزمنة الفرعية الثانية14. الأهم من ذلك، يكشف الأسلوب الإشارات متناثرة ضعيفة الأصيلة لكل12،البروتين14. جداول كمية الضوء التي تنتشر بيوبارتيكلي صغيرة مع ما الاستقطابية. وعلى افتراض أنه يمكن تقريب شكل البروتين نثر فعالة مجال14،،من1516، وأن مختلف البروتينات الانكسار مشابهة جداً، ويمكن أن تكون الإشارة المقاسة مباشرة متصل بالوزن الجزيئي (ميغاواط) من البروتين. معايرة التباين إيست مقابل الوزن الجزيئي بالقياسات المرجعية التجريبية يسمح أحد للتمييز بين البروتينات ذات أحجام مختلفة. تجارب إيسكات سهولة يمكن أن تستكمل بالأسفار مجهرية17،18، والكواشف الممتز، فضلا عن تسميات الفلورسنت أو بعثرة للسماح للكشف عن أي البروتين الفائدة14 محددة , 17 , 19.

من حيث المبدأ، وظائف إيست بتضخيم الضوء متناثرة ضعيفة للبروتين عن طريق التداخل السوناريه الاختلاط مع موجه مرجع ثانوي. كثافة المكتشفة (Equation 1) في إيسكات يصفها المجهر

Equation 2

حيث Equation 3 شدة الحادث، Equation 4 معامل لمساهمة موجه الإشارة، Equation 5 يدل على قوة ونثر النانو-الكائن قيد الدراسة، و Equation 6 هي مرحلة التحول بين متناثرة ومرجع أمواج،14. أما المنقولة أو تنعكس مرة أخرى الحادث الضوء يستخدم عادة كموجة إشارة، حيث في كل حالة Equation 7 حسابات ترانسميسيفيتي أو انعكاسية الدائرة عينة، على التوالي. المصطلح Equation 8 يتناسب مع البروتين تناثر عبر الباب ويمكن إهمال مقارنة بمصطلح الصليب. وهكذا، وضع Equation 9 للتدخل المدمر كاملة، وضوء الكشف عن ترد عليه Equation 10 حيث Equation 11 شدة الإشارة و Equation 12 شدة التدخل.

إيسكات المجهري يوفر وسيلة ممتازة لدراسة العمليات البيولوجية على مستوى جزيء واحد. على سبيل مثال، نحن التحقيق في الخلايا Laz388 – فيروس ابشتاين-بار (EBV) تحول اللمفاويات بالخليه خط20،21 – كما أنها تفرز البروتينات مثل الأجسام المضادة IgG16. ومع ذلك، الأسلوب العام ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية الأخرى. إيست هو أصلاً غير محدد ويمكن الكشف عن أي بروتين أو نانوحبيبات أو أنه يمكن تمديدها مع أساليب الروغان السطح المشترك لكشف محددة أو متعدد. بساطته والقدرة على الجمع بين التقنيات البصرية الأخرى، مثل الفحص المجهري الأسفار، جعل إيست أداة تكميلية قيمة في خلية علم الأحياء.

Protocol

تنبيه: يرجى قراءة جميع صحائف بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل استخدام أي مواد كيميائية ومراقبة جميع ممارسات السلامة المناسبة، وارتداء معدات الوقاية الشخصية (نظارات واقية الليزر، حماية العين، القفازات، ومعاطف المختبرات) حسب الحاجة.

1-بناء إيست المجهر16،18

ملاحظة: المجهر إيست يتكون عادة من إعداد تعديل المجهر المقلوب. وباختصار، ليزر وتركز على المستوى البؤري مرة أخرى من هدف الفتحة العددية عالية (غ) ويستخدم عدسة تصوير إلى التركيز الجسيمات المنتشرة في الظهر الضوء على رقاقة كاميرا. بشكل عام، يمكن بناؤها من الصفر هذا المجهر واسع المجال أو استناداً مجهر مقلوب موجود. ويغطي هذا البروتوكول خطوات ضرورية لتحقيق الإعداد، بينما التغييرات في الأجهزة المستخدمة الممكنة. ويمكن الاطلاع على وصف أكثر تفصيلاً للجمعية المجهر إيست في أعمال أرويو et al. 18.

تنبيه: ينطوي مجهر إيسكات IIIB فئة "الفئة الرابعة" الليزر مصدر الضوء. من الضروري حماية العين المناسبة عند تجميع ومحاذاة البصريات المجهر. أثناء الجمعية العامة المجهر، تأكد من أن مسار شعاع الليزر ويظل مستقيم وهو لا نحيد كما تتم إضافة مكونات بصرية جديدة.

  1. قم بإعداد مسار إضاءة المجهر.
    1. استخدام جدول ضوئية ثبط وكتلة معدنية صلبة، بناء مجهر عينة مرحلة18 يتضمن هدفا فتحه عددية عالية (غ) (100 X/1.46 غ) ووحدة لترجمة التي تسمح لترجمة نموذج الأفقي، فضلا عن تغيير في التركيز الموقف لتحقيق الهدف.
      ملاحظة: تشغيل المجهر إيست في الحد الأقصى لكشف البروتينات وحيدة عرضه للاهتزازات الخارجية. ينصح مرحلة بيزو سينتروسيميتريك الذي يعتمد العينة من جميع الجوانب للحد من الجسيمات الصوتية من العينة التي وإلا يعرض للخطر الاستقرار المركزية والجانبية. ويبين الشكل 1 مرحلة عينة مناسبة، بما في ذلك وحدة الترجمة بيزو والهدف. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن أن تستخدم يتصاعد ضخمة ومستقرة لجميع المكونات البصرية التي تمت مناقشتها في الخطوات التالية. هذه المكونات متاحة بسهولة من الموردين البصريات التجارية.
    2. استخدام عدسة القميص البعد البؤري 50 سم (عدسة واسع المجال) و 45° (عمودي) اقتران مرآة للتركيز على ضوء ليزر صمام ثنائي في الطول الموجي 445 شمال البحر الأبيض المتوسط على المستوى البؤري العودة من الهدف. وهذا يخلق شعاع وتحديدالمنطقه في التركيز الهدف إلى الأمام، وسوف تصبح مصدر الإضاءة إيست. إذا لزم الأمر، قم بتصفية الليزر مكانياً قبل العدسة 50 سم عن طريق 30 ميكرومتر الثقب أو الألياف وضع واحد.
    3. تطبيق معالجة تجميعية للنفط الغمر بالهدف ومكان ساترة زجاجية في الطائرة عينة من مرحلة مجهر. وهذا سيؤدي إلى شعاع يعكس التراجع عن طريق التصوير والهدف.
      ملاحظة: الانعكاس ينبع من الواجهة الزجاجية الهواء على السطح العلوي ساترة عينة وسيكون بمثابة الأساس لشعاع المرجع إيسكات. المتبقية من التراب أو الغبار على سطح ساترة ستؤدي إلى تشتت المصادر، التي تساعد في التركيز الصحيح لهدف التصوير في الخطوات التالية.
      تنبيه: معظم ضوء الليزر ينقل عن طريق ساترة ويسافر مباشرة أعلى من الهدف. ضع الناشر براق كامد (مثلاً.، بطاقة ورق) أعلاه ساترة للتقليل من خطر الإصابة من ضوء الليزر.

Figure 1
رقم 1: مرحلة عينة إيست- تظهر الصورة كتلة الألومنيوم الواسعة النطاق التي شنت وحدة الترجمة بيزو (أسود) فضلا عن 100 توسيط × الهدف. المرحلة 3-محور بيزو يسمح لتحديد المواقع بدقة العينة في المستوى البؤري للهدف. تركز الخشنة ينفذ عن طريق تناوب أنبوب خيوط التي شنت الهدف (لا يصور). يتم وضع بلوك على الطاولة الضوئية مع أربع ركائز الصلب أعلاه مرآة اقتران 45°. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. قم بإعداد مسار التصوير من المجهر.
    1. يعرض أنتيريفليكشن (ع)-مغلفة بشعاع الخائن (انعكاس 70%، وانتقال 30%) بزاوية 45 درجة بالنسبة لشعاع الحادث، وما يقرب من 10 سم بعد العدسة واسع المجال. نقطة طلاء ع صوب مصدر الليزر. هذا ينقل شعاع الحادث، ويعكس الإشارة ومتناثرة الشعاع بزاوية 90 درجة لشعاع الحادث.
      ملاحظة: ينصح شق الحزم المغلفة AR و/أو مثبتة كما يمكن أن تحدث تأثيرات الظلال وهامش كبير عند استخدام شعاع تقسيم المكعبات، أو شق شعاع مستو غير المصقول. انظر المناقشة للحصول على المزيد من التفاصيل. إذا رغبت في ذلك، قد يتم حظر أي شعاع ينعكس غير المرغوب فيها ناشئة عن الجانب الخلفي من التقسيم شعاع باستخدام الأغشية آيريس.
    2. سوف يعرض الخائن شعاع سميكة تشريد شعاع كبير حيث أن الليزر قد لا يدخل الهدف مباشرة بعد الآن. إذا لزم الأمر، إعادة توجيه مسار شعاع الليزر قبل التقسيم شعاع لضمان نشر الصحيح من خلال الهدف.
      ملاحظة: قد أيضا إضافة التقسيم شعاع قبل العدسة ميدانية واسعة ومرحلة مجهر يتوضع (في الخطوة 1.1.2.)، حيث أنه سوف لا يكون المشردين الشعاع لاحقاً.
    3. عند هذه النقطة، تركز ذراع السابر التصوير والتأكد من أن نموذج الطائرة وكاميرا بارفوكال. ضع f مقعرة = عدسة-45 سم في موقف 5 سم بعد العدسة واسع المجال في مسار الشعاع الحادث. وهذا سيؤدي إلى شعاع وتحديدالمنطقه دخول الفتحة الخلفية للهدف.
    4. مع شاشة موضوعة في ذراع ينعكس السابر، نقل الهدف في الاتجاه العمودي للعثور على موضع تركيز الخشنة. والهدف في التركيز عند شعاع ضرب الشاشة وتحديدالمنطقه.
      ملاحظة: يبين الشكل 2 تخطيطي لهذه العملية.
    5. إزالة كلا f =-45 سم العدسة والشاشة عند اكتمال تركز الخشنة.
      ملاحظة: بدلاً من استخدام عدسة البعد البؤري سالبة، واسع المجال العدسة نفسها قد تكون وضعت على جبل منقولة وتحولت خارج مسار الشعاع لهذه الخطوة. ومع ذلك، من المستحسن لتحقيق التكوين المجهر الأكثر استقرارا، عقد العدسة واسع المجال في وضع ثابت.
    6. أضف و ثاني = 50 سم القميص عدسة لتركيز الضوء المتناثرة وكلمات الضوء المنعكس على جهاز الاستشعار لكاميرا CMOS. ضمان وضع العدسة 50 سم من الطائرة التنسيق مرة أخرى الهدف بغية إعادة كلمات شعاع الإشارة والتركيز على ضوء متناثرة.
    7. مكان المكمل رقاقة 50 سم بعيداً عن f = عدسة 50 سم وموقف الحزم مباشرة على منتصف الرقاقة.
      ملاحظة: يتم عادة استخدام المعلمات التالية للتصوير. إنتاج الطاقة من الليزر (الطول الموجي 445 نيوتن متر) يتم تعيين إلى 100 ميغاواط. الثقب وشعاع الخائن تخفف الضوء المنقولة حيث أن قوة فعالة دخول الهدف هو حوالي 9 ميغاواط. ويبلغ قطر شعاع الموضع عينة 6 ميكرومتر. مع عدسة التصوير المستخدمة، والتكبير الفعال للنظام هو العاشر حوالي 300. يتم تعيين حجم الصورة على رقاقة CMOS إلى 128 × 128 بكسل داخل المنطقة المضاءة، أسفر عن مجال رؤية لحوالي 5 × 5 ميكرومتر2. ويبين الشكل 3 تخطيطي المجهر إيست مجمع بشكل كامل.

Figure 2
رقم 2: تركز الخشنة المجهر إيسكات. التخطيطي يظهر هذا الترتيب للبصريات للمساعدة في إحلال النظام في التركيز. الجانب الخلفي من المقسم والحزم المغلفة AR (70/30 درجة البكالوريوس) يتسم باللون الأحمر. يتم توفير مسافات هامة باللون الأخضر. تتم الإشارة إلى الأطوال (f) من العدسات المستخدمة. يتم إضافة المكونات في مربع أزرق متقطع في الخطوات 1.2.6-1.2.7. تتم إزالة العدسة مقعرة (يستخدم لإعادة كلمات شعاع إيست المتقاربة) والشاشة في وقت لاحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مجهر إيسكات. التخطيطي يظهر المجهر إيست مجمع بشكل كامل. الجانب الخلفي من المقسم والحزم المغلفة AR (70/30 درجة البكالوريوس) يتسم باللون الأحمر. يتم توفير مسافات هامة باللون الأخضر. تتم الإشارة إلى الأطوال (f) من العدسات المستخدمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. إعداد قنوات إضافية بالتصوير.
    ملاحظة: هذا المقطع إضافة مسار التصوير آخر للمجهر الذي يسمح للمراقبة لمساحة كبيرة تحيط بالليزر إيست عن طريق الفحص المجهري مشرق الميدان، ورصد سلامة الخلية عن طريق الفحص المجهري الأسفار.
    1. زوجين الناتج من مصدر ضوء LED (حوالي 500 نانومتر < λ < 580 نانومتر) إلى فترة طويلة تعمل مسافة 20 ×/0.4 غ الهدف، وتثبيت المكونات الميكانيكية أعلاه قاعة العينة التي تسمح للتركيز والموضع الأفقي لإخراج الصمام على عينة.
      1. التأكد من أن الصمام إخراج الطيف ويغطي نطاق الإثارة علامة موت الخلية (يوديد propidium (PI)) ولا يتدخل في الأسفار (λ > 600 nm). استخدام المرشحات الضوئية إذا لزم الأمر.
    2. نقل الهدف العلوي أفقياً بحيث العلوي (واسع المجال) والسفلي (إيست) الأهداف التي تربطها علاقة خطية متداخلة. يتم تحديد هذا بواسطة وضع شاشة في إطار الهدف الأدنى وزيادة كثافة الضوء LED المنقولة على الشاشة. ضع λ = قصيرة-تمرير نانومتر 550 مرآة مزدوج اللون (المناول) لتقسيم المنقولة الصمام الخفيفة عن طريق الليزر إيسكات.
    3. تقسيم هذا الشعاع إلى اثنين من القنوات مع تقسيم شعاع النقل reflective/92% 8% (درجة البكالوريوس). المسار 92% القناة الأسفار وهو استخدام المسار 8% لتصوير مشرق الميدانية.
    4. صورة القناة مشرق الميدان على كاميرا CMOS باستخدام واو = 5 سم يبنوا متعامي العدسة.
    5. صورة القناة الأسفار على كاميرا CMOS منفصلة باستخدام واو = 5 سم يبنوا متعامي عدسة و λ = 600 نانومتر طويلة تمرير مرشح لحجب ضوء الإثارة. ويبين الشكل 4a تخطيطي المجهر مجمع بشكل كامل بما في ذلك جميع القنوات التصوير.

Figure 4
الشكل 4: الفحص المجهري إيست للبروتينات التي تفرزها الخلايا المفردة. (أ) التخطيطي المجهر المبينة في البروتوكول. انظر القسم 1 لمزيد من المعلومات. المختصرات: الصمام، أدى؛ منتدى جنوب المحيط الهادئ، مرشح تمرير قصيرة؛ obj، الهدف؛ المناول، قصيرة-تمرير مرآة مزدوج اللون؛ بكالوريوس، شعاع الخائن؛ قائمة بيم فورتين, مرشح تمرير منذ فترة طويلة؛ فرنك بلجيكي، مشرق الميدانية؛ فلور، الأسفار؛ C1-C3، كاميرا 1-3. (ب) برايت-حقل صورة واحدة Laz388 خلية حوالي 4 ميكرومتر بعيداً عن مجال الرؤية إيست (يصور بمربع أبيض). صورة اتخذتها كاميرا C3، شريط الحجم: 10 ميكرون. (ج) الأسفار صورة نفس المنطقة المبين في الفقرة (ب) مع موضع الخلية تميزت بدائرة بيضاء. نظراً لغياب fluorescence يشير إلى أن الخلية قادرة على البقاء. صورة اتخذتها كاميرا C2، شريط الحجم: 10 ميكرون. (د) إيست خام الكاميرا صورة اللقطة مع وقت التعرض المايكروثانيه 80. صورة اتخذتها كاميرا C1. (ه) صورة إيست من نفس المنطقة بعد الطرح الخلفية الزمانية المكانية كما هو موضح في جزء المناقشة. الصورة كانت المتكاملة على مدى 1000 متسلسلة الخام الإطارات (د) مع وقت إطار نهائي 400 مللي ثانية، ويكشف عن خشونة السطح من ساترة زجاجية. (و) المناظرة التفاضلية إيست الصورة التي توضح الحدث الملزم من البروتينات 2 على ساترة. الصورة شيد بطرح اثنين من الصور التي تمت تصفيتها على التوالي (ه). تغيير حجم أشرطة في (د)، (ه) و (و): 1 ميكرومتر. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ماكدونالد، عضو البرلمان وآخرون 16-الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. قم بإعداد الكمبيوتر والبرمجيات.
    1. قم بتوصيل جميع الكاميرات على جهاز كمبيوتر. تثبيت حزم برامج التشغيل الخاصة بكل منها، والحصول على وكتابة البرامج لسيطرتها.
      ملاحظة: الأجهزة المناسبة أمر ضروري للمقتنيات عالية السرعة. كحد أدنى، ينصح معالج متعدد النوى، 16 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي وبطاقة المختطف إطار وقرص الحالة الصلبة لتخزين البيانات.
    2. مراقبة الصورة إيست على كاميرا CMOS والتأكد من أنها في التركيز بالبحث عن جسيمات الغبار أو الاوساخ متبقية على ساترة زجاجية. تأكد من أن الصورة الجسيمات نقطة دائري متماثل نشر الدالة (PSF).
      ملاحظة: السبب الرئيسي في PSF غير دائري متماثل أن شعاع الليزر لا يدخل الهدف مباشرة ولكن بزاوية صغيرة فيما يتعلق بالمحور البصري. يتم تصحيح هذا عن طريق ضبط زاوية والموقف من شعاع الحادث مع مرآة اقتران 45°.
    3. قارن بين صور الكاميرا مجال المشرق والقنوات الأسفار. ضمان أن كلاهما في التركيز وعرض نفس المنطقة. تحقق من أن موقف الليزر إيسكات تقريبا في وسط الصورة والإحاطة علما بموقفها كمرجع لاحق. انظر الشكل 4 باء – 4f لصور الكاميرا نموذجي.
      ملاحظة: استخدم عينة خلية أو الخرز الفلورسنت للعثور على تركيز القناتين. مؤقت إزالة عامل التصفية منذ فترة طويلة-تمرير الأسفار لضبط النظام. يجب أن يكون أعلى بقليل من المستوى البؤري إيست التركيز للتصوير التقليدي للخلايا. وللتعويض عن ذلك دون نقل الهدف، تحل محل الكاميرات من مراكزها في تركيز و كل اثنين = العدسات 5 سم.
    4. تعيين المعلمات الكاميرا اللازمة. استخدم معدل إطار ثابت وتعطيل أدوات الكسب وتصحيح البرامج.
      ملاحظة: يتم استخدام المعلمات التالية: تم تعيين الكاميرا إيست إلى 5000 من الإطارات في الثانية (fps) مع وقت تعرض المايكروثانيه 80. وكما ذكر أعلاه، حجم الصورة 128 × 128 بكسل. تعمل الكاميرات مشرق الميدان والأسفار في حجم الإطار الكامل (1280 × 1024 بكسل). يجري تصوير برايت-الحقل مع وقت تعرض 20 مللي ثانية. يتم تعيين الكاميرا الأسفار إلى وقت التعرض 750 مللي ثانية، وتراكمت 5 إطارات متتالية لتشكيل الصورة النهائية واحدة. يتم الحصول على صور ساطعة-الحقل والأسفار في فترات زمنية ثابتة في ق 20.

2-التحضير للتجربة

  1. تحضير المتوسط مجهرية الأسهم.
    1. إضافة 25 مل من "محلول المخزن المؤقت حبيس" (1 مول/لتر) لمل 975 من المتوسط RPMI 1640 للحصول على ل 1 نهائي من 25 mmol/لتر حبيس الحل. بدلاً من ذلك، استخدام وسيلة المخزن مؤقت مع حبيس المدرجة بالفعل.
      ملاحظة: يتم استخدام حبيس للحفاظ على قيمة pH الوسط أثناء قياس في الظروف المحيطة (مثلاً، خارج حاضنة ودون إمدادات ثابتة من2 CO).
    2. تأخذ قاسمة من الحل اللازم لتجربة والسماح لها الاحماء لدرجة حرارة الغرفة. 2 مل متوسطة غير كافية. يبقى الحل الأسهم المتبقية في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد ومبومو المجهر.
    ملاحظة: تصف الخطوات التالية الإجراء لحامل المواصفات عينة تتكون من صفيحة قاعدة ألومنيوم وصحن ومبومو اكريليك إصلاحات ساترة والأزواج إلى positioner 3D كهرضغطية على حد سواء. كما يمكن استخدام أطباق الثقافة العقيمة المتاحة تجارياً مع أسفل زجاج.
    ملاحظة: يبين الشكل 5 صور فوتوغرافية لصاحب العينة المواصفات.
    1. ساترة مجهرية جديدة وشطفه بالمياه (المياه دي) والإيثانول. الهواء الجاف للشريحة مع النيتروجين أو الهواء المضغوط.
    2. تنظيف ساترة في جو بلازما الأوكسجين (0.3 [مبر] ضغط الغاز) لمدة 10 دقيقة في 500 "ث الترددات اللاسلكية" السلطة. يؤدي هذا إلى إزالة كل الشوائب العضوية من على سطح الأرض.
    3. تنظيف الطبق ومبومو اﻷكريليك بتخبط عليه في 0.2 mol/L حل هيدروكسيد الصوديوم لحوالي 10 دقيقة شطف مع الماء دي.
    4. تجميع صاحب العينة وتغطية ذلك مع بلاستيك طبق بيتري حتى حاجة في التجربة.

Figure 5
الرقم 5: حامل العينة المواصفات. (أ) نموذج مكونات حامل: طبق ومبومو اﻷكريليك (1)؛ (2) الصفيحة القاعدية الألومنيوم؛ (3) عقد مسامير؛ (4) سيليكون الدائري؛ (5) ساترة. (ب) تجميع تماما صاحب العينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. إعداد المجهر.
    1. قم بتشغيل الليزر الإضاءة إيسكات وإضاءة ساطعة-الميدان/الأسفار الصمام والكاميرات واقتناء جهاز الكمبيوتر/البرامج. كتلة شعاع الليزر في موقف قبل الهدف.
    2. التأكد من أن 100 X/1.46 غ الهدف النظيف. إذا لم يكن الأمر كذلك، استخدم عدسة تنظيف الإيثانول ومناديل لتنظيف الهدف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    3. تطبيق قطره نفط الانغماس في المجهر والهدف.
    4. اتخاذ صاحب العينة (تجميعها في القسم 2-2) وجبل بعناية على مرحلة بيزو المجهر إيست حيث أنه يتم توسيط ساترة عينة على هدف المجهر. أن اليقظة والحذر حتى لا تتعرض للضرر العدسة الهدف. ربط الوحدة إلى positioner كهرضغطية مع مسامير الإبهام مع ضمان الشركة المصنعة المحددة عدم تجاوز أقصى عزم الدوران.
    5. إضافة 1 مل من الفحص المجهري الأسهم المتوسطة (أعدت في الفرع 2-1-) إلى ومبومو.
    6. إضافة 2 قطرات وصمة يوديد propidium إلى المتوسط كخلية موت علامة16،22.
    7. إلغاء حظر الليزر وجلب النظام إلى التركيز. أولاً، تحقق من أن الهدف هو وضع في المسافة الصحيحة من ساترة بتكرار الخطوات 1.2.3. -1-2-5. (الشكل 2). ثم، تهذيب التركيز مع محور ع المرحلة بيزو.
    8. تأكد من أن يتم تعيين كافة الإعدادات لمصادر الضوء، والكاميرات، والبرامج بشكل صحيح. وهذا يشمل المعلمات مثل طاقة الليزر، وكثافة الصمام، معدلات الإطار الكاميرا، ومرات التعرض الكاميرا أو برامج حفظ مسارات.
      ملاحظة: حفظ ملفات الفيديو في إطار ارتفاع معدلات يمكن أن تنتج أحجام الملفات الكبيرة. ضمان ما يكفي من المساحة الحرة على القرص على جهاز الكمبيوتر.
    9. كتلة شعاع الليزر مرة أخرى. المجهر جاهز الآن لتجربة.
  2. إعداد الخلايا.
    ملاحظة: Laz388 خلايا20 تستزرع في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين (FCS)، والأحماض الأمينية، بيروفات، والمضادات الحيوية. الخلايا هي المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 وتقسيم وزودت متوسطة جديدة كل 2-3 أيام23.
    1. تأخذ قارورة ثقافة الخليوي من الحاضنة ونضح المتوسطة التي تحتوي على حوالي 1 × 106 خلايا. لتحديد وحدة التخزين الصحيحة، قياس تركيز ثقافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير.
    2. مزيج الحل خلية مع 10 مل متوسط RPMI 1640 في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي العينة على 300 غرام x لمدة 7 دقائق.
    3. استخراج وتجاهل المادة طافية مع ضمان بقاء بيليه تتركز الخلايا دون عائق بعناية.
    4. كرر الخطوات 2.4.2. -2.4.3. مع مركزة بيليه من الخلايا.
    5. تعليق إعادة الخلايا في 0.5 مل مجهرية الأسهم المتوسطة (أعدت في الفرع 2-1-) واستخدامها فورا في تجربة.

3-الفحص المجهري "خلايا إفراز" إيست

  1. ضمان أن يتم حظر شعاع الليزر لمنع الخلايا من التعرض مباشرة لضوء الليزر إيست.
  2. حقن الخلايا ومبومو عينة.
    1. حقن حوالي 3 ميليلتر خلية العينة (المعدة في القسم 2.4.) قليلاً قبالة مركز ومبومو عينة. اللمس بلطف نصيحة ماصة ساترة وحقن ببطء في حل الخلية. السماح للخلايا لتسوية على ساترة.
      ملاحظة: استخدم نصائح ماصة صغيرة الحجم (10 ميليلتر) أو نصائح هلام-تحميل طويلة ومرنة.
    2. ضمان أن كثافة الخلايا أمر أدناه حوالي 1 الخلية الواحدة 500 µm² حتى لا تتأثر قياسات خلية واحدة من خلايا متعددة في المنطقة المحيطة بالليزر إيست.
    3. وإذا كان العدد الخلايا منخفض جداً، كرر الخطوة 3.2.1. حتى يتوفر عدد كاف.
    4. إذا كان نطاق الخلايا كثيفة جداً، استخدام حقنه من حوالي 20 ميليلتر من المتوسطة مجهرية إضافية لتفريق الخلايا عبر ساترة.
  3. استخدام ميضعه بيزو، نقل العينة جانبياً لموقف خلية قريبة (حوالي 10 ميكرون) لمجال الرؤية إيست. تأكد من أن الخلية لا يدخل في مجال الرؤية إيست التعرض المباشر لضوء الليزر شمال البحر الأبيض المتوسط 445 قد تكون ضارة للخلية.
  4. استخدام صور مشرقة الميدانية والأسفار لتحديد موقع والتحقق من صلاحية للخلية25.
    ملاحظة: خلية قابلة للتطبيق بشكل دائري في صورة مشرقة الحقل ولا الفلورسنت، بينما يشار إلى موت الخلية بإشارات الأسفار القوى الناشئة عن وجود يوديد propidium داخل الخلية22.
  5. إلغاء حظر شعاع الليزر إيست والتأكد من أن السطح ساترة لا يزال في التركيز. أرفق الجدول العزلة للحد من الانجراف واقتران الصوتية من محيط المحيط.
    ملاحظة: يتم هذا الأخير مع الستائر الثقيلة الضوئية أو لوحات اﻷكريليك المحيطة بالجدول البصرية.
  6. بدء القياس بجلب الصور من الكاميرات إيسكات ومشرق الميدانية، والأسفار. أتمتة والتحكم في العملية من خلال برامج تحقيق أقصى قدر من الكفاءة التجريبية. فحص دوري لبقاء الخلية وتركيز النظام.
    ملاحظة: اعتماداً على كثافة الليزر، والمكونات البصرية، والتعرض الوقت إعدادات الكاميرا، قد تتداخل الليزر إيست مع الكاميرا الأسفار. إذا كان هذا السلوك هو ملاحظة، النظر في الشدات الليزر إيست مؤقتاً أثناء الأسفار صورة التملك.

4. تحليل البيانات

ملاحظة: البيانات التجريبية أصلاً صاخبة، وصور إيست، لا تختلف. وهناك عدة مصادر للضوضاء في قياس إيست نموذجية، بما في ذلك التشوهات واجهة الموجه في الحادث من مصدر الضوء، وخشونة السطح ساترة، والضوضاء الكاميرا. ويعرض الفرع الوارد أدناه بعض الطرق التي يتم تدارك هذه المصادر الضوضاء عن طريق تجهيز آخر. بالإضافة إلى ذلك، القلاقل الميكانيكية الأفقي للإعداد يؤدي إلى بيانات صاخبة ويجب معالجتها وفقا لذلك، كما هو موضح في المقطع "مناقشة" أدناه. وتجري التحليلات التي وصفت مع البرامج النصية المخصصة MATLAB.

  1. تقليل الضوضاء الكاميرا بتصفية البيانات الخام مع عامل تصفية فورييه ثنائي الأبعاد التي تستثني الترددات المكانية العالية. حجم عامل التصفية تحتاج إلى تعديلها لتناسب تكوين تجريبية محددة (معظمهم يحدده الفتحة العددية للنظام).
    ملاحظة: ملامح الصورة بأعلى الترددات المكانية من النظام البصري تأتي من مصادر خارجية (مثل الضوضاء القراءة الكاميرا) ويمكن إهمال.
  2. تحويل الصور من الكاميرا الخام التهم إلى التباين إيست.
    ملاحظة: إشارة الكشف عنها بواسطة الكاميرا Equation 13 . يعرف التباين إيسكات Equation 14 حيث Equation 15 هو كثافة الضوء الإشارة، في هذه الحالة الجزء الذي تعكسه ساترة، و Equation 16 هو التدخل بين Equation 15 وكثافة متفرقة (Equation 17).
    1. فصل الإشارة إلى Equation 16 و Equation 15 بحساب الوسط الزماني إطارات خاصة فيها جسيمات الفائدة ليست موجودة. الصورة الناتجة توفر إشارة مرجعية Equation 15 .
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن إجراء خطوة طرح خلفية نشط كما هو موضح في المناقشة الواردة أدناه.
    2. حساب التباين استناداً إلى Equation 18 12،،من1416.
  3. إنشاء صورة تفاضلية متداول بطرح كل إطار على التوالي من خلفه.
    ملاحظة: الإشارات المتبقية من خشونة السطح من ساترة وفعالية إزالة التشوهات واجهة الموجه في هذه الخطوة كما ثابتة داخل إطارات متتالية. الفرق المتداول يزيل هذه الإشارات المتبقية، تاركاً فقط روابط البروتين التي تحدث من إطار واحد إلى التالي. مفيد هذا الطرح خلفية حيوية كما أنها ليست حساسة للأجل عينة الانجرافات.
  4. تطبيق خوارزمية ذروة تسعى لكشف وفهرسة الجزيئات واحدة لكل إطار وتحديد التباين المحددة والموقف.
  5. استخدام المعلومات التي تم جمعها في الخطوة 4، 4 لإنشاء رسوم بيانية للبروتين ربط أحداث وتتعلق تناقضات المستخرجة إلى كتلة البروتين من خلال منحنى معايرة تم تجميعها من البروتين المعروفة عينات14،24.

Representative Results

ويبين الشكل 4aتخطيطي مجهر إيست. وترد في الشكل 4 باءو جيم 4 د 4، على التوالي16مشرق الميدان الممثل، والأسفار، والصور إيسكات الخام. الرقم 4e و 4f إظهار نتائج إزالة الخلفية وتجهيز آخر التفاضلية؛ اثنين من البروتينات الممتزة مرئية كالبقع حيود محدودة في الشكل 4f. ويبين الشكل 6 رسماً بيانيا للبروتينات المكتشفة على مدى 125 s. تم الحصول على هذه البيانات عن طريق تطبيق خوارزمية البحث عن الذروة للصور التي تم التقاطها عد أحداث الربط والكتالوج على النقيض16. تم الكشف عن عدد إجمالي من البروتينات 503.

يتم تحديد الأنواع التالية، ويفرز مقارنة القياسات المرجعية التي تقوم على الحلول البروتين المنقي، أو من خلال قياسات إضافية مع الأسطح الزجاجية فونكتيوناليزيد14،16. ومن ثم، تصور البيانات إيست، مباشرة ديناميات إفراز الخلوية على مقياس سوبسيكوند16. على سبيل مثال، وجدنا سابقا أن الأجسام المضادة مفتش جزءا رئيسيا من سيكريتومي Laz388 وتم إصدارها من الخلية بمعدل ca. الجزيئات 100 في الثانية16. بالإضافة إلى ذلك، يتم يفرزها الجزيئات الأخرى التي تغطي مجموعة من 100 كاتشين-1000 كاتشين الخلايا16. وصف الأسلوب يمكن كذلك العاملين مثلاً، للتحقيق في التدرج التركز المكاني من إفرازات المحيطة خلية16، أو لتحديد ديناميات الزمنية لتحلل الخلوية16.

Figure 6
رقم 6: القياس الكمي للبروتينات يفرز من خلية واحدة Laz388. ويبين الرسم البياني البروتينات المكتشفة خلال فترة زمنية من 125 التباين س. القيم التي تراكمت في 1 × 10-4 تباين صناديق (أشرطة زرقاء). مجموع البروتينات الفردية 503 أحصى خلال هذا القياس. وتكررت هذه التجربة 10 مرات مع نتائج مماثلة. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ماكدونالد، عضو البرلمان وآخرون 16-الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

أحد الجوانب الأكثر أهمية للحصول على بيانات مفيدة إيسكات هو القدرة على العثور على الموضع التنسيق الصحيح في السطح ساترة، وعلاوة على ذلك، لشغل هذا المنصب لفترات طويلة من الزمن. عدم القيام بذلك سيؤدي إلى توسيع بسفس وإشارات ضعيفة إيست والقطع الأثرية المرتبطة بالانجراف في تحليل ديناميات. كما تبين أن إيجاد المستوى البؤري في ساترة نظيفة، والعارية السطح ليس مهمة سهلة كما السمات السطحية غير مرئية على خلفية شعاع مرجع كبير (انظر الشكل 4 د).

صور إيست الخام هي غالباً ما تحجب الإشارات الخلفية التي تنشأ من الشوائب واجهة الموجه في مصدر الإثارة، ويمكن أن تعوق قدرة المرء على العثور على الطائرة التصوير الصحيح. الطرح واجهة الموجه النشط طريقة مفيدة للتحايل على هذه المشكلة ورصد تركيز إيست في وقت لاحق أثناء قياس16. إحدى الطرق لتحقيق ذلك من خلال تعديل العينة المكانية. وباختصار، ينطبق مولد دالة موجه مربعة 50 هرتز إلى منفذ التحكم الخارجي المرحلة بيزو، مما أدى تعديل عينة مكانية في تواتر التطبيقية (290 نانومتر السعة) إلى. يتم تشغيل الكاميرا متزامن المقتنيات من نفس المصدر، وعند الجمع بينها ومن خلال التقيد بالمبادئ، النتيجة في14،صورة واجهة الموجه تعويض16. عادة ما يظهر الصورة الناتجة خشونة السطح من ساترة (4e الشكل). ميزات الصغيرة المتبقية على الزجاج بعد التنظيف يمكن استخدامها لإحضار المجهر إلى التركيز. قد يتم تغيير المعلمات المستخدمة لهذه الخطوة الطرح الخلفية نشط وفقا لمعدل الإطار، زمن التعرض، أو الأجهزة.

كما سبقت الإشارة إلى ذلك، ينصح باستخدام مقسم شعاع عالية الجودة في الإعداد إيست (الخطوة 1.2.1.)، كالتصوير المصنوعات اليدوية مثل الظلال أو التدخل الناجمة عن شق شعاع مستو رفيع سوف تؤثر على الصورة وتخل القياس. يبين الشكل 7 مقارنة بين الخائن شعاع عالية الجودة ومنخفضة الجودة. إظهار كل الصور إيست الخام في نفس المنطقة على ساترة التي تحتوي على بعض الجزيئات المتبقية. تم استخدام نفس الإعداد إيست لالتقاط الصور على حد سواء، جرى تبادل فقط شعاع التقسيم. يظهر الشكل 7a الصورة تشكلت في الكاميرا باستخدام أكثر سمكا (5 ملم)، الفاصل الحزم المغلفة AR، ومثبتة. نظراً لتصميم ويدجيد، الشعاع المنعكس من السطح الخلفي للتقسيم شعاع مواز المضادة لانعكاس الناشئة عن السطح الأمامي ولم يدخل الهدف. يحدث لا تدخل المصنوعات اليدوية. 7b الرقم يظهر نفس الحقل للعرض على العينة ولكن هذه المرة استخدمت أرق الخائن شعاع مستو (1 مم). تأملات اثنين من السطوح الأمامية والخلفية للتقسيم شعاع مواز وتنتشر إلى الكاميرا. المصنوعات اليدوية التدخل تكون مرئية بوضوح.

Figure 7
رقم 7: المقارنة بين الصور إيست المنتجة مع شق شعاع عالية ومنخفضة الجودة- (أ) الصورة إيست الخام الناتجة عن طريق استخدام المقسم شعاع سميكة ع المغلفة ومثبتة 5 ملم. (ب) صورة إيست الخام الناتجة من نفس المنطقة باستخدام مقسم شعاع مستو سميكة 1 مم. وقد شق شعاع كلا بنفس نسبة تقسيم (انعكاس 50%، نقل 50%). ولوحظت تدخل التحف الفنية الناشئة عن تأملات فريسنل وضوح في الصورة المنتجة مع التقسيم شعاع مستو سميكة 1 مم. تغيير حجم أشرطة: 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في هذا البروتوكول يصف لنا مخطط إضاءة واسع المجال إيست كما أنها سريعة وسهلة لتحقيق ويسمح للاستشعار موازية على مساحة كبيرة14. نهج مشترك آخر هو استخدام انحراف البصرية أكوستو (أودس) ومسح شعاع [كنفوكل] عبر ال12،عينة17. هذا النهج يتجنب الحاجة إلى وافيفرونتس عالية الجودة ولكن تجريبيا أكثر تعقيداً من تصوير واسع المجال التقليدي. وعلاوة على ذلك، يحد من أودس سرعة إنارة [كنفوكل]. استناداً إلى المعلمات التجريبية المطلوبة، يمكن، من حيث المبدأ، تستخدم أنظمة الإضاءة [كنفوكل] أو واسع المجال أما للكشف عن البروتينات وحيدة ويفرز من الخلايا الحية.

كما ورد في البروتوكول، من الضروري التقليل من تقلبات الميكانيكية الأفقي في المرحلة من المجهر. يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في إطارات الكاميرا على التوالي حتى نانومتر الانحرافات في موقف العينة والحث على الضوضاء الدخيلة الهامة في الصورة التفاضلية. ولذلك يوصي باستخدام مرحلة مجهر مستقرة ميكانيكيا وثُبِّط جدول ضوئية (الخطوة 1.1.1.) وتغطية الإعداد مع الستائر الضوئية أو لوحات خلال تجربة (الخطوة 3.5.).

يمكن أيضا النظر في مخطط تركيز نشط لتحقيق استقرار للقياسات الطويلة الأجل. في هذا النهج، تدمج المجهر في ترتيب مجموع التأمل داخلي (TIR) ليزر ثانية، وتصويرها في وقت لاحق على الضوئي رباعي. ترجمة التغييرات في التركيز للنظام إلى تشريد الأفقي لليزر تير بقعة على صمام رباعي، التي يمكن استخدامها في حلقة التغذية مرتدة نشط للتحكم في محور ع المرحلة بيزو26. وهكذا يتم القضاء على آثار الانحراف الرأسي طويلة الأجل.

يمكن تطبيق العديد من التعديلات وملحقات لهذه التقنية المقدمة لتلبية احتياجات محددة تجريبية. على سبيل المثال، تتوفر حاضنات المرحلة مجهر التجارية سهولة يمكن أن تدمج في المجهر إيسكات للتصوير الطويلة الأجل للخلايا. يمكن أيضا تنفيذ تقنيات أخرى لتكملة التصوير إيست، مثل [كنفوكل] أو النقل البري الدولي الفلورية ميكروسكوبيس17. للتكيف على النظام قيد الدراسة، إفراز إيست قياسات يمكن الاضطلاع في الوسائط المحمولة الأخرى مثل دميم أو دببس، ومع ذلك، أحمر الفينول مؤشر الرقم الهيدروجيني ينبغي تجنب كما أنها يمكن أن تخل بهذه التجربة بسبب امتصاص ضوء الليزر. بالإضافة إلى ذلك، ملاحق مثل مصل العجل الجنين (FCS) أو الصفائح الدموية البشرية ليستي (hPL) تحتوي على البروتينات التي قد تتداخل مع الكشف عن إيست. اعتماداً على حساسية المرجوة من هذه التجربة، ينبغي أن تستبعد هذه المكملات من المتوسطة مجهرية.

إيسكات يعتمد على قدرة أكثر للضوء المبعثر – خاصية جوهرية لجميع البروتينات – وهو بالتالي غير محدد أصلاً. ومع ذلك، بعض درجة التحديد الممكن كمقياس إشارات إيست خطيا مع البروتين الشامل14،،من2728. وهذا يسمح لمعايرة نظام إيست باستخدام عينات البروتين القياسية، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) والفيبرينوجين14،،من2728. وفي الواقع، ومؤخرا جداً، الشباب et al. 28 قد مدد في أعمال بيلياريك & ساندوغدار14 وأظهرت أن إيست يمكن استخدامها لتحديد الوزن الجزيئي للبروتينات صغيرة مثل ستريبتافيدين (53 كاتشين) بقرار جماعي من 19 كاتشين ودقة كاتشين حوالي 5. يمكن أن تكمل النهج التقليدية عدة أخرى إيست بتوفير مستوى إضافي من خصوصية. كمثال، فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA)، و/أو غيرها من التعديلات السطحية، تقييد البروتين ربط أحداث بحيث فقط البروتين المستهدف هو الكشف عن16.

في هذا البروتوكول، وصفت لنا كيف يمكن استخدام الفحص المجهري إيست للتحقيق في الإفرازات الخلوية على مستوى البروتين وحيد مع الأزمنة سوبسيكوند16. التقنية عامة ويمكن تنفيذها على أي مجهر التجارية أو الصنع. على عكس النهج fluorescence جزيء واحد، الأسلوب لا تعاني من فوتوبليتشينج أو وامض الآثار ولكن لا يزال يحقق حساسية البروتين وحيد. هذه الميزات تجعل إيست أداة قوية في مجال بيوسينسينج والفحص المجهري. التطبيقات المستقبلية ستركز على توضيح التفاعلات الخلوية المعقدة مثل استجابة مناعية للتحفيز أو الاتصالات الخلوية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل تدعمها جمعية ماكس بلانك وألكسندر-فون-هامبولت الأستاذية الأوقيانوغرافية ألماني (CRC 1181). ونحن نشكر شافر ستيفاني في ارلنجن Universitätsklinikum لتوفير خلايا Laz388 والمناقشات المفيدة. ونشكر إيهلوف سيمون وشواب مكسيم في مكتبة لتقديم الدعم التقني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Item/Device
100x / 1.46 NA objective Zeiss 420792-9800-000 alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective Leica 566049 N Plan
Piezo Stage PI P-517k020 3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm) Lasertack PD-01236
Optics/Optomechanics Thorlabs/Newport - lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole Thorlabs P30H
LED light source Thorlabs MCWHL5
Shortpass filter (580 nm) Omega Optical 580SP to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm) Thorlabs FEL0500 to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter Newport 20Q20BS.1
Economy beam splitter Thorlabs EBS1 used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter Thorlabs BSW26 used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm) Edmund Optics 66249
8R/92T beam splitter Thorlabs BP108
CMOS camera Photonfocus MV1-D1024E-160-CL for iSCAT aquisition
CMOS cameras Mightex SCE-B013-U for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm) Thorlabs FELH0600
Computer Fujitsu Siemens  - Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software LabVIEW - LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software Matlab - Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner Diener Diener pico
Incubator Binder Model CB
Centrifuge Eppendorf 5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium Gibco 11835063 without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M) Sigma Aldrich 59205C
Cover slides Marienfeld 107052
Glass bottom culture dishes ibidi 81158
Fluorescent Microspheres Invitrogen F8821 used for calibration
Immersol immersion oil Zeiss 444960
Propidium iodide stain Invitrogen R37108
Small pipette tips Eppendorf 30075005
Flexible pipette tips Eppendorf 5242956003
Ethanol, 99.8% Fisher Scientific E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets Sigma Aldrich 221465 for preparing 0.2M NaOH solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hathout, Y. Approaches to the study of the cell secretome. Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).
  2. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).
  3. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).
  4. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
  5. MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).
  6. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).
  7. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  8. Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. Optical biosensors. Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).
  9. Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity. Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).
  10. Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod. Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).
  11. Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images. eLife. 6, e25648 (2017).
  12. Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy. Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).
  13. Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
  14. Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
  15. Roux, K. H. Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy. International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).
  16. McDonald, M. P., et al. Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity. Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).
  17. Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
  18. Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
  19. Spindler, S., et al. Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).
  20. Lazarus, H., et al. Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic ("null" cell) leukemia. Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).
  21. Mackensen, A., et al. Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma. Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).
  22. Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).
  23. Freshney, R. I. Primary Culture. Culture of Animal Cells. , (2005).
  24. Dahmardeh, M., et al. Unpublished data. , (2018).
  25. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).
  26. Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy. Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).
  27. Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins. Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).
  28. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).

Tags

الهندسة، العدد 141، إيست، إفراز خالية من التسمية، البروتين وحيد، والهاتف الخلوي، والتصوير، وتناثر، حيوية، في الوقت الحقيقي
خالية من تسمية "التصوير من واحد البروتينات ويفرز" من "الخلايا الحية" عبر إيست المجهري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P.,… More

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P., König, K., Aigner, M., Mackensen, A., Sandoghdar, V. Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58486, doi:10.3791/58486 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter