Vi presenterar ett protokoll för realtid optisk detektion av enstaka omärkt proteiner när de utsöndras från levande celler. Detta är baserat på interferometrisk spridning (iSCAT) mikroskopi, som kan tillämpas på en mängd olika biologiska system och konfigurationer.
Vi visar interferometrisk spridning (iSCAT) mikroskopi, en metod som kan upptäcka enstaka omärkt proteiner utsöndras från enskilda levande celler i realtid. I detta protokoll täcker vi de grundläggande stegen för att förverkliga ett iSCAT Mikroskop och komplettera med ytterligare tänkbar kanaler att övervaka livskraften i en cell under studien. Efter detta använder vi metoden för realtid upptäcka enstaka proteiner som de utsöndras från en levande cell som vi demonstrera med en förevigade B-cell linje (Laz388). Nödvändiga åtgärder om utarbetandet av Mikroskop och prov samt analys av de registrerade uppgifterna diskuteras. Video protokollet visar att iSCAT mikroskopi erbjuder en enkel metod för att studera sekretion på singel-molekyl nivå.
Utsöndrade proteiner spelar en betydande roll i olika fysiologiska processer1. På grund av detta studeras de rutinmässigt som en kollektiv ensemble (proteomik) eller som enskilda enheter2,3. Proteomik undersöker traditionellt hela den uppsättning av proteiner förekommer i ett visst biologiska system genom t.ex. enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), flödescytometri eller masspektrometri4,5, 6. Enstaka proteiner, däremot, upptäcks vanligen med hjälp av olika tekniker som baseras på fluorescens7,8, plasmonik9,10eller kryogen elektron11 microscopies. Alla dessa tekniker använder komplexa instrument, märkning eller båda och saknar ofta dynamics information som de levererar endast långsiktig information om systemet under studien.
Här använder vi iSCAT12,13 mikroskopi till sense enskilda sekretoriska proteiner med sub sekund temporal upplösning14. Ännu viktigare, identifierar tekniken svaga spridda signalen inneboende till varje protein12,14. Mängden ljus som en liten bioparticle skingrar skalor med dess polariserbarheten. Antar att formen av ett protein kan approximeras med en effektiv spridning sfär14,15,16, samt olika proteiner har mycket liknande refractive index, uppmätta signalen kan vara direkt ansluten till molekylvikt (MW) av proteinet. Empiriska kalibrering av iSCAT kontrast jämfört med molekylvikt av referensmätningar gör att man kan särskilja proteiner av olika storlekar. iSCAT experiment kan lätt kompletteras med fluorescence mikroskopi17,18, immunosorbent reagenser, samt fluorescerande eller ytspridning etiketter för en specifik detektion av något protein intresse14 , 17 , 19.
I princip fungerar iSCAT genom att förstärka en proteinets svag spritt ljus via interferometrisk blandning med en sekundär referens våg. Upptäckta intensiteten () i en iSCAT Mikroskop beskrivs av
där är incident intensiteten, är en koefficient för bidrag av referens wave, betecknar scattering styrkan i nano-objektet under studien, och är fasförskjutning mellan utspridda och referens Waves14. Antingen den överförda eller back-reflekteras infallande som ljus vanligtvis används som en referens våg, där i varje fall står för den transmissivitet eller reflektivitet på prov avdelningen, respektive. Termen är proportionell mot proteinets spridning cross avsnitt och kan försummas jämfört med cross termen. Därigenom, för fullständig destruktiv interferens, upptäckta ljuset ges av där är referens intensiteten och är störningar intensiteten.
iSCAT mikroskopi erbjuder en utmärkt metod för att studera biologiska processer på singel-molekyl nivå. Som ett exempel, vi undersöker Laz388 celler — en Epstein – Barr virus (EBV) omvandlas B-lymfocyter cell linje20,21 — som de utsöndrar proteiner som IgG antikroppar16. Men metoden är generell och kan användas på en mängd andra biologiska system. iSCAT är till sin natur ospecifika och kan upptäcka något protein eller nanopartiklar eller det kan utökas med gemensamma ytan funktionalisering metoder för specifika eller multiplexade detektion. Dess enkelhet och förmågan att kombineras med andra optiska tekniker, såsom fluorescensmikroskopi, gör iSCAT ett värdefullt kompletterande verktyg i cellbiologi.
En av de viktigaste aspekterna att erhålla användbara iSCAT data är förmågan att hitta rätt fokus position på täckglas ytan, och dessutom att hålla denna position för långa tidsperioder. Underlåta att göra detta kommer att resultera i breddad vävda, svag iSCAT signaler och drift-associerade artefakter i dynamics analyser. Det visar sig att hitta fokalplanet på en ren, bare täckglas yta inte är en lätt uppgift som surface-funktioner inte visas mot stora referens beam bakgrund (se figur 4 d).
RAW iSCAT bilder är ofta skyms av bakgrunden signaler som uppstår från wavefront föroreningar i exciteringskälla och kan hindra en förmåga att hitta den rätta bildplanen. Aktiva wavefront subtraktion är ett användbart sätt att kringgå problemet och därefter övervaka iSCAT fokus under en mätning16. Ett sätt att åstadkomma detta är genom rumsliga prov modulering. I korthet gäller en funktionsgenerator en 50 Hz fyrkantsvåg hamnen extern kontroll av piezo scenen, vilket resulterar i en rumslig prov modulering i tillämpad frekvens (290 nm amplitud). Synkron kamera förvärv utlöses från samma källa, och, när de kombineras genom inlåsning principer, resultera i en wavefront-kompenseras bild14,16. Den resulterande bilden visar vanligtvis ytfinheten av täckglaset (figur 4e). Små funktioner kvar på glaset efter rengöring kan användas för att föra mikroskopet i fokus. Parametrar som används för detta aktiva bakgrund subtraktion steg kan ändras enligt den bildhastighet, exponeringstid eller hårdvara.
Som nämnts ovan, rekommenderas användning av en hög kvalitet stråldelare i iSCAT inställningar (steg 1.2.1.), som imaging artefakter som spökbilder eller störningar som följd av tunna plana beam splitters kommer att påverka bilden och stör mätningen. Figur 7 visar en jämförelse mellan en hög kvalitet och låg kvalitet stråldelare. Både rå iSCAT bilder visar samma område på den täckglas som innehåller vissa kvarvarande partiklar. Samma iSCAT setup användes för att fånga båda bilderna, bara stråldelare utbyttes. Figur 7a visar bilden bildas på kameran med hjälp av en tjockare (5 mm), AR-belagda och inklämd stråldelare. Tack vare den inklämd designen, den reflekterade strålen från bakre ytan av stråldelare är anti parallell till reflektion som härrör från den främre ytan och går inte in i målet. Inga störningar artefakter uppstår. Figur 7b visar samma synfält på prov men denna gång en tunnare (1 mm) planar stråldelare används. Två reflektioner från främre och bakre ytor av stråldelare är parallella och sprids till kameran. Störningar artefakter syns tydligt.
Figur 7: jämförelse av iSCAT bilder produceras med hög – och låg-kvalitet beam splitters. (a) resulterande raw iSCAT bild av användning av en 5 mm tjock, AR-belagda och inklämd stråldelare. (b) resulterande raw iSCAT bild av samma område av användning av en 1 mm tjock planar stråldelare. Båda beam splitters har samma uppdelning förhållande (50% reflektion, 50% transmission). Störningar artefakter som härrör från Fresnel reflektioner observeras tydligt i den bild som produceras med 1 mm tjock planar stråldelare. Skala barer: 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
I detta protokoll beskriver vi ett wide-fältet belysning system för iSCAT eftersom det är snabbt, lätt att inse och möjliggör parallella avkänning över ett stort område14. En annan vanlig metod är att använda acousto-optic avvisare (utanordnarnas) och skanna en confocal balk över de prov12,17. Detta tillvägagångssätt undviker behovet av högkvalitativ wavefronts men är mer experimentellt komplex än konventionella wide-området imaging. Dessutom begränsas hastigheten på confocal belysning av utanordnarnas. Beroende på de önskade experimentella parametrarna, kan, antingen confocal eller wide-fältet belysning system i princip utnyttjas för att upptäcka enstaka proteiner utsöndras från levande celler.
Som diskuterades i hela protokollet, är det absolut nödvändigt att minimera laterala mekaniska svängningar i provet scenen av mikroskopet. Även nanometer avvikelser i position av provet kan leda till variationer i på varandra följande kamera ramar och framkalla betydande ovidkommande brus i bilden differential. Det rekommenderas därför att använda en mekaniskt stabil Mikroskop scenen och en dämpad optiska tabell (steg 1.1.1.) och att täcka setup med optisk gardiner eller paneler under ett experiment (steg 3.5.).
Ett system för stabilisering av fokus kan också övervägas för långtidsmätningar. I detta synsätt, är en andra laser införlivas i mikroskopet i en Totalreflexion (TIR) arrangemang och därefter avbildas på en kvadrant fotodiod. Förändringar i systemets fokus översätta till laterala förskjutningar av TIR-laser plats på quadrant dioden, som sedan kan användas i en aktiv feedbackloop för att styra z-axeln av piezo etapp26. Vertikala avdrift långtidseffekter elimineras därmed.
Flera ändringar och tillägg kan tillämpas på presenterade tekniken adress experimentella behov. Till exempel kommersiella Mikroskop scenen inkubatorer är tillgängliga som lätt skulle kunna införlivas i mikroskopet iSCAT för långsiktig avbildning av celler. Andra tekniker kan också genomföras för att komplettera iSCAT imaging, såsom confocal eller TIR fluorescens microscopies17. För att anpassa i systemet under studien, iSCAT sekretion mätningar kan utföras i andra cell medier såsom DMEM eller DPBS, dock bör den pH indikatorn fenolrött undvikas eftersom det kan störa experimentet på grund av absorptionen av laserljuset. Dessutom innehåller kompletterar som fetalt kalvserum (FCS) eller mänskliga blodplättar lysate (hPL) proteiner som kan interferera med iSCAT upptäckt. Beroende på önskad känslighet av experimentet, bör dessa tillskott uteslutas från mikroskopi medlet.
iSCAT är beroende av en analyts förmåga att scatter ljus – en egenskap som är inneboende till alla proteiner — och är därför till sin natur ospecifik. Viss grad av specificitet är dock möjligt som iSCAT signaler skala linjärt med protein massa14,27,28. Detta möjliggör kalibrering av ett iSCAT system med standard protein prover, såsom bovint serumalbumin (BSA) och fibrinogen14,27,28. I själva verket mycket nyligen, unga o.a. 28 har utökat för Piliarik & Sandoghdar14 arbete och har visat att iSCAT kan användas för att bestämma molekylvikten för proteiner så liten som streptividin (53 kDa) med en massa upplösning på 19 kDa och en noggrannhet på cirka 5 kDa. Flera konventionella metoder kan ytterligare komplettera iSCAT genom att ge en extra nivå av specificitet. Som ett exempel, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) eller andra ytmodifieringar, begränsa protein bindande händelser så att endast målproteinet är upptäckta16.
I detta protokoll beskrev vi hur iSCAT mikroskopi kan användas för att undersöka cellulära sekret på den enda proteinnivå med subsecond temporal upplösning16. Tekniken är generell och kan genomföras på någon kommersiell eller hembyggda Mikroskop. I motsats till singel-molekyl fluorescens metoder, metoden lider inte av fotoblekning eller blinkande effekter men det fortfarande uppnår single-protein känslighet. Dessa funktioner gör iSCAT ett kraftfullt verktyg i fältet biosensing och mikroskopi. Framtida tillämpningar kommer att fokusera på att belysa komplexa cellulära interaktioner såsom immunologiska reaktionen på ett stimulus eller cellulär kommunikation.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den Max Planck-sällskapet, en Alexander-von-Humboldt-professuren och den Deutsche Forschungsgemeinschafts (CRC 1181). Vi tackar Stefanie Schaffer på Universitätsklinikum Erlangen för att tillhandahålla Laz388 celler och användbar diskussioner. Vi tackar Simone Ihloff och Maksim Schwab på MPL för teknisk support.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |